使用低聚氧代哌嗪非肽螺旋模拟物对低氧诱导基因表达的控制的制作方法
【专利摘要】本发明涉及模拟HIF-1α中C端转录激活结构域的螺旋αB的低聚氧代哌嗪。本发明还公开了含有这些低聚氧代哌嗪的药物组合物和使用这些低聚氧代哌嗪的方法(例如，减少基因转录、治疗或预防由HIF-1α与CREB-结合蛋白和/或p300的相互作用介导的病症、减少或预防组织中的血管新生、诱导细胞凋亡和减少细胞存活和/或增殖)。
【专利说明】使用低聚氧代脈嗪非肽螺旋模拟物对低氧诱导基因表达的 控制
[0001] 本申请要求2012年2月16日提交的美国临时专利申请序列号61/599, 763的权 益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
[0002] 本发明是在美国政府支持下，根据美国国家科技基金会（National Science Foundation)授予的批准号CHE-0848410来完成。美国政府享有本发明的某些权利。 发明领域
[0003] 本发明涉及低聚氧代哌嗪，其包括实质上模拟低氧诱导因子1 α中C端转录激活 结构域的螺旋a B的序列。
[0004] 发明背景
[0005] 如图1所例示，血管新生，即新血管的诱导，是正常生长以及各种病症发病机理的 关键。在癌症中，血管新生加速实体瘤的生长并且通过新形成的脉管系统来为转移提供通 路。对比来说，治疗性血管新生对减少组织局部缺血的影响和预防器官衰竭来说是重要 的。血管新生的过程受许多特异性促分裂原的严密控制，其中血管内皮生长因子（VEGF) 和其受体起着关键作用。VEGF水平在大量的肿瘤中被上调并且在致癌信号传导中起着关 键作用。在细胞和组织中，VEGF基因的转录通过低氧诱导因子来调节。这些低氧诱导因 子中，低氧诱导因子1( "HIF-1"）是大多数器官中氧依赖性转录的主要调节剂并且负责增 加低氧诱导基因的表达。HIF-I由氧敏感性α亚基和组成型表达β亚基组成。在富氧条 件下，HIF-Ια 被轻基化（Ivan 等，"HIFa Targeted for VHL-mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing,，'Science 292:464-8(2001))、 泛素化并且通过泛素-蛋白酶体系统降解。在低氧情况下，HIF-I α是稳定的并且易位 到核中，其中与它的组成型表达结合配偶体，即芳基烃受体核易位蛋白（"ARNT"）（Wood 等，''The Role of the Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) in Hypoxic Induction of Gene Expression, J. Biol. Chem. 271:15117-23 (1996))的 异源二聚化引起与关联低氧反应元件（"HRE"）的结合（Forsythe等，"Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor l，"Mol. Cell. Biol. 16:4604-13(1996))。然后异二聚体募集转录辅激活因子 p300、CBP和SRC-1，从而引起低氧诱导基因的上调。对低氧诱导因子活性的调节包括 三个关键步骤：（i)抑制两个脯氨酸残基的羟基化以排除HIF-I α与pVHL(泛素连接酶 复合物的一部分）相互作用，从而防止HIF-la的蛋白酶体破坏；（ii)通过因子抑制 HIF-Ια ("FIH"）抑制Asn803 的轻基化（Lando 等，"FIH-1 Is an Asparaginyl Hydroxylase Enzyme That Regulates the Transcriptional Activity of Hypoxia-inducible Factor, "Genes & Develop. 16:1466-71(2002))，以便允许辅激活因子的募集，从而触发 低氧诱导基因过表达，所述低氧诱导基因包括编码以下的基因：血管生成肽，如VEGF和 VEGF受体VEGFR-I (Flt-I)以及VEGFR-2(KDR/Flk-1);以及牵涉变化能量代谢的蛋白， 如葡萄糖转运蛋白GLUTl和GLUT3,以及己糖激酶1和2 (Forsythe等，"Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1，"Mol.Cell.Biol. 16:4604-13(1996) ;0kino 等，"Hypoxia-inducible Mammalian Gene Expression Analyzed in Vivo at a TATA-driven Promoter and at an Initiator-driven Promoter，''J.Biol.Chem. 273:23837-43(1998));以及（iii)启动子结 合的HIF-Ia/I β与辅激活因子蛋白P300(或同源CREB结合蛋白，CBP)的相互作用，从而 导致转录的上调。
