一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E、产品说明书和试验结果记录卡组成；使用本试剂盒，按本发明所提供的方法，可不通过纯培养直接检测出罗非鱼血液中是否携带无乳链球菌，并能对血液中无乳链球菌的数量进行半定量检测。
【专利说明】一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]罗非鱼是全球主要经济鱼类之一，具有生长快、抗病力与抗逆性强、肉质好、繁殖力强、适应性广以及群体产量高等一系列优点，现已成为南方各省出口型养殖规模最大的鱼类，产量占全世界的50%，罗非鱼产业对于增加就业机会、提高农民收入都有十分重要的意义。然而近年来，由于高密度饲养，种群退化，加上养殖水质、环境及气候恶化，各类病害时常大面积爆发，严重影响到罗非鱼产业的健康发展。2009~2013年，国内主要的罗非鱼养殖区爆发了非常严重的罗非鱼流行病，患病罗非鱼在水面离群独游，游姿失衡，眼球突出，被养殖户形象的称为“突眼病”。该病发病率一般达20%~30%，死亡率在95%以上。病原分析表明引起罗非鱼“突眼病”的病原为链球菌，主要为海豚链球菌印tococcusiniae)和无乳链球菌{Streptococcus agalactiae)。据统计，近几年因链球菌病导致罗非鱼产业的损失达20亿元，如何防治罗非鱼链球菌病已成为农业和渔业管理部门最为关注的问题。
[0003]无乳链球菌是罗非鱼链球菌病最主要的病原菌，在养殖过程中定期检测罗非鱼是否受到无乳链球菌的感染，是预防链球菌病的一种有效措施。目前已公开的专利和论文中，有使用分子诊断方法检测无乳链球菌的报道，这些方法虽然能够特异性的检测无乳链球菌，但有明显的缺点:(I)检出灵敏度低，多数情况只适用于纯培养后菌体的检测，无法做到免培养检测；(2)部分灵敏度高的检测方法，如LAMP法，只能定性判断出罗非鱼是否感染无乳链球菌，而对于感染程度，即罗非鱼体内无乳链球菌的含量无法进行检测。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是:提供一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，解决了上述现有技术的不足之处。
[0005]解决上述技术问题的技术方案是:一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和试剂E ；
所述的试剂A的组成成分为:引物Pls 0.4 μΜ;引物Pla 0.4 μ M ;DNA聚合酶0.1U/μ I ;dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP 各 500 μ M ；MgCl 3mM ；KC1 IOOmM, Tris-HCl (pH8.3) 20mM ；吐温 20 0.005% ;甘油 0.5% ；
所述的试剂B的组成成分为:引物P2s 0.4 μΜ;引物P2a 0.4 μ M ;DNA聚合酶0.1U/μ I ;dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP 各 500 μ M ；MgCl 3mM ；KC1 IOOmM, Tris-HCl (pH8.3) 20mM ；吐温 20 0.005% ;甘油 0.5% ；
所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%-0.5% ；
所述的试剂D为去离子水；所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为1 X 1O8拷贝/ml;
所述的试剂A中引物Pls的序列为:5’_ TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3’，引物Pla的序列为 5’ - CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3’ ；
所述的试剂B中引物P2s的序列为:5’_ ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG -3’，引物P2a的序列为 5’ - CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC -3’。
[0006]由于采用上述技术方案，本发明之一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，具有以下有益效果:
针对上述现有技术的情况，本发明公开了一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量的检测试剂盒。该试剂盒利用巢式PCR的方法对无乳链球菌特异基因cfb基因进行检测，大大提高了检测灵敏度。配合试剂盒中的血液抗凝剂，可不通过纯培养，以罗非鱼的血液为模板直接对无乳链球菌进行检测。对照标准反应结果，即可判断罗非鱼血液内无乳链球菌的含量。该方法可不通过纯培养而特异、快速检测罗非鱼血液是否携带无乳链球菌，并且可实现半定量检测，从而判断罗非鱼感染无乳链球菌的程度，为罗非鱼链球菌病的预防提供新的技术手段。
【具体实施方式】
[0007]一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E、产品说明书和试验结果记录卡；
所述的试剂A含有0.4 μΜ引物Pls、0.4 μ M引物Pla、0.1U/μ I DNA聚合酶、500 μ MdATP、500yM dCTP、500yM dTTP、500yM dGTP、3mM MgClUOOmM KCl、20mM Tris-HCl(pH^8.3)、0.005% 吐温 20 和 0.5% 甘油；
所述的试剂B含有0.4 μΜ引物P2s、0.4 μ M引物P2a、0.1U/μ I DNA聚合酶、500 μ MdATP、500yM dCTP、500yM dTTP、500yM dGTP、3mM MgClUOOmM KCl、20mM Tris-HCl(pH^8.3)、0.005% 吐温 20 和 0.5% 甘油；
所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%-0.5% ；
所述的试剂D为去离子水；
所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为I X IO8拷贝/ml;
所述的试剂A中引物Pls的序列为:5’_ TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3’，引物Pla的序列为 5’ - CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3’ ；
所述的试剂B中引物P2s的序列为:5’_ ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG -3’，引物P2a的序列为 5’ - CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC -3’。
[0008]一.本发明之一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒的使用方法:
1.绘制标准反应对照表:
1.1.第一轮PCR反应:
取一定量的试剂D和试剂E混合，配制成(6/?基因拷贝数分别为2 X 1O7拷贝/ml、2 X 1O6拷贝 /ml、2X105 拷贝 /ml、2X104 拷贝 /ml、2X103 拷贝 /ml、2X102 拷贝 /ml、0 拷贝 /ml 的Cfb基因溶液。
[0009]抽取健康罗非鱼新鲜血液，立即与试剂C按1:1的比例混合均匀。再与上述的c/办基因溶液分别等体积混合得到混合溶液。
[0010]分别吸取上述混合溶液I μ I作为模板，分别与12.5 μ I试剂A和11.5 μ I的去离子水混合，制成总体积为25 μ I的PCR反应液，进行第一轮PCR反应’反应条件为:
【权利要求】
1.一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和试剂E ； 所述的试剂A的组成成分为:引物Pls 0.4 μΜ;引物Pla 0.4 μ M ;DNA聚合酶0.1U/μ I ;dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP 各 500 μ M ；MgCl 3mM ；KC1 IOOmM, Tris-HCl (pH8.3) 20mM ；吐温 20 0.005% ;甘油 0.5% ； 所述的试剂B的组成成分为:引物P2s 0.4 μΜ;引物P2a 0.4 μ M ;DNA聚合酶0.1U/μ I ;dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP 各 500 μ M ；MgCl 3mM ；KC1 IOOmM, Tris-HCl (pH8.3) 20mM ；吐温 20 0.005% ;甘油 0.5% ； 所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%-0.5% ； 所述的试剂D为去离子水； 所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为1X IO8拷贝/ml; 所述的试剂A中引物Pls的序列为:5’_ TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3’，引物Pla的序列为 5’ - CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3’ ； 所述的试剂B中引物P2s的序列为:5’_ ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG -3’，引物P2a的序列为 5’ - CGCAAT GAAGTCTTTAATTTTTC -3’。
【文档编号】C12Q1/06GK103695552SQ201310725983
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】黎娅, 罗福广, 黄杰, 易弋, 伍时华 申请人:广西科技大学