测定(d)-2-羟基戊二酸(d2hg)或(d)-2-羟基己二酸的工具和方法
【专利摘要】本发明涉及检测样品中的(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基己二酸的方法，所述方法包括步骤为：a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含:(i)溶剂,(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，(iii)电子转移剂，(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和(v)辅因子；和b)通过测量染料的还原态的生产检测(D)-2-羟基戊二酸或(D)-2-羟基己二酸。本发明还涉及用于诊断和/或监控对象中(D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的方法。本发明也涵盖用于诊断对象中的异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因中或(D)-2-羟基戊二酸(D2HG)脱氢酶基因中的突变的方法。此外，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含(i)溶剂,(ii)具有氧化态和还原态的染料,其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，(iii)电子转移剂，(iv)(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和(v)辅因子。
【专利说明】测定（D)-2-羟基戊二酸（D2HG)或（D)-2-羟基己二酸的工 具和方法
[0001] 本发明涉及检测样品中（D)-2-羟基戊二酸或（D)-2-羟基己二酸的方法，所述 方法包括步骤为：a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含：（i)溶剂，（ii) 具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存 在，（iii)电子转移剂，（iv)(D)-2_羟基戊二酸脱氢酶，和（v)辅因子；和b)通过测量染 料的还原态的生产检测（D)-2-羟基戊二酸或（D)-2-羟基己二酸。本发明还涉及诊断和 /或监控对象中（D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的方法。本发明也涵盖了诊断对象中异柠 檬酸脱氢酶（IDH)基因中和/或（D)-2-羟基戊二酸（D2HG)脱氢酶基因中的突变的方法。 此外，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含（i)溶剂，（ii)具有氧化态和还原态的染料， 其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，（iii)电子转移剂，（iv) (D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和（v)辅因子。
[0002] 异柠檬酸脱氢酶（IDH)催化两步反应中的异柠檬酸至α酮戊二酸的氧化脱羧，导 致NADH或NADPH的生产。在人中，已知三种IDH同种型。这些同种型中的两个，即同二聚 体IDH2(NADP+依赖的）和异三聚体IDH3(NAD+依赖的）定位于线粒体中，在这里它们参与 Krebs循环（柠檬酸循环）。与之相反，同二聚体IDH1 (NADP+依赖的）在细胞质和过氧化 酶体中有活性（Geisbrecht 等人，1999, J. Biol. Chem.，274:3052730533)。
[0003] 已经在神经代谢病症和肿瘤性疾病中鉴定了在编码异柠檬酸脱氢酶的基因中的 突变。
[0004] I型戊二酸尿症或酸血症（戊二酰_CoA脱氢酶（G⑶H)缺陷）是遗传的病症， 其由编码异柠檬酸脱氢酶2的IDH2基因中的或编码（D)-2-羟基戊二酸（D2HG)降解 酶，即D2HG脱氢酶的基因中的突变引起，导致所述酶的酶促功能损伤（Kranendijk等 人，2010, Science 330:336)。在这两种情况下，D2HG在携带突变的患者的体内积累并最终 随尿排泄。戊二酸尿症首先在1975年描述（Goodman等人，1975, Biochem. Med. 12:12-21)。 回顾性和前瞻性研究包括来自具有高携带者频率的两个北美遗传分离系的患者：阿米什 团体（Amish Community) (Strauss 等人，2003, Am. J. Med. Genet. 