[0006] 口300/08?的富含半胱氨酸-组氨酸结构域1("011"）与!11?-1〇的(：端转录 激活结构域（"C-TAD786- 826"）之间的相互作用（Freedman 等，"Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1 α，，'Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 99:5367-72(2002) ;Dames 等，"Structural Basis for Hif-I a/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response，''Proc.Nat，I Acad. Sci. USA 99:5271-6(2002)) 介导低氧诱导基因的转录激活（Hirota & Semenza，"Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor I, Cri t. Rev. Oncol. Hematol. 59 : 15-26 (2006)； Semenza，"Targeting HIF-1 for Cancer Therapy，''Nat. Rev. Cancer 3:721-32(2003)) (参见图2A)。如图2A至图2C所例示，结构研究为这种转录因子-辅激活因子的相互作 用提供了分子学基础，并且从HIF-Ia中鉴定出两种短α-螺旋结构域，它们是P300识 别 HIF-1 a 的关键决定族（Freedman 等，"Structural Basis for Recruitment of CBP/ p300 by Hypoxia-Inducible Factor-1 a ,nProc. Nat'l Acad. Sci. USA99:5367_72(2002); Dames等，"Structural Basis for Hif-I a /CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response，"Proc.Nat' I Acad. Sci.U.S.A. 99:5271-76(2002))。这些结构域的合成模拟 物可抑制HIF-1 α /P300或HIF-1 a /CBP复合物形成并且调节转录。有助于两个螺旋之一 (PDB代码1L8C，残基139-147)的结合的关键残基在图2C中示出。
[0007] 因为HIF-1 a C-TAD与转录辅激活因子p300/CBP的相互作用是转录应答中的显 著扩增点，所以这种相互作用由设计过的蛋白配体的破坏是抑制癌症中的有氧糖酵解和血 管新生（即新血管的形成）的有效手段（Hirota & Semenza，"Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor I, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59 :15-26 (2006)； Rarnanathan 等，"Perturbational Profiling of a Cell-line Model of Tumorigenesis by Using Metabolic Measurements，''Proc. Nat' I Acad. Sci.USA 102:5992-7(2005); Underiner等，"Development of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor(VEGFR) Kinase Inhibitors as Anti-angiogenic Agents in Cancer Therapy，，'Curr. Med. Chem. 11:731-45(2004))。虽然 HIF-1 a C-TAD 与 p300/CBP 的接触表面较大(3393 A2)， 但是对这种蛋白-蛋白相互作用的抑制并不需要直接进行干扰。取而代之，诱导对结合 配偶体（P300/CBP)中的一个的结构改变可足以破坏复合物（Kung等，"Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway，''Cancer Cell 6:33-43(2004))。
