用于瞬时转染完整植物的农杆菌的制作方法

用于瞬时转染完整植物的农杆菌的制作方法
【专利摘要】一种瞬时转染植物或植物上的叶的方法，包括使所述植物或所述叶与包含农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物。
DSM 25686
2012.02.23
【专利说明】用于瞬时转染完整植物的农杆菌 发明领域
[0001] 本发明涉及瞬时转染植物或植物上的叶的方法。本发明还涉及在植物中或在植物 上的叶中瞬时表达目的DNA序列的方法。另外，本发明涉及农杆菌（Agrobacterium)菌株。
[0002] 发明背景
[0003] 用于农业的当前基因工程方法均基于1983年首次阐明（Fraley等人1983 ; Barton等人1983)并自1996年商业化的作物物种的稳定基因修饰。尽管基于植物稳定遗 传转化的农业方法如今是现实并且是成功新实践的基础，但它具有多种限制，主要限制是 开发转基因作物所需的时间很长和成本高昂。参与植物生物技术的公司之间的一般共识是 取决于作物物种，研发过程需要8 - 16年，并且平均开发总成本估计在一亿和一亿五千万 美元之间。因为这些限制，自从发现植物遗传转化方法以来超过25年后，仅少量性状和少 数GM作物物种迄今已商业化。
[0004] 已知也可以使植物细胞和全株植物短暂再编程（即，没有新遗传物质稳定整合在 植物染色体上），并且瞬时方法例如病毒感染快捷。此类瞬时方法原则上可以允许非常快速 地调节植物代谢，有利于用户感兴趣的某些产物。此类方法要求已经被工程化以有效和安 全地转染植物的DNA或RNA载体（病毒或细菌）。早期尝试使用基于植物病毒的载体已经部 分获得成功，在于它们允许转染植物以制造高价值的重组蛋白质，例如某些生物药（Gleba 等人2007, 2008 ;Lico等人2008)。文献中已经描述利用病毒操纵其他性状例如输入性状 (例如除草剂抗性，Shiboleth等人2001 ;Zhang和Ghabiral 2006)，但病毒转染在感染的 宿主中引入如此多不想要的变化，从而不再继续寻求这类瞬时方法用于输入性状。瞬时方 法还可以围绕农杆菌（Agrobacterium)物种将其Ti质粒的部分转移给真核细胞（特别是 植物细胞）的能力进行构建。使用基于农杆菌的转染是用于遗传操纵例如遗传转化方案和 实验室瞬时转染试验的基础。基于农杆菌的转染的工业应用也局限于重组蛋白质制造，原 因是最佳应用条件（例如用细菌悬液对植物的真空渗入）不能在田间大规模使用，而用细 菌溶液喷洒地上部分或浇灌植物导致转染据推测非常小部分的植物细胞，并且先前研究根 本未解决这个具体问题。
[0005] 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌（A. rhizogenes)在世 界上广泛用于研究实验室中，用于植物的瞬时转染和稳定遗传转化。这些应用基于农杆菌 将遗传信息转移给真核细胞的能力。目前培养的许多转基因植物例如大豆、卡诺拉油菜和 棉，通过农杆菌介导的遗传转化产生。在瞬时转化和稳定转化之间的本质差异是：在稳定转 化的方法中,农杆菌递送的DNA最终整合到植物染色体中，并且随后由植物子代继承。此类 整合事件甚至在专门设计以提供植物细胞和细菌之间大量接触的实验室实验中是稀有的； 因此为了选择稳定转化体，不得不利用专用选择性筛选方法并且使用为最佳转化和再生成 完整植物而选择的特定植物外植体（富含分生组织）。因此，在这个科学领域积累的知识对 于对瞬时方法有兴趣的那些人而言价值有限，在瞬时方法中应影响植物体的许多细胞，但 不选择被转染的细胞。
[0006] 另一方面，瞬时转染仅考虑农杆菌驱动的向植物细胞核递送DNA的早期步骤以及 下述事实：此类递送的DNA分子可以在胞核中转录，甚至在DNA不整合到植物染色体的情况 下，这种表达导致植物细胞的瞬时代谢性再编程。已经将这种再编程开发成用于快速评价 不同遗传实验的实验工具。尽管存在关于农杆菌介导向植物细胞转移DNA的大量知识，但 是这种信息总是限于实验室规模的实验，并且因而迄今为止，极少尝试开发涉及农杆菌作 为DNA载体的工业规模应用。
[0007] 实验室应用的局限之一是：基于农杆菌的DNA递送要求难以或不可能在大田或大 规模应用的某些处理。在常见的瞬时实验中，将培养的植物细胞或植物部分（外植体）用 过量细菌处理，以提供最大程度的递送。在常见的研究实验中，人们还对如果按工业规模进 行则经济上不可行的表达水平感兴趣。一般而言，这个领域内进行的研究已使研究者引出 这样的结论：严重影响瞬时表达的参数是允许农杆菌与植物体内的植物细胞实现最佳相互 作用的那些参数。此类研究大多数利用真空渗入、注射入植物叶内或表面活性剂处理，弄创 植物表面（例如用刀片）、或其组合。事实上，正在开发不涉及（基于病毒）进一步扩增原 始DNA的用于商业生产重组蛋白质的基于农杆菌的转染方法的唯一团队是Medicago的团 队（D' Aoust等人2008, 2009 ;Vezina等人，2009)。