121C: 38-52 ;Strauss 等 人，2007, Brain 130:1905-1920)和 Saulteaux/0jibwa(0ji_Cree)印第安人（Greenberg 等人，2002, Mol. Gen. Metab. 75:70-78)以及欧洲患者（Hoffmann 等人，1991，Pediatrics 88:1194-1203 ;Hoffmann 等人，1996，Neuropediat;rics 27:115-123 ;Busquets 等 人，2000, Pediatr. Res. 48:315-322 ;Kyllerman 等人，2004, Mov. Disord. 9:22-30)。已经 报道了评估描述了 115名患者的42个公开的病例报告的该疾病的元分析（Bjugstad等 人，2000, J. Pediatr. 137:681-686)。也已经公开了招募了 279名患者的国际横断面研究 ( K61ker等人，2006, J. Pediatr. 137:681-686)。最近，已经引入了诊断和管理I型戊二 酸尿症的指南（Kdlker等人，2007, J. Inherit. Metab. Dis. 30:5)，并且已经确认了使用 该指南的有益效果（Heringer等人，2010, Ann. Neurol. 68:743-752)。这些报告大大拓宽了 I型戊二酸尿症的临床谱，包括了具有非进行性锥体束外综合征的儿童以及甚至生物化学 上受影响但临床上正常的具有I型戊二酸尿症的儿童。目前，在世界范围已经报道了多于 500名患者。结果是，戊二酸尿症现在被认为是最常见的可鉴别的与进行性或非进行性锥体 束外疾病相关的代谢的先天性障碍之一。近年来，用于扩展的新生儿筛查的基于串联质谱 的程序的发展提供了在急性脑病发作之前诊断多种儿童（Lindner等人，2006, J. Inherit. Metab.Dis. 29:378-382)以及开展前瞻性随访研究（Strauss等人，2003,在上述引文中； Naughten 等人，2004, J. Inherit. Metab. Dis. 27:917-920 ; Kdlkei* 等人，2007, Pediatr. Res.62:353-362;Bijarnia 等人，2008，J.Inherit.Metab.Dis.31:503-507;Boneh 等 人，2008, Mol. Genet. Metab. 94:287-291)的机会。
[0005] 琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH)缺陷是罕见的代谢的先天性障碍的另一实例，主要由 尿有机酸筛查揭示。患有证明的SSADH缺陷的患者除了 γ-羟基丁酸（GHB)，排泄相当大量 的 D2HG(Struys 等人，2006，Molecular Genetics and Metabolism 88(1) :53 _ 57)。
[0006] 在最近的癌症基因组测序项目中，细胞质异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)中的杂合的 体细胞突变主要发现于继发性成胶质细胞瘤（GBM)中（83%)，较少发现于原发性GBM中 (7 % ) (Parsons等人，2008, Science 321:1807-1812)。这些结果可通过进一步研究证 明，其中IDH1突变能够在弥散的星形细胞瘤（71% )、WHO II级和III级的少突胶质细 胞瘤和少突星形细胞瘤中频繁检测到（Balss等人，2008，Acta Neuropathol.，116:597 602 ;Hartmann 等人，2009, Acta Neuropathol.，118:469474)。此外，已经鉴定了线 粒体异柠檬酸脱氢酶（IDH2)中的突变，尽管频率较低（3 % )。IDH突变不仅在弥散 性神经胶质瘤中发生，也在急性髓性白血病（AML) (IDHl:6-8. 5 % ;IDH2:8. 7-11 % ) (Abbas 等人，2010，Blood, 116:2122-2126 ;Mardis 等人，2009，New England Journal of Medicine，361:1058 1066 ;Paschka 等人，2010, J.Clin.Oncol·，28: 36363643; Schnittger 等人，2〇10，Blood, 116:5486_5496)、软骨肉瘤（ 56% ) (Amary 等人，2〇11，工 Pathol.，224:334-343)、肝内胆管癌（?25 % ) (Borger 等人，2012, The Oncologist 17:72-79)和血管免疫母细胞T细胞淋巴癌（?45%) (Cairns等人，2012，Blood)中发生。
