一种培养游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法，属于发酵工程【技术领域】。步骤如下：在斜面培养基上培养游动放线菌（Actinoplanes）CGMCC?No.8430，将培养好的斜面菌种接种到摇瓶种子培养基，再将培养好的种子液接种到种子罐中，之后接种到发酵培养基中发酵培养，得雷帕霉素发酵液。本发明通过培养基的优化及培养条件的控制，能够使游动放线菌产生较高浓度的雷帕霉素，在30L发酵罐的发酵实验中，雷帕霉素的产量可达到750mg/L左右，在200L发酵罐的发酵实验中，雷帕霉素的产量可达到840mg/L左右，使雷帕霉素更容易满足工业化生产的需要，且高浓度更有利于后续的提取工作。
【专利说明】一种培养游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵工程【技术领域】，具体涉及一种利用游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法。
【背景技术】
[0002]雷帕霉素(rapamycin，RPM)又名西罗莫司，是具有独特作用机制的含氮三烯大环内酯类抗生素，具有抗真菌、抗增殖和抗肿瘤的作用。雷帕霉素是31元环组成的三烯大环内酯类化合物，含有特殊的α、β-二酮乙哌啶酸酰胺分子掩盖的半缩酮，分子式为C51H79N013，分子质量为991，为白色的固体结晶，熔点为183_185°C，亲脂性，微溶于水，几乎不溶于乙醚，但溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂。
[0003]雷帕霉素是目前世界上最有前途的新型强效免疫抑制剂，其分子结构类似于FK506，但毒副作用小于FK506，是又一种亲免疫蛋白结合剂，可用于器官移植抗排斥作用。它的活性比临床上使用的第三代免疫抑制剂环孢霉素强10-100倍，与环孢霉素有协同免疫抑制作用，联合使用不仅能扩大两种药物的治疗指数，还能减少环孢霉素的用量，减轻环孢霉素肾毒性的发生。雷帕霉素还可用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病，目前发展为基因治疗和抗肿瘤药物，具有广阔的应用前景。
[0004]雷帕霉素主要通过微生物发酵的方法生产，由代谢产生雷帕霉素的吸水链霉菌或其他菌株发酵富集和分离纯化得到。目前，国内外的研究主要针对吸水链霉菌，陈希杨等(陈希杨等，化学工程，2011)研究了雷帕霉素发酵的最佳种子培养时间，发现60h的种子液能够产生最高的发酵水平，并对发酵培养基进行了优化，确定了最优的培养基配方。目前，雷帕霉素生物发酵生产存在的不足主要在于雷帕霉素的生物发酵单位不高，不利于提取纯化，不能充分满足工业化生产的要求。
【发明内容】
`[0005]为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种以游动放线菌为生产菌株，进行发酵、获取雷帕霉素发酵液的方法。
[0006]所述生产菌株为游动放线菌(Actinoplanes sp、)诱变菌株BCStr-096,该菌株于2013年11月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.8430 ;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101,分类命名:游动放线菌Actinoplanes sp、。
[0007]—种培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，包括如下步骤:
[0008](I)菌种活化
[0009]将甘油保存的游动放线菌(Actinoplanes)转接至保藏分离培养基，于恒温培养箱中，28°C培养7-15d，至斜面由橙色变为黄褐色；
[0010]所述保藏分离培养基组成为:燕麦片1_4%，葡萄糖0.5-3%，酵母粉0.1_2%，蛋白胨
0.1-2%，碳酸钙0.1-0.5%，ρΗ6.9-7.4，蒸馏水配制，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；[0011](2)摇瓶种子培养
[0012]选择生长良好的活化斜面，取lcm2大小的菌种转接于新鲜种子培养基中，于28 0C，180-250r/min 的立式摇床上，培养 40_55h ；
[0013]所述摇瓶培养基组成为:可溶性淀粉1_3%，蛋白胨0.1-2%，葡萄糖0.5-3%，黄豆饼粉0.5-4%，碳酸钙0.1-0.5%，ρΗ6.9-7.4，蒸馏水配制，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；
[0014](3)种子罐种子培养:将摇瓶种子培养液以6-15%的接种量接种于种子罐培养基中，28°C，培养38-52h，得种子液；
[0015]所述种子罐培养基组成为:可溶性淀粉1_3%，葡萄糖0.5-3%，黄豆饼粉0.5-4%,玉米浆0.2-2%，硫酸镁0.05-0.4%，碳酸钙0.1-0.5%，pH6.9-7.4，蒸馏水配制，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；
