预测强直性脊柱炎易感性的试剂和方法
【专利摘要】本发明公开了预测强直性脊柱炎易感性的试剂，属于医学生物【技术领域】。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的AIF1基因SNP位点的基因型，预测受试者对强直性脊柱炎的易感性。本发明的优点是：首次阐述了AIF1基因多态性位点与强直性脊柱炎的相关性，提供了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，该方法可用于强直性脊柱炎的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
【专利说明】预测强直性脊柱炎易感性的试剂和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及预测强直性脊柱炎易感性的试剂和方法，更具体的说是通过测定与AS相关基因AIFl的多态性预测受试者对于强直性脊柱炎的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是一种自身免疫性疾病，多发于16-40岁的青壮年，男女患病比例约为4~10:1。病变常首先发生于骶髂关节，少数重症患者表现为整个脊柱强直。此外，部分患者伴有不同程度的髋关节、眼、肺、心血管、肾等脊柱外病变。AS在白种人群中的发病率约为1%~3%，我国AS患病率约为0.2-0.6%，其中60%以上的患者伴有髋关节受累，致使20%以上AS患者残疾，炎症主要累及关节囊、肌腱和韧带的骨附着点，导致局部关节粘连强直，活动受限。临床上至今尚缺乏可明显缓解和控制疾病发展的药物。AS属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与免疫因素在AS发病中起主导作用，但确切的病因与发病机制仍不清楚。
[0003]目前进行AS遗传病因研究，多采用SNP作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1%为同型碱基之间的转换:如G/A或T/C，29.1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C (胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T (胸腺嘧啶)，SNP包含了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。
[0004]由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高(平均每Ikb就有I个)、代表性强(位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而`言)、易于自动化分析(因SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以“+ / 一或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。
[0005]1973年，Brewerton等首先发现了与AS强相关的人类白细胞抗原_B27(HLA_B27 )。随着研究的进展，与AS相关的其他易感基因如肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、白介素-1(IL-1)陆续被识别。
[0006]AIFl (allograft inflammatory factorl,同种异体移植炎症因子I)基因位于6q21.3，全长3038bp，其编码产物是一种蛋白质，该基因定位于人类白细胞抗原III区域，与免疫反应及自身性免疫疾病发生发展等密切相关。
[0007]本发明将研究AIFl基因SNP位点与AS的易感性关系。
【发明内容】
[0008]本发明的主要目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的方法。
[0009]本发明的第二个目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。
[0010]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0011]检测强直性脊柱炎易感性的核酸序列，为序列表SEQ ID N0.1所示碱基序列。其中字母“R”为AIFl基因启动子区31576265变异位点。图1为AIFl基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有4个外显子，31576265标在AIFl基因图中启动子区的相
应位置。
[0012]一种检测强制性脊柱炎易感性的方法，检测受试者AIFl基因启动子区31576265位点的基因型，基因型为AA时，受试者的易感性最低；携带G等位基因时，受试者的易感性升高。
[0013]一组检测强直性脊柱炎易感性的引物，引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ IDN0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。而且可以特异性地扩增出包含有SEQ ID N0.1所示序列中31576265位置的产物。
[0014]本发明提供了一种检测强直性脊柱炎易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增AIFl基因31576265位置的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分和含量如下:
[0015]一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，由以下试剂组成:
[0016](I) 10 μ LlOXPCR 缓冲液；
[0017](2 ) 2 μ LlOmMdNTP 混合液；
[0018](3) 2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ;
[0019](4) IyL上游引物F1，为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ;
[0020](5) IyL下游引物R1，为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ；
[0021](6)4yL限制性内切酶BamHl,浓度为15U/yL;
[0022](7) 6 μ LlOXK 反应缓冲液(K Buffer)
[0023](8) 124 μ L 纯水。
[0024]使用方法:
[0025](I) PCR扩增后酶切:通过PCR扩增AIFl基因的启动子区部分片段，制备混合液:第一阶段 PCR 反应:10 X PCR 反应缓冲液 I μ L，10mM/LdNTP0.2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L,10pM/L上游引物F10.1 μ L，10pM/L下游引物RI0.1 μ L，基因组DNAl μ L，加纯水至10 μ L。PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸12s，总共45个循环，72°C总延伸2min。取第一阶段PCR产物4 μ L作为酶切模板进行酶切反应。
[0026]第二阶段酶切反应:10ΧΚ反应缓冲液0.6yL，限制性内切酶BamHl (15U/yL)0.4 μ L，第一阶段PCR产物4 μ L，加纯水至10 μ L。酶切反应条件为30°C I小时至2小时。PCR前于每一体系中加入20 μ L的石蜡油，以防止液体挥发。
[0027](2)基因型判定:酶切产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察进行分型鉴定。
[0028]AIFl基因启动子区31576265多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。
[0029]本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如:体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含AIFl基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含AIFl基因变异点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。
[0030]在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据AIFl基因的突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定AIFl基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。
[0031]本发明的优点是:本发明首次阐明了 AIFl基因多态性位点与AS的相关性，提供了一种预测AS易感性的方法，该方法可用于AS的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