[0007] 在IDH基因中发生的突变导致在两个不同位置的氨基酸交换，即在IDH1基因中的 100或132位，在132位的精氨酸至组氨酸的点突变（R132H)代表弥散性神经胶质瘤中最频 繁的突变，并且在IDH2基因中在两个不同位置，S卩140或172位。突变共同定位于酶促结构 域，其中结合并转化异柠檬酸（Soundar 和 Colman, 2000, J. Biol. Chem.，275:5606-5612)。 这些位点特异性突变使酶失去了将异柠檬酸转化为α酮戊二酸的正常的能力（Yan等 人，2009, Cancer Res.，69:9175-9159 ;Zhao 等人，2009, Science, 324:261-265)并赋予 了酶新功能，即催化α酮戊二酸NADPH依赖性还原为（D)-2-羟基戊二酸的能力（Dang等 人，2009, Nature, 462:739-744 ;Ward 等人，2011，Oncogene, doi : 10. 1038/onc. 2011. 416)。 在甲状腺癌中描述了其他IDH突变，然而，尚未可知，这些突变是否导致（D) -2-羟基戊二酸 的生产（Murugan 等人，2010, BBRC 393:555-559)。
[0008] 目前，低级神经胶质瘤的诊断是通过IDH1 R132H特异性抗体的标准化使用来进行 的。所述肿瘤性疾病中该点突变的频率为约90 %。因此，可以通过使用所述抗体的免疫组织 分析诊断大量的弥散性神经胶质瘤发生（Capper等人，2009, Acta Neuropathol.，218:599 601 ;Capper 等人，2011，International Journal of Cancer/Journal International Du Cancer，d〇i:10. 1002/ijc26425)。然而，IDH基因中的其他突变目前仅能够通过相应外显 子的DNA测序检测。
[0009] 此外，迄今，检测肿瘤组织中的和低级神经胶质瘤的石蜡包埋的组织中的（Sahm 等人，2010, Brain Pathology, doi :10. 1111/j. 1750 3639. 2011. 00506. X)和 AML 患者血清 中的（Sellner 等人，2010, Eur. J. Haematol.，85:457-459) (D)-2-轻基戊二酸只能够通过 GC-MS(气相色谱-质谱）进行。然而，此方法与由于劳动密集和耗时的用于分析的样品制 备的高成本相关联。此外，GC-MS不适于样品的高通量分析。
[0010] 鉴于以上，用于检测（D)-2-羟基戊二酸的其他工具和方法是必要的，但尚不可获 得。
[0011] 在最近的研究中，已经将来自异柠檬酸脱氢酶的癌症相关突变应用至高异 柠檬酸脱氢酶的活性位点中的同源残基以得到催化2-氧代己二酸转化为（R)-2-羟 基己二酸的酶，该步骤是肥酸生产的关键步骤（Reitman等人，Nature Chemical Biology(2012)8:887-889)。在另一公开中，已经假定了肥酸的生物技术生产过 程（Parthasarathy 等人，Biochemistry, 2001 May 3,50(17):3540-50 ;erratum in Biochemistry, 2011 May 24,50(20):4392)。
[0012] 因此，需要用于监控肥酸生成的工具和方法，所述工具和方法迄今尚不可获得。
[0013] 因此，构成本发明的技术问题可以视为提供用于满足前述需求的工具和方法。该 技术问题由在权利要求和下文中表征的实施方案解决。
[0014] 本发明涉及检测样品中（D)-2-羟基戊二酸的方法，所述方法包括步骤为：
[0015] a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含：
[0016] ⑴溶剂，
[0017] (ii)具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料 初始以氧化态存在，
[0018] (iii)电子转移剂，
[0019] (iv) (D) -2-羟基戊二酸脱氢酶，和
[0020] (v)辅因子；和
[0021] b)通过测量染料的还原态的生产检测（D)-2-羟基戊二酸。
[0022] 迄今在2-羟基戊二酸相关疾病的临床筛选中通常用于测定2-羟基戊二酸（2HG) 的GC-MS (气相色谱-质谱）不能区分2-羟基戊二酸的两种对映异构体，即两种对映异构 体均被所述方法检测到。因此，GC-MS之后必须进行其他的分析步骤，使用例如，用于鉴定 具体对映异构体的手性色谱柱。此外，GC-MS昂贵，主要是因为用于分析的样品的制备是劳 动密集并且耗时的。因此需要约1天半才能获得GC-MS分析的结果。此外，GC-MS不适于 样品的高通量分析。