[0016](4)发酵培养
[0017]将种子液以8-15%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，通入无菌空气并开启搅拌，于28°C，培养30-48h后，一次性补加发酵培养基总量4-6%的赖氨酸；继续发酵110h-160h，得到雷帕霉素发酵液。
[0018]所述发酵培养基组成为:玉米淀粉1_4%，葡萄糖0.5-3%，黄豆饼粉0.5_4%，蛋白胨0.1-2%，磷酸氢二钾0.1-3%，磷酸二氢钾0.1-3%，硫酸镁0.05-0.4%，氯化钠0.01_2%，甘油1_4%，碳酸钙0.1-0.5%，泡敌0.05-0.4%，ρΗ6.9-7.4，自来水配制，121°C高压蒸汽灭菌20min ；
[0019]有益效果:
[0020]本发明通过培养基的优化及培养条件的控制，能够使游动放线菌(Actinoplanessp.)CGMCC N0.8430产生较高浓度`的雷帕霉素，在30L发酵罐的发酵实验中，雷帕霉素的产量可达到750mg/L左右，在200L发酵罐的发酵实验中，雷帕霉素的产量可达到840mg/L左右，本发明使雷帕霉素更容易满足工业化生产的需要，且高浓度雷帕霉素的发酵液，更有利于后续的提取工作。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0022]实施例1:
[0023]所述游动放线菌(Actinoplanes sp.)诱变菌株BCStr-096,该菌株于2013年11月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCN0.8430 ;该菌株是以从海南岛的土壤样品中筛选出的产雷帕霉素的游动放线菌hn-016(Actinoplanes sp.)为出发菌株,经多组复合诱变筛选得到的。
[0024]1.以游动放线菌hn-016为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变技术筛选菌株BCStr-096。
[0025](I)选择生长良好的产雷帕霉素的游动放线菌hn-016斜面菌株，用生理盐水洗下孢子，经纱布过滤，制成106个/mL的孢子悬浮液；
[0026](2)将(I)中的孢子悬浮液,用移液枪吸取IOyL于直径为Icm的圆形铁片上,置于以氦气为工作气体，功率110W，工作气流量10L/min的常压室温等离子体诱变系统中，处理距离为 2mm,分别处理 0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s、180s，将处理的孢子
悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线；
[0027](3)根据(2)的致死率曲线，选择高、中、低三个不同致死剂量的照射时间，对菌株hn-016的孢子悬液进行等离子体诱变；
[0028](4)将(3)中三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀；
[0029](5)将(4)中的诱变孢子悬液，进行梯度稀释后，分别涂布于含有2mg/L氯霉素，
0.8mg/L链霉素，4mg/L红霉素，lmg/L庆大霉素的抗性平板上；
[0030](6)将(5)中各个抗性平板上长出的单菌落转接斜面后，以1%的接种量，接种于种子培养基中，280C，220r/min,培养45_50h后，以10%的接种量将种子液接种于发酵培养基，28 0C，220r/min 培养 7_8d ；
[0031](7)取(6)中的发酵液于离心管中，5000r/min离心lOmin，取菌体用甲醇萃取，倒入装有10-15颗玻璃珠的三角瓶中，于180-200r/min的摇床上震荡浸提lh，取抽提液，10000r/min离心lOmin，过有机滤膜后，利用高效液相色谱法测定雷帕霉素的产量，通过此方法筛选出雷帕霉素高产菌株BCStr-096。
[0032]2.诱变菌株BCStr-096的特性
[0033](I)菌体形态:菌体为革兰氏阳性菌，无气生菌丝，以孢子的方式进行繁殖，孢子浑圆，大部分具极生丛毛，能游动。
[0034](2)菌落形态:在平板上，菌落的基丝表面呈颗粒状，橙黄色，随着培养时间的延长，菌落会由橙黄色变成黄褐色。
[0035](3)培养特征:此菌为高耗氧菌，最适生长温度为28°C，最适生长pH为7.1 ;在摇床转速为230r/min，培养7_8d时，雷帕霉素产量最高。
[0036](4)可以在含有0.8mg/L链霉素的培养基中进行生长，并生长良好。
[0037]实施例2
[0038]30L发酵罐的发酵培养，包括如下步骤:
[0039]( I)斜面菌种的培养
[0040]将甘油保存的游动放线菌用ImL移液管转接至保藏分离培养基，并用接种针密划，于28°C恒温培养箱中，培养8d,斜面由橙色变为黄褐色。
[0041](2)摇瓶种子培养
[0042]选择生长良好的活化斜面，取lcm2大小的菌种转接于新鲜种子培养基中，于28 0C，220r/min的立式摇床上，培养48h。
[0043](3)种子罐种子培养
[0044]在IOL—级种子罐中装入种子罐培养基6L，灭菌，将摇瓶种子培养液，以8%的接种量接种，罐压0.05Mpa,通气比0.7vvm, DO控制在35_38%，28°C，培养46h，得种子液。