他们的方法完全依赖于真空渗入作为 递送方法。然而，因为基于大大过量的细菌与植物细胞比，用于植物瞬时转染的当前实验室 方案不具有真正的转化价值，即，它们不能直接按工业水平重复。除了少数情况之外（例如 Vaquero等人，1999, D' Aoust等人，2008, 2009)，他们仍未定量地解决瞬时转染方法的效率 问题。（此类研究的例子是大量的，我们仅引用少数代表性例子：Li等人，1992 ;Liu等人， 1992 ;Clough 和 Bent，1998 ;De Buck 等人，1998, 2000 ;Chung 等人，2000 ;Yang 等人，2000 ; Zambre 等人，2003 ;Wroblewski 等人，2005 ;Lee 和 Yang，2006 ;Zhao 等人，2006 ;Shang 等 人，2007 Jones 等人，2009 ;Li 等人，2009 ;De Felippes 和 Weigel，2010)。
[0008] 目前尚在开发中的工业方法之一是magnifection，一种基于农杆菌真空渗入植物 叶的方法。magnifection法（由Icon Genetics GmbH注册为magn丨CON_*_商标且由几 项专利/专利申请覆盖）是一种用于植物中异源蛋白质表达的简单和可无限放大规模的 方案，该方案避免植物的稳定遗传转化，而依赖于由农杆菌以DNA前体形式递送到植物体 的多个区域（全身性递送）的病毒载体瞬时扩增。这种方法实质上是用携带编码病毒RNA 复制子的T-DNA的农杆菌的稀释悬液渗入完整成熟植物。在这个方法中，细菌承担初始感 染和全身移动的（以前是病毒）功能，而病毒载体提供细胞至细胞的（短距离）传播、扩增 和高水平蛋白质表达。放大（工业）形式围绕完全装配的病毒载体（而不是要求在植物中 装配的前载体）建立并且要求通过真空渗入将农杆菌高通量递送至完整植物的装置。该方 法可以放大，但它要求植物的地上部分在真空下浸入细菌悬液内（该过程涉及颠倒盆中或 盘中培育的植物），这是一个在以下方面造成限制的流程：可以按这种方式处理的生物量 的体积、该方法的通量、在处理前可以培养植物的方式，并且它还带来一些成本，这些成本 将该方法的用途限于高成本产品，例如仅仅用于重组生物药。magnifection法是有效的， 因为它允许转染所处理植物中的几乎全部叶细胞、或约50%的总地上植物生物量（剩余部 分是莖和叶柄）。该方法已经以许多方式优化，参见例如Marillonnet等人，2005。然而， 当前方法完全围绕细菌递送方法构建，例如注射到植物叶中或真空渗入（例如Simmons等 人，2009)、弄伤叶（Andrews 和 Curtis, 2005)，或将农杆菌倾入土壤中（'agrodrenching'， Ryu等人，2004 ;Yang等人，2008)，但是这些方法不能用于大量处理田间植物（在Gleba等 人，2004、2007、2008 中综述；Gleba 和 Giritch，2010、2011 ;Lico 等人，2008 ;我们研究组 的原著包括 Giritch 等人 2006 ;Marillonnet 等人，2004, 2005 ;Santi 等人，2006 ;和来自 其他研究团队的思路上相似的论文-Voinnet等人，2003 ;Sudarshana等人，2006 ;Gao等 人，2006 ;Mett 等人，2007 ;Lindbo, 2007a, b ;Plesha 等人，2007, 2009 ;Huang 等人，2006 ; Regnard 等人 2009 ;Green 等人，2009 ;Shoji 等人，2009)。
[0009] 在无真空渗入下对完整植物（在植物中）使用农杆菌处理的尝试已经产生极低数 目的初始转染的细胞，从而大大限制该方法的实际应用。另外，由于在瞬时转染系统中未选 择转染的植物细胞，如果避免真空渗入，则对于大规模应用而言，整个瞬时转染方法的效率 太低。另外，几个植物物种如大豆或油籽油菜难以由农杆菌转染，除非使用特定植物组织， 因而在植物中瞬时转染尚未明显程度地实现。
[0010] 发明简沭
[0011] 从现有技术出发，本发明的一个目的是提供在植物中瞬时转染的有效方法。本发 明的另一个目的是提供在植物中瞬时表达目的DNA序列的有效方法。另外，本发明的一 个目的是提供一种在不需要应用压力差以将农杆菌引入植物的细胞间隙内情况下允许大 (工业）规模（即，平行针对许多植物）使用农杆菌瞬时转染植物的有效方法。再一目的是 提供适用于这个目的的农杆菌细胞和菌株。
[0012] 这些问题由一种瞬时转染植物或植物上的叶的方法解决，所述方法包括使所述植 物或所述叶与包含以登录号DSM25686保藏的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的 