[0008] 虽然过去已经证明了使用小分子抑制核蛋白-蛋白相互作用是困难的（Aridn & Wells, "Small-molecule Inhibitors of Protein-Protein Interactions:Progressing Towards the Dream，" Nat. Rev.Drug Discov. 3:301-17 (2004))，但是对高亲和力蛋 白配体的筛选已取得一些值得注意的成果（Kung等，"Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway,，'Cancer Cell 6:33-43(2004) ;Issaeva 等，"Small Molecule RITA Binds to p53,Blocks p53_HDM_2 Interaction and Activates p53 Function in Tumors,，'Nat. Med. 10:1321-8(2004) ;Lepourcelet 等，"Small-molecule Antagonists of the Oncogenic Tcf/β -Catenin Protein Complex, ''Cancer Cell 5:91-102(2004) ；Vassilev 等，"In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2,''Science 303:844-8(2004) ;Grasberger等，"Discovery and Cocrystal Structure of Benzodiazepinedione HDM2 Antagonists That Activate p53 in Cells,，'J. Med. Chem. 48:909-12(2005) ;Ding 等，"Structure-based Design of Potent Non-peptide MDM2 Inhibitors, "J. Am. Chem.Soc. 127 :10130-1 (2005) ;Berg 等，"Small-molecule Antagonists of Myc/Max Dimerization Inhibit Myc-induced Transformation of Chicken Embryo Fibroblasts, "Proc· Nat，I Acad. Sci. USA 99:3830-5(2002) ;De Munari 等的国际专利公布号WO 2006/066775)。两种小分子--毛壳素 I (Hauser等，"Isolation and Structure Elucidation of Chaetocin，，Tielv· Chim. Acta 53(5):1061-73(1970))和 毛壳菌素 2 (Waksman & Bugie, ^Chaetomin, a New Antibiotic Substance Produced by Chaetomium Cochliodes I. Formation and Properties,，'J. Bacteriol. 48:527-30 (1944)) 已被证明可抑制HIF-I a C-TAD与p300/CBP之间的相互作用并且衰减低氧诱导转录。尽 管初期的报道令人鼓舞，但是仍然需要进一步设计HIF-I途径的抑制剂，因为1和2两者在 实验动物中均已诱发凝固性坏死、贫血、白细胞增多。鉴定出无副作用或副作用减小的其它 HIF-I途径抑制剂将是合乎需要的。
[0009] 本发明旨在克服本领域中的这些和其它不足。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明的一个方面涉及一种式I的低聚氧代哌嗪，其模拟HIF-I a中C端转录激 活结构域的螺旋a B :
【权利要求】
1. 一种式I的低聚氧代哌嗪：
Rp R2、R3和R4中的每一个独立地为氨基酸侧链、H、N(R) 2、OR、卤素、烷基或芳基；其中 各R独立地为H、烷基或芳基； 各R6独立地为H、N(R) 2、OR、卤素、烷基或芳基；其中各R独立地为H、烷基或芳基； A为X1或(：，其中： X1SlCOR'、CO2R'、CONR'、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基、用于保护胺的保 护基团、靶向部分或标签；其中R'为H、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基、靶向部分或标 签；并且 C为具有下式的部分
各X'独立地为H、COR'、CO2R'、CONR'、N(R" )2、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳 基、靶向部分或标签；其中： R'为H、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基、靶向部分或标签；并且 各R"独立地为H、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基、靶向部分或标签； Rtl为氨基酸侧链、H、N(R) 2、0R、卤素、烷基或芳基；其中各R独立地为H、烷基或芳基；并 且 R6 SH、N(R)2、0R、卤素、烷基或芳基；其中各R独立地为H、烷基或芳基；并且 B为OR'、COR'、N(R" ' )2、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基、用于保护羧酸的保 护基团、靶向部分或标签；其中： R'为H、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基、靶向部分或标签；并且 各R"'独立地为H、CO2R'、CONR'、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂芳基、靶向部分或 标签； 其中Ri和R2是疏水性的并且R4为氢键受体或氢键供体，或者A为具有式