[0045](4)发酵培养
[0046]在30L发酵罐中装入发酵培养基18L，灭菌，将种子液以11%的接种量接种，通入无菌空气并开启搅拌，于28°C，罐压0.05Mpa, DO控制在40_42%，培养48h后，一次性补加发酵培养基总量5%的赖氨酸；继续发酵140h，得到雷帕霉素发酵液。
[0047]发酵结束后，取IOmL发酵液，离心后弃上清液，分10次向离心后的固体里面加无水甲醇20mL，转移至三角瓶中，封口，于220r/min的摇床上，浸提2h ;取浸提液于5mL的离心管中，12000r/min，离心lOmin，其上清液通过高压液相色谱进行分析，测得雷帕霉素的产量。进行三批30L罐的平行发酵试验，得到的雷帕霉素的平均产量为750.6mg/L。
[0048]所述保藏分离培养基组成为:燕麦片3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，碳酸钙
0.25%，琼脂2%，pH7.2，蒸馏水配制，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；
[0049]所述摇瓶培养基组成为:可溶性淀粉2.8%，蛋白胨0.8%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1%，碳酸钙0.3%，pH7.2，蒸馏水配制，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；
[0050]所述种子罐培养基组成为:可溶性淀粉2.5%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1.5%，玉米浆
0.5%，硫酸镁0.2%，碳酸钙0.3%，pH7.2，蒸馏水配制，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；[0051]所述发酵培养基组成为:玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黄豆饼粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.2%，氯化钠0.5%，甘油1%，碳酸钙0.3%，泡敌
0.2%，ρΗ7.2，自来水配制，121°C高压蒸汽灭菌20min ；
[0052]所述培养基中葡萄糖单独灭菌，采用1211:高压蒸汽灭菌201^11。
[0053]实施例3:
[0054]200L发酵罐的发酵培养，包括如下步骤:
[0055]( I)斜面菌种的培养
[0056]将甘油保存的游动放线菌用ImL移液管转接至保藏分离培养基，并用接种针密划，于28°C恒温培养箱中，培养10d，至斜面由橙色变为黄褐色。
[0057](2)摇瓶种子培养
[0058]选择生长良好的活化斜面，取lcm2大小的菌种转接于新鲜种子培养基中，于28 0C，220r/min的立式摇床上，培养48h。
[0059](3)—级种子罐种子培养
[0060]在IOL—级种子罐中装入种子罐培养基6L，灭菌，将摇瓶种子培养液以10%的接种量接种，罐压0.05Mpa,通气比1.0vvm, DO控制在35_38%，28°C，培养42h，得一级种子液。
[0061](4) 二级种子罐种子培养
[0062]在30L —级种子罐中装入种子罐培养基18L，灭菌，将一级种子液按二级种子罐培养基体积10%的量接种，罐压0.05Mpa,通气比1.0vvm, DO控制在36-37%，28°C，培养39h，得二级种子液。
[0063](5)发酵培养
[0064]在200L发酵罐中装入发酵培养基120L，灭菌，将二级种子液以10%的量接种，通入无菌空气并开启搅拌，于28°C，罐压0.05Mpa, DO控制在40_42%，培养48h后，一次性补加发酵培养基总量5%的赖氨酸；继续发酵140h，得雷帕霉素发酵液。
[0065]发酵结束后，取IOmL发酵液，离心后弃上清液，分10次向离心后的固体里面加无水甲醇20mL，转移至三角瓶中，封口，于220r/min的摇床上，浸提2h ;取浸提液于5mL的离心管中，12000r/min，离心lOmin，其上清液通过高压液相色谱进行分析，测得发酵液中雷帕霉素的产量。进行三批200L罐的平行发酵试验，得到的雷帕霉素的平均产量是840.35mg/L。
[0066]所述培养基同实施例1。
【权利要求】
1.一种培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，其特征在于，所述游动放线菌为保藏编号CGMCC N0.8430的菌株，具体方法如下: (1)菌种活化 将甘油保存的游动放线菌(Actinoplanes)转接至保藏分离培养基,于恒温培养箱中，28°C培养7-15d，至斜面由橙色变为黄褐色； (2)摇瓶种子培养 选择生长良好的活化斜面，取Icm2大小的菌种转接于新鲜种子培养基中，于28°C，180-250r/min的立式摇床上，培养40_55h ； (3)种子罐种子培养:将摇瓶种子培养液以6%-15%接种量接种于种子罐培养基中，280C，培养38-52h，得种子液； (4)发酵培养` 将种子液以8-15%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，通入无菌空气并开启搅拌，于28°C，培养30-48h后，一次性补加赖氨酸；继续发酵110h-160h，得到雷帕霉素发酵液。