[0023] 与之相反，本发明的方法提供了用于特异性检测2-羟基戊二酸的D-(或R-)对映 异构体，g卩（D)-2-羟基戊二酸（D2HG)的简单和可靠的酶促测定法。此外，所述方法是快速 的，因为其能够在约2至3小时中进行。此外，其适于96孔形式并甚至可以进一步小型化 至384孔形式，从而允许同时对许多样品的平行分析。
[0024] 本发明还涉及检测样品中（D)-2_羟基己二酸的方法，所述方法包括步骤为：
[0025] a)将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含：
[0026] ⑴溶剂，
[0027] (ii)具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料 初始以氧化态存在，
[0028] (iii)电子转移剂，
[0029] (iv) (D) -2-羟基戊二酸脱氢酶，和
[0030] (V)辅因子；和
[0031] b)通过测量染料的还原态的生产检测（D)-2-羟基己二酸。
[0032] 最近，已经由Parthasarathy和同事假设了肥酸的生物技术生产过程 (Parthasarathy 等人，Biochemistry, 2001 May 3,50(17):3540-50 ;erratum in Biochemistry, 2011 May 24, 50 (20): 4392)。肥酸是聚酰胺尼龙-6, 6和若干聚酯的构件。 因为（D)-2-羟基己二酸是上述肥酸的生物技术生产过程中的中间体，能够使用本发明的 检测（D)-2-羟基己二酸的方法，例如用于监控所述过程或用于生产肥酸的任何其他过程， 其中（D)-2-羟基己二酸被用作中间体。例如，最近发现能够通过突变高异柠檬酸脱氢酶的 活性位点中的特异性残基获得特异性的（R)-2_羟基己二酸脱氢酶（Reitman等人，Nature Chemical Biology (2012) 8:887-889)。所述（R)-2-轻基己二酸脱氢酶能够催化2-氧代己 二酸转化为（R) -2-羟基己二酸，这是肥酸生产的关键步骤。
[0033] 此外，本发明涉及用于诊断和/或监控对象中（D)-2_羟基戊二酸相关的疾病的方 法，所述方法包括：
[0034] a)将所述对象的样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含：
[0035] ⑴溶剂，
[0036] (ii)具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初 始以氧化态存在，
[0037] (iii)电子转移剂，
[0038] (iv) (D) -2-羟基戊二酸脱氢酶，和
[0039] (V)辅因子；和
[0040] b)通过测量染料的还原态的生产检测（D) -2-羟基戊二酸，从而诊断和/或监控 所述对象中（D)-2-羟基戊二酸相关的疾病。
[0041] 优选地，将在步骤b)中检测到的（D)-2_羟基戊二酸的量与来自不携带IDH1基 因、IDH2基因、或D2HG脱氢酶基因中的突变的健康对象或健康对象的组的（D) -2-羟基戊二 酸的参考量作比较。该参考量为约6 μ M (D) -2-羟基戊二酸，这是通过具有各基因的两个野 生型等位基因的健康对象的血清中的GC/MS测定的。如果在步骤b)中检测到的在测试的对 象的样品中的（D)-2-羟基戊二酸的量高于此参考量，这提示所述对象中的（D)-2-羟基戊 二酸相关的疾病。因为本发明的方法允许特异性检测2-羟基戊二酸的D-(或R-)对映异 构体，g卩（D)-2-羟基戊二酸（D2HG)，所述方法能够用于诊断和/或监控对象中的（D)-2-羟 基戊二酸相关的疾病。在优选的实施方式中，所述（D)-2-羟基戊二酸相关的疾病是选自主 要由弥散性神经胶质瘤、急性髓性白血病（AML)、软骨肉瘤、肝内胆管癌和血管免疫母细胞 T细胞淋巴癌组成的组的肿瘤性疾病。也已经描述了（D)-2-羟基戊二酸相关的甲状腺癌 的罕见病例。其他（D)-2-羟基戊二酸相关的疾病包括非肿瘤性戊二酸尿症、琥珀酸半醛脱 氢酶（SSADH)缺陷、Ollier's疾病和Maffucci综合征。优选地，所述弥散性神经胶质瘤是 WHO II级星形细胞瘤（All)、WH0 II级少突胶质细胞瘤（011)或WHO II级少突星形细胞瘤 (OAII)。弥散性神经胶质瘤也发生在含有WHO III级间变性星形细胞瘤（AIII)、WHO III 级间变性少突胶质细胞瘤（0ΠΙ)和WHO III级间变性少突星形细胞瘤（0AIII)的恶性间 变性变体中。全部弥散性神经胶质瘤具有发展为高度恶性的继发性成胶质细胞瘤的潜能。