的部分，Rtl和R3是疏水性的，并且R 4为氢键受体或氢键供体；并且 前提条件是不符合下列条件中的至少一个条件=R1为亮氨酸侧链，R2为亮氨酸侧链，以 及R4为谷氨酰胺侧链。
2. 根据权利要求1所述的低聚氧代哌嗪，其中R1和R2是疏水性的并且R4是氢键受体 或氢键供体。
3. 根据权利要求2所述的低聚氧代哌嗪，其中所述低聚氧代哌嗪是BB2-125或 BB2-162。
4. 根据权利要求1所述的低聚氧代哌嗪，其中A为具有式 和R3是疏水性的，并且R4是氢键受体或氢键供体。
5. 根据权利要求2所述的低聚氧代哌嗪，其中所述低聚氧代哌嗪是BB2-164。
6. -种药物制剂，其包含： 根据权利要求1所述的低聚氧代哌嗪，和 药学上可接受的媒介物。
7. 根据权利要求6所述的药物制剂，其中R1和R2是疏水性的并且R4是氢键受体或氢 键供体。
8. 根据权利要求7所述的药物制剂，其中所述低聚氧代哌嗪是BB2-125或BB2-162。
9. 根据权利要求6所述的药物制剂，其中A为具有式
的部分，Rtl和R3 是疏水性的，并且R4是氢键受体或氢键供体。
10. 根据权利要求9所述的药物制剂，其中所述低聚氧代哌嗪是BB2-164。
11. 一种减少细胞中基因转录的方法，其中所述基因转录由低氧诱导因子Ia与 CREB-结合蛋白和/或p300的相互作用介导，所述方法包括： 使所述细胞在有效减少所述基因转录的条件下与根据权利要求1所述的低聚氧代哌 嗪接触。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述基因选自由以下组成的组：a 1B-肾上腺素 能受体、腺苷酸激酶3、肾上腺髓质素、醛缩酶A、醛缩酶C、碳酸酐酶IX、血浆铜蓝蛋白、趋化 因子受体类型4(CXCR4、融合素、⑶184)、(：，的、内皮素-1、烯醇化酶1、促红细胞生成素、葡 萄糖转运蛋白1、葡萄糖转运蛋白3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、血红素加氧酶1、己糖激酶1、 己糖激酶2、IGF结合蛋白UIGF结合蛋白3、胰岛素样生长因子2、乳酸脱氢酶A、赖氨酰氧 化酶、单胺氧化酶同工型A、单胺氧化酶同工型B、氧化氮合酶2、？21、？35?、磷酸果糖激酶、 磷酸甘油酸激酶1、纤溶酶原激活物抑制剂1、丙酮酸激酶M、基质细胞衍生因子1、运铁蛋白 受体、运铁蛋白、转化生长因子P3、丙糖磷酸异构酶1、血管内皮生长因子、血管内皮生长因 子受体FLT-I和血管内皮生长因子受体KDR/Flk-1。
13. -种治疗或预防受试者中由低氧诱导因子Ia与CREB-结合蛋白和/或p300的相 互作用介导的病症的方法，所述方法包括： 在有效治疗或预防所述病症的条件下向所述受试者施用根据权利要求1所述的低聚 氧代哌嗪。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述病症选自由以下组成的组：器官发育异常、 铁摄取异常、铁代谢异常、氧转运异常、血管收缩异常、血管舒缩张力异常、有氧糖酵解、老 年性黄斑变性、攻击行为、血管新生、癌症、抑郁症、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、 桥本氏脑病、子宫内生长迟缓、心肌梗塞、嗜铬细胞瘤、肺部高血压、视网膜缺血和哮喘。
15. -种减少或预防组织中的血管新生的方法，所述方法包括： 在有效减少或防止所述组织中的血管新生的条件下使所述组织与根据权利要求1所 述的低聚氧代哌嗪接触。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述方法在体外进行。
17. 根据权利要求15所述的方法，其中所述组织是肿瘤。
18. -种诱导细胞的细胞凋亡的方法，所述方法包括： 在有效诱导所述细胞的细胞凋亡的条件下使所述细胞与根据权利要求1所述的低聚 氧代哌嗪接触。
19. 一种减少细胞存活和/或增殖的方法，所述方法包括： 在有效降低所述细胞存活和/或增殖的条件下使所述细胞与根据权利要求1所述的低 聚氧代哌嗪接触。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞是癌细胞或含在含有癌细胞的组织的 内皮脉管系统中。
【文档编号】C12N15/63GK104334541SQ201380012057
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年2月19日 优先权日:2012年2月16日
【发明者】P·S·阿罗拉, B·奥伦宇克, B·B·刘, I·格瑞沙晋 申请人:纽约大学, 南加利福尼亚大学