2.如权利要求1所述培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，其特征在于，保藏分离培养基组成为:燕麦片1_4%，葡萄糖0.5-3%，酵母粉0.1-2%，蛋白胨0.1-2%，碳酸钙0.1-0.5%，ρΗ6.9-7.4，蒸馏水配制。
3.如权利要求1所述培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，其特征在于，摇瓶培养基组成为:可溶性淀粉1_3%，蛋白胨0.1-2%，葡萄糖0.5-3%，黄豆饼粉0.5-4%，碳酸钙0.1-0.5%，ρΗ6.9-7.4，蒸馏水配制。
4.如权利要求1所述培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，其特征在于，种子罐培养基组成为:可溶性淀粉1_3%，葡萄糖0.5-3%，黄豆饼粉0.5-4%，玉米浆0.2_2%，硫酸镁 0.05-0.4%，碳酸钙 0.1-0.5%，ρΗ6.9-7.4，蒸馏水配制。
5.如权利要求1所述培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为:玉米淀粉1_4%，葡萄糖0.5-3%，黄豆饼粉0.5-4%，蛋白胨0.1-2%,磷酸氢二钾0.1-3%，磷酸二氢钾0.1-3%，硫酸镁0.05-0.4%，氯化钠0.01_2%，甘油1_4%，碳酸钙0.1-0.5%，泡敌 0.05-0.4%, ρΗ6.9-7.4，自来水配制。
6.如权利要求1所述培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，其特征在于，补加赖氨酸的量为发酵培养基总量的4_6%。
7.如权利要求1所述培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，其特征在于，30L发酵罐的发酵培养，包括如下步骤: (1)斜面菌种的培养 将甘油保存的游动放线菌用ImL移液管转接至保藏分离培养基，并用接种针密划，于28°C恒温培养箱中，培养8d，斜面由橙色变为黄褐色； (2)摇瓶种子培养 选择生长良好的活化斜面，取Icm2大小的菌种转接于新鲜种子培养基中，于28°C，220r/min的立式摇床上，培养48h ； (3)种子罐种子培养 在IOL—级种子罐中装入种子罐培养基6L，灭菌，将摇瓶种子培养液，以8%的接种量接种，罐压0.05Mpa,通气比0.7vvm, DO控制在35-38%，28°C，培养46h，得种子液； (4)发酵培养 在30L发酵罐中装入发酵培养基18L，灭菌，将种子液以11%的接种量接种，通入无菌空气并开启搅拌，于28°C，罐压0.05Mpa, DO控制在40_42%，培养48h后，一次性补加发酵培养基总量5%的赖氨酸；继续发酵140h，得到雷帕霉素发酵液； 发酵结束后，取IOmL发酵液，离心后弃上清液，分10次向离心后的固体里面加无水甲醇20mL，转移至三角瓶中，封口，于220r/min的摇床上，浸提2h ;取浸提液于5mL的离心管中，12000r/min,离心IOmin,其上清液通过高压液相色谱进行分析,测得雷帕霉素的产量；进行三批30L罐的平行发酵试验，得到的雷帕霉素的平均产量为750.6mg/L ； 所述保藏分离培养基组成为:燕麦片3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，碳酸钙0.25%，琼脂2%，pH7.2，蒸馏水配制，121 °C高压蒸汽灭菌20min ； 所述摇瓶培养基组成为:可溶性淀粉2.8%，蛋白胨0.8%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1%，碳酸钙0.3%, pH7.2,蒸懼水配制，121 °C高压蒸汽灭菌20min ； 所述种子罐培养基组成为:可溶性淀粉2.5%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1.5%，玉米浆0.5%，硫酸镁0.2%，碳酸钙0.3%，pH7.2，蒸馏水配制，121°C高压蒸汽灭菌20min ； 所述发酵培养基组成为:玉米淀粉2%，葡萄糖2.5%，黄豆饼粉3%，蛋白胨0.8%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.2%，氯化钠0.5%，甘油1%，碳酸钙0.3%，泡敌0.2%，pH7.2,自来水配制，121°C高压蒸汽灭菌20min ； 所述培养基中葡萄糖单独灭菌，采用121°C高压蒸汽灭菌20min。
【文档编号】C12P17/18GK103740781SQ201310755026
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月28日 优先权日:2013年12月28日
【发明者】乔长晟, 石漫漫, 李雪, 朱明
申请人:天津北洋百川生物技术有限公司