[0042] "星形细胞瘤"是来自脑内的前体细胞的能够星形细胞分化的神经胶质瘤。相信正 常星形细胞源自这些前体细胞。星形细胞的生理学作用是储存神经细胞的信息和养分。少 突胶质细胞瘤是软的、浅灰色-粉色肿瘤。其通常含有固体矿物沉积物-其主要是钙-称 为钙化。如本文所用的"少突星形细胞瘤"是"混合的神经胶质瘤"肿瘤，含有具有星形细 胞和具有少突胶质细胞分化二者的肿瘤细胞。在本文别处以更多细节表征弥散性神经胶质 瘤。如本领域技术人员所理解的，本发明的所述方法能够用于发现或筛选其他（D)-2_羟基 戊二酸相关的疾病或病症，例如，肿瘤性疾病或神经代谢病症。优选地，所述疾病或病症与 IDH和/或D2HG脱氢酶基因中的突变相关。
[0043] 本发明还涉及诊断对象中异柠檬酸脱氢酶（IDH)基因中和/或（D)-2_羟基戊二 酸（D2HG)脱氢酶基因中的突变的方法，所述方法包括：
[0044] a)将所述对象的样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含：
[0045] ⑴溶剂，
[0046] (ii)具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料 初始以氧化态存在，
[0047] (iii)电子转移剂，
[0048] (iv) (D) -2-羟基戊二酸脱氢酶，和
[0049] (V)辅因子；和
[0050] b)通过测量染料的还原态的生产检测（D)-2_羟基戊二酸，其中对象的样品中存 在（D)-2-羟基戊二酸提示所述对象中异柠檬酸脱氢酶（IDH)基因和/或（D)-2-羟基戊二 酸脱氢酶基因中的突变。
[0051] 可以例如，通过所述一个或多个基因中相应外显子的DNA测序或本领域已知的其 他方法，检测异柠檬酸脱氢酶（IDH)基因中和/或（D)-2-羟基戊二酸脱氢酶基因中的突 变。
[0052] 优选地，所述异柠檬酸脱氢酶（IDH)突变是人IDH1基因中，和/或人IDH2基因中 和/或人D2HG脱氢酶基因中的突变。
[0053] 约70 %至90 %，可能甚至多至100 %的弥散性神经胶质瘤患者（罹患All、 AIII、011、0111、0ΑΙΙ、0ΑΙΙΙ、或继发性成胶质细胞瘤）携带IDH1和/或IDH2基 因中的突变（Parsons 等人，2008, Science 321，1807-1812 ;Balss 等人，2008, Acta Neuropathol.，116:597-602 ;Hartmann 等人，2009,Acta Neuropathol.，118:469-474)。 IDH突变也能够在急性髓性白血病（AML) (IDHl:6-8. 5% ;IDH2:8. 7-11% )和血管免疫 母细胞 T 细胞淋巴癌（Abbas 等人，2010, Blood, 116:2122-2126 ;Mardis 等人，2009, New England Journal of Medicine，361:1058_1066;Paschka 等人，2010,J. Clin. Oncol.，28:3636-3643 ;Schnittger 等人，2010, Blood, 116:5486-5496 ;Cairns 等人，在 上述引文中）、软骨肉瘤（56% ) (Amary等人，2011，J. Pathol. ,224:334-343)和肝内胆管 癌（Borger，在上述引文中）中鉴定。在AML中，已经描述了具有IDH1和IDH2基因二者中 的突变的两个病例（Abbas等人，在上述引文中）。尽管非常罕见，已经描述了在甲状腺癌 (约 0· 1% )和结肠癌中的 IDH 中的突变（Sjdblom 等人，2006, Science 314:268-274)。
[0054] 优选地，所述突变是如表1中所示或如本文别处所描述的点突变。
[0055] 表1:IDH1和IDH2中的突变及其在不同肿瘤性疾病中的发生。
[0056] IDH1中残基（R) 100和132处的氨基酸位置分别对应于IDH2中的位置140和172， 因为在IDH2中，存在40个氨基酸的线粒体信号序列。发生的氨基酸交换在括号中，按照频 率分类，即在左侧的突变代表最频繁的突变。
[0057] 表 1
[0058]
【权利要求】
1. 检测样品中的（D)-2-羟基戊二酸或（D)-2-羟基己二酸的方法，所述方法包括： a) 将样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含： ⑴溶剂， (ii) 具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始 以氧化态存在， (iii) 电子转移剂， (iv) (D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和 (v) 辅因子；和 b) 通过测量染料的还原态的生产检测（D)-2-羟基戊二酸或（D)-2-羟基己二酸。
