一种丝状真菌基因组dna提取的破壁方法
【专利摘要】一种丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，采用多步离心及玻璃棒挤压进行破壁，具体依次经真菌培养，收集菌体，多步添加提取液，冻结，破除丝状菌体，收集基因组DNA溶液，沉淀基因组DNA的方法。该方法采用-20℃的普通冰箱和自制的玻璃棒，实验设备易得，减少了传统方法中对液氮的依赖，研钵研磨时的杂菌污染，且该方法操作方便、经济实惠，能方便、快捷地获得丝状真菌基因组DNA，可以推广使用。
【专利说明】—种丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因组提取的破壁方法，尤其是丝状真菌基因组提取过程必要的破壁方法。
【背景技术】
[0002]丝状真菌广泛存在于自然界中，并且具有多种多样的功能，因此丝状真菌的研究经久未衰，反而越来越引起研究者的关注。微生物研究的第一步就是进行物种鉴定，真菌的传统分类鉴定依据主要采用培养时的形态特征，而培养特征差异非常显著，从而影响分类的准确性。真菌的现代分类鉴定则是结合形态学、生理学以及DNA分子水平等多方面进行综合鉴定。DNA提取是分子水平鉴定的第一步，有关丝状真菌基因组DNA提取的方法有很多。有效地提取丝状真菌基因组的关键在于破坏丝状真菌细胞壁的程度。丝状真菌基因组DNA提取方法大体相似，差别主要在于采用什么方法破坏丝状真菌细胞壁。真菌细胞破壁的方法:1)经典的液氮研磨法。需要专用容器装载购置的液氮，并且在研钵中研磨需要较多的菌丝体，同时由于研钵的敞开面积较大容易引起杂菌污染；液氮容易冻伤皮肤，一些地方液氮不容易获得而受到限制。2)液氮冻融(和玻璃珠振荡)法。该方法使用液氮，增加了成本及设备要求。3)酶解法。用于丝状真菌破壁的酶比较昂贵，在处理大量样品时很不经济。4)化学试剂(氯化苄)法。化学试剂存在环保上的隐患。
[0003]为了得到高质量DNA而发展起来的方法一般耗时长，费用高，并需要一些特殊的设备，一般的生物学 实验室很难满足其要求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，能方便、快捷地破碎丝状真菌的细胞壁，采用常用的离心管和自制普通玻璃棒。采用该方法所获得的高分子量DNA用于PCR等分析，适用于进行分子生物学的研究。
[0005]本发明是这样实现上述目的的:一种丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，该方法包括以下步骤:
1)将丝状真菌接种于NBRIP(National Botanical Research Institute’s phosphatemedium)、土豆培养基液体培养基中进行培养；
2)将步骤I)中培养的丝状真菌用无菌牙签挑取置于离心管中离心，倒掉上清液，收集菌体，再将菌体与灭菌双蒸水混合菌丝后离心(12000 rpm, 10 min)，弃上清，保留真菌菌丝；
3)在步骤2)离心后的含菌丝体离心管中加入DNA提取缓冲液，混合菌体和提取缓冲
液；
4)将步骤3)处理得到的菌体立即放入-28'18°C冰箱中，放置广2 h冻结；
5)将步骤4)得到已经冻结的菌体，用灭菌的玻璃棒挤压破壁，重复步骤4)和步骤5)3~7次(冻结-玻璃棒破碎)，所述的玻璃棒手握端包裹10-15层灭菌脱脂纱布，方便用力、避免损伤手心；
6)将步骤5)中得到的菌体破碎液的一半转移到另一支离心管中，然后都置于65V恒温30 min，加入等体积的混合液I (苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1)，充分混匀，离心(12000 rpm, 10 min)，吸取600~700 u L上清液移入到另一支离心管中，加入等体积的混合液I I (氯仿:异戍醇=24:1),充分混匀，离心(12000 rpm, 10 min)；
7)将步骤6)得到的上清液移入到新的离心管中，并加入2.5倍体积-20 V预冻的无水乙醇，离心(12000 rpm, 10 min),弃上清,用75 %的酒精洗漆沉淀2次,挥干后得到基因组DNA可用于PCR扩增等，对于颜色很深难以用混合液去除颜色物质时，将基因组DNA沉淀后再用真菌提取试剂盒分离纯化。
[0006]本发明提供的一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，由于采用-20°C的普通冰箱和自制的玻璃棒，几乎所有微生物学实验室都有配置，避免了特殊设备的需求。不使用液氮可以减少对液氮来源的依赖，并减少了研钵研磨时的杂菌污染。该方法操作方便、经济实惠，能方便、快捷地获得丝状真菌基因组DNA，可以推广使用。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，该方法包括以下步骤:
1)丝状真菌培养:将丝状真菌A培养于NBRIP[ National Botanical ResearchInstitute，s phosphate medium (pH 7.0),每升含有:10 g glucose, 5 g Ca3 (PO4) 2, 5g MgCl2.6Η20, 0.25 g MgSO4 *7 H2O, 0.2 g KCl, 0.1 g (NH4)2SO4]培养基中，250 ml 的三角烧瓶装载50 ml液体培养基，28 V震动培养2天，再静止培养4天；
2)收集真菌菌丝体:用灭菌牙签挑取步骤I)中培养的真菌A置于1.5 ml的离心管中离心(12000 rpm, 10 min)，倒掉上清液，再用灭菌双蒸水混合菌丝后离心(12000 rpm, 10min),弃上清,保留真菌菌丝；
3)加提取液:加入DNA 提取缓冲液 500 u I [ 2% SDS, 1.4 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl(pH8.0),0.02 M EDTA ( ρΗ8.0)]，并用无菌牙签混合菌体和提取缓冲液;
4)冻结:将步骤3)处理得到的菌体立即放入-20°C冰箱中，放置2 h液体冻结；
5)破碎丝状菌体:用力将灭菌的玻璃棒(自制直径0.5mm，长度11 cm，手握端用10层灭菌脱脂纱布包裹，避免用力时损伤手心)挤压已经冻结的离心管内的菌体，反复4次(冻结-玻璃棒挤压破碎);
6)收集基因组DNA溶液:将步骤5)中得到的菌体破碎液的一半转移到另一支1.5 ml的离心管中，两支离心管同时置于65 0C恒温30 min，加入等体积的混合液I (苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1)，充分混匀，离心(12000 rpm, 10 min)，吸取600 u L上清液移入到同一支新的离心管中，加入等体积的混合液I I (氯仿:异戊醇=24:1)，充分混匀，离心(12000 rpm, 10 min)；
7)沉淀基因组DNA:将步骤6)得到的上清液移入到新的离心管中，并加入2.5倍体积-20 0C预冻的无水乙醇，离心(12000 rpm, 10 min)，去上清液，用75 %的酒精洗涤沉淀2次，挥干后得到基因组DNA ；
8)测序与分子鉴定: 将步骤7)得到的基因组DNA的ITS序列进行PCR扩增后测序，获得清晰的序列图谱达到520 bp,通过GenBank比对发现该真菌属于属，菌落形态与 Penicillium 属吻合，命名为产.sp.XXR-A, GenBank 登陆号:KF572125。
[0008]实施例2
一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，该方法包括以下步骤:
1)丝状真菌培养:将丝状真菌B培养于NBRIP[ National Botanical ResearchInstitute，s phosphate medium (pH 7.0),每升含有:10 g glucose, 5 g Ca3 (PO4) 2, 5g MgCl2.6Η20, 0.25 g MgSO4 *7 H2O, 0.2 g KCl, 0.1 g (NH4)2SO4]培养基中，250 ml 的三角烧瓶装载50 ml液体培养基，28 V震动培养2天，再静止培养6天；
2)收集真菌菌丝体:用灭菌牙签挑取步骤I)中培养的真菌B置于1.5 ml的离心管中离心(12000 rpm, 10 min)，倒掉上清液，再用灭菌双蒸水混合菌丝后离心(12000 rpm, 10min),弃上清,保留真菌菌丝；
3)加提取液:加入DNA 提取缓冲液 500 u I [ 2% SDS, 1.4 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl(pH8.0),0.02 M EDTA ( ρΗ8.0)]，并用无菌牙签混合菌体和提取缓冲液;
4)冻结:将步骤3)处理得到的菌体立即放入_28°C冰箱中，放置2h液体冻结；
5)破碎丝状菌体:用力将灭菌的玻璃棒(自制直径0.5 mm,长度12 cm，手握端用13层灭菌脱脂纱布包裹，避免用力时损伤手心)挤压已经冻结的离心管内的菌体，反复5次(冻结-玻璃棒挤压破碎);
6)收集基因组DNA溶液:将步骤5)中得到的菌体破碎液的一半转移到另一支1.5 ml的离心管中，两支离心管同`时置于65 0C恒温30 min，加入等体积的混合液I (苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1)，充分混匀，离心(12000 rpm, 10 min)，吸取700 u L上清液移入到同一支新的离心管中，加入等体积的混合液I I (氯仿:异戊醇=24:1)，充分混匀，离心(12000 rpm, 10 min)；
7)沉淀基因组DNA:将步骤6)得到的上清液移入到新的离心管中，并加入2.5倍体积-20 0C预冻的无水乙醇，离心(12000 rpm, 10 min)，去上清液，用75 %的酒精洗涤沉淀2次，挥干后得到基因组DNA ；
8)真菌基因组DNA提取试剂盒去除杂色:步骤7)得到的基因组DNA沉淀含有较深的黑色杂质，用真菌基因组DNA提取试剂盒(Biospin fungus genomic DNA extraction Kit)再次纯化；
9)测序与分子鉴定(破壁的有效性):将步骤8)得到的基因组DNA的ITS序列进行PCR扩增后测序,获得清晰的序列图谱达到560 bp以上,通过GenBank比对发现该真菌属于Aspergillus属，菌落形态与属吻合，命名为A sp.XXR-B, GenBank登陆号:KF572126。
[0009]实施例3
一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，该方法包括以下步骤:
1)丝状真菌培养:将丝状真菌C培养于土豆培养基(20%土豆，2%蔗糖)中，250 ml的三角烧瓶装载50 ml液体培养基，28 V震动培养I天，再静止培养6天；
2)收集真菌菌丝体:用灭菌牙签挑取步骤I)中培养的真菌C置于1.5 ml的离心管中离心(12000 rpm, 10 min)，倒掉上清液，再用灭菌双蒸水混合菌丝后离心(12000 rpm, 10min),弃上清,保留真菌菌丝；3)加提取液:加入DNA 提取缓冲液 500 u I [ 2% SDS, 1.4 M NaCl,0.2 M Tris-HCl(pH8.0),0.02 M EDTA ( ρΗ8.0)]，并用无菌牙签混合菌体和提取缓冲液;
4)冻结:将步骤3)处理得到的菌体立即放入-20°C冰箱中，放置2 h液体冻结；
5)破碎丝状菌体:用力将灭菌的玻璃棒(自制直径0.4 mm,长度12 cm，手握端用12层灭菌脱脂纱布包裹，避免用力时损伤手心)挤压已经冻结的离心管内的菌体，反复4次(冻结-玻璃棒挤压破碎);
6)收集基因组DNA溶液:将步骤5)中得到的菌体破碎液的一半转移到另一支1.5 ml的离心管中，两支离心管同时置于65 0C恒温30 min，加入等体积的混合液I (苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1)，充分混匀，离心(12000 rpm, 10 min)，吸取600 u L上清液移入到同一支新的离心管中，加入等体积的混合液I I (氯仿:异戊醇=24:1)，充分混匀，离心(12000 rpm, 10 min)；
7)沉淀基因组DNA:将步骤6)得到的上清液移入到新的离心管中，并加入2.5倍体积-20 0C预冻的无水乙醇，离心(12000 rpm, 10 min)，去上清液，用75 %的酒精洗涤沉淀2次，挥干后得到基因组DNA ；
8)测序与分子鉴定:将步骤7)得到的基因组DNA的ITS序列进行PCR扩增后测序，获得清晰的序列图谱达到580 bp以上,通过GenBank比对发现该真菌属于Trichoderma属，菌落形态与Trichoderma属 吻合，命名为T.sp.H09, GenBank登陆号:腿000038。
【权利要求】
1.一种丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，包括以下步骤， 1)培养:将丝状真菌接种于液体培养基中，25~30°C环境下，震动培养f2天，静止培养2~7天； 2)收集菌体:挑取丝状真菌菌丝置于离心管中离心,倒掉上清液,收集菌体,再将菌体与灭菌双蒸水混合菌丝后离心，弃上清，保留真菌菌丝； 3)加提取液:在步骤2)离心后的含菌丝体离心管中加入DNA提取缓冲液，混合菌体和提取缓冲液； 4)冻结:将步骤3)处理得到的菌体放入_28'18°C冰箱中，放置f 2 h冻结； 5)破碎丝状菌体:将步骤4)得到已经冻结的菌体，用灭菌的玻璃棒挤压破壁； 6)收集基因组DNA溶液:重复步骤4)和步骤5)3^7次后，将破壁后得到的菌体破碎液的一半转移到另一支离心管中，置于65 V恒温30 min，加入等体积的混合液I，充分混匀，离心，吸取60(T700 u L上清液移入到同一支的离心管中，同时加入等体积的混合液II，充分混匀，离心； 7)沉淀基因组DNA:将步骤6)得到的上清液移入到新的离心管中，并加入2.5倍体积-20 V预冻的无水乙醇，离心，去上清液，用75 %的酒精洗涤沉淀2次，挥干后得到丝状真菌基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于:步骤I)中，所述的液体培养基为 NBRIP (National Botanical Research Institute’s phosphatemedium)或土豆培养基。
3.根据权利要求2所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于:所述的NBRIP培养基每升含有:10 g C6H12O6, 5 g Ca3 (PO4)2,5 g MgCl2.6Η20，0.25 g MgSO4.7 H2O,0.2 g KCl, 0.1 g (NH4)2SO4,培养基pH为7.0~7.2 ;所述的土豆培养基含20% 土豆，2%蔗糖。
4.根据权利要求1所述的一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，其特征在于:步骤2)中，将收集的菌丝体用蒸馏水漂洗f 2次，以除去培养基及真菌的代谢产物。
5.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于:步骤5)中玻璃棒灭菌，手握端包裹10-15层灭菌脱脂纱布。
6.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于:步骤6)中，混合液I为V苯?:V氯仿:V异戊醇=25:24:1 ;混合液I I为V氯仿:V异戊醇=24:1。
7.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于:所述的离心速率为12000 rpm,离心时间为10 min。
【文档编号】C12N15/10GK103695413SQ201310713074
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】陈国华, 吴广, 陈汉臣, 王凤玲 申请人:三峡大学