[0032]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步叙述，以便公众对
【发明内容】
有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为AIFl基因结构及31576265位置示意图
[0034]图2为AIFl基因变异位点经酶切方法的基因分型图
[0035]图3为AIFl基因变异位点的测序图
【具体实施方式】
[0036]用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下:
[0037]10XPCR 缓冲液:10mM Tris-HCI (pH=8.3), 500mM 氯化钾(KCl)，IOmM 氯化镁(MgCl2)70.01%(W/V)白明胶
[0038]dNTP:脱氧核苷三磷酸
[0039]EDTA:乙二胺四乙酸二钠
[0040]TE: IOmM Tris-HCl (pH=7.5)，ImM EDTA (pH=8.0)
[0041]实施例1:血液样本收集和基因组DNA的提取:
[0042]一.病例入选:
[0043]1.按纽约1984年的修订诊断标准入选病例，共选取来自宁夏地区无血缘关系的AS患者350例(年龄:8-71岁，平均27岁)，同地区的健康对照志愿者360例(年龄:18-21岁，平均19岁)。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》:人体医学研究的伦理原则。
[0044]二.根据下列方法，制备人基因组DNA。
[0045]1.在已标号的1.5mLEP管中加1000 μ L红细胞裂解液，后加入400 μ LEDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3-5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟；
[0046]2.13000rpm离心30秒后，除去上清液；
[0047]3.在所得沉淀中加480 μ L核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20 μ L蛋白酶K (用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65°C孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块);
[0048]4.拿出后降至室温，加300μ L蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；
[0049]5.将上清液移至新EP管中，加入670 μ L预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；
[0050]6.弃上清液并确保沉淀留在EP管中，加入670 μ L70%乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；
[0051]7.弃上清，使管内乙醇挥发干净；
[0052]8.加入TE溶液(400 μ L)，充分溶解，对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/ μ L，置于4°C备用，剩余基因组DNA置_20°C冰箱保存。
[0053]实施例2SNP的识别鉴定
[0054]本发明通过酶切产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察进行分型鉴定。
[0055]一.PCR-HRM弓丨物的确定
[0056]1.PCR-酶切引物的确定
[0057]从Genebank中查取31576265附近的DNA碱基序列(SEQ ID N0.1),引物设计在01igo7.0软件下完成。目的片段全长131bp。
`[0058]目的片段特异性引物序列如下:
[0059]Fl:5’ -GTTCTTCTCCCATTGTGATATTG-3’ (SEQ ID N0.2)
[0060]Rl:5，-GTCTTGATCTCCTGACCTCGGGAT-3，(SEQ ID N0.3)
[0061]2.PCR酶切反应体系及条件
[0062]通过PCR扩增AIFl基因启动子区部分片段，第一阶段PCR反应:10XPCR反应缓冲液 I μ L, 10mM/LdNTP0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，10pM/L 上游引物 F10.1 μ L, 10pM/L下游引物R10.1 μ L，基因组DNAl μ L，加纯水至10 μ L。PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸12s，总共45个循环，72°C总延伸2min。取第一阶段PCR产物4 μ L作为酶切模板进行酶切反应。
[0063]第二阶段酶切反应:10ΧΚ反应缓冲液0.6yL，限制性内切酶BamHl (15U/yL)0.4 μ L，第一阶段PCR产物4 μ L，加纯水至10 μ L。酶切反应条件为30°C I小时至2小时。PCR前于每一体系中加入20 μ L的石蜡油，以防止液体挥发。
[0064]3.8%聚丙烯酰胺凝胶电泳判定基因型
[0065]酶切产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，通过凝胶成像系统观察进行分型。图2为AIFl基因变异位点经酶切方法的基因分型图。
[0066]4.测序验证
[0067]从所得的不同基因型的个体中分别随机抽取3例样本进行测序验证。测序样本重新进行 PCR 扩增，测序引物序列为:F2:5’ -CACACTGCTCTCACATCAGG-3’ (SEQ ID N0.4),R2:5’-CGAGTAGCTGGGACTACAGG-3’ (SEQ ID N0.5)，扩增片段长 279bp。PCR 反应总体系为30 μ L，包含:基因组 DNA2 μ L, 10XPCRBuffer3 μ L, IOmMdNTP0.5 μ L, TaqDNA 聚合酶(5U/μ L) 0.5 μ L，上下游引物(IOpM/ μ L)各0.5 μ L，纯水补充至总体积30 μ L。PCR反应条件为:95°C预变性5min后进入主循环，95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，45个循环，72°C延伸2min。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。图3为AIFl基因变异位点的测序图。
[0068]实施例3基因SNP与强制性脊柱炎(AS)的相关性
[0069]一.统计方法:
[0070]运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。利用SPSS11.0软件中Pearson卡方检验计算AIFl基因31576265位置的等位基因、基因型在AS病例组与正常对照组间的分布频率，AS的患病风险OR值及其95%CI可信区间，以P〈0.05为差异显著性标准。
[0071]二.结果:AIF1基因31576265位置的基因型和等位基因频率在病例与对照组间的分布详见表1。
[0072]表1AIFl基因31576265位置的基因型和等位基因频率在病例对照组间的分布
【权利要求】
1.检测强直性脊柱炎易感性的核酸序列，其特征在于:为序列表SEQID N0.1所示碱基序列。
2.一种检测强制性脊柱炎易感性的方法，其特征在于:检测受试者AIFl基因启动子区31576265位点的基因型，基因型为AA时，受试者的易感性最低；携带G等位基因时，受试者的易感性升高。
3.—组检测强直性脊柱炎易感性的引物，其特征在于:引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID N0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。
4.一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成:
(1)10 μ LlO X PCR 缓冲液；
(2)2 μ LlOmMdNTP 混合液；
(3)2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ; (4)IyL上游引物F1，为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/yL； (5)IyL下游引物R1，为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/yL; (6)4“1^限制性内切酶8&111!11，浓度为15U/yL; (7)6 μ LlOXK反应缓冲液
(8)124 μ L 纯水。
5.AIFl基因启动子区31576265多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK103710446SQ201310712810
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】杨泽, 张玉荣, 赵承孝, 刘铭, 王建业, 史晓红, 魏东, 杨帆, 朱小泉, 周林, 张耀光, 王娜娜, 惠娟, 张政, 唐雷, 孙亮 申请人:卫生部北京医院