2. 用于诊断和/或监控对象中（D)-2-羟基戊二酸相关的疾病的方法，所述方法包括： a) 将所述对象的样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含： ⑴溶剂， (ii) 具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始 以氧化态存在， (iii) 电子转移剂， (iv) (D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和 (v) 辅因子；和 b) 通过测量染料的还原态的生产检测（D)-2-羟基戊二酸，从而诊断和/或监控所述 对象中（D)-2-羟基戊二酸相关的疾病。
3. 权利要求2的方法，其中所述（D)-2-羟基戊二酸相关疾病是选自由弥散性神经胶质 瘤、急性髓性白血病（AML)、软骨肉瘤、胆管癌和甲状腺癌组成的组的肿瘤性疾病；或其中 所述（D)-2-羟基戊二酸相关的疾病是戊二酸尿症。
4. 权利要求3的方法，其中所述弥散性神经胶质瘤是WHO II级星形细胞瘤（All)、WHO III级星形细胞瘤（AllI)、WHO II级少突胶质细胞瘤（Oil)、WHO III级少突胶质细胞瘤 (0III)、WH0 II级少突星形细胞瘤（0AII)、WH0 III级少突星形细胞瘤（0AIII)、或继发性 成胶质细胞瘤。
5. 诊断对象中异柠檬酸脱氢酶（IDH)基因中或（D)-2-羟基戊二酸（D2HG)脱氢酶基因 中的突变的方法，所述方法包括： a) 将所述对象的样品与试剂混合物接触，其中所述试剂混合物包含： ⑴溶剂， (ii) 具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧化态区分并且其中染料初始 以氧化态存在， (iii) 电子转移剂， (iv) (D)-2-羟基戊二酸脱氢酶，和 (v) 辅因子；和 b) 通过测量染料的还原态的生产检测（D)-2-羟基戊二酸，其中在对象的样品中存在 (D)-2-羟基戊二酸提示在所述对象的异柠檬酸脱氢酶（IDH)基因中或在（D)-2-羟基戊二 酸脱氢酶基因中的突变。
6. 权利要求5的方法，其中所述异柠檬酸脱氢酶（IDH)基因中的突变是IDH1基因或 IDH2基因中的突变。
7. 权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中可以荧光测定地区分染料的 还原态与染料的氧化态并且其中在步骤b)中经过荧光光谱学测量染料的还原态的产生。
8. 权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中可以比色地区分染料的还原 态与染料的氧化态并且其中在步骤b)中经过可见光谱学测量染料的还原态的产生。
9. 权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中染料是刃天青或四唑盐，优 选地XTT (2, 3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四唑-5-羧基苯胺，二钠盐）。
10. 权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中电子转移剂是心肌黄酶或 PMS(N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸盐）或麦尔多拉蓝。
11. 权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中在步骤a)中辅因子是NAD+或NADP+。
12. 权利要求11的方法，其中在步骤a)中酶是哺乳动物或原核生物（D)-2-羟基戊二 酸脱氢酶。
13. 权利要求12的方法，其中（D)-2-羟基戊二酸脱氢酶来自发酵氨基酸球菌 (Acidaminococcus fermentans)〇
14. 权利要求1、2或5中的任一项的方法，其中样品是组织、组织切片、生物活组织检 查、细胞、细胞裂解物、血样品、血清样品、血浆样品或尿样品。
15. 试剂盒，其包含（i)溶剂，（ii)具有氧化态和还原态的染料，其中还原态可以与氧 化态区分并且其中染料初始以氧化态存在，（iii)电子转移剂，（D)-2-羟基戊二酸脱氢酶， 和辅因子。
【文档编号】C12Q1/00GK104145022SQ201380011978
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年3月1日 优先权日:2012年3月1日
【发明者】J·巴尔斯, S·普施, A·冯戴姆灵, W·布克尔 申请人:德国癌症研究中心, 鲁普莱希特-卡尔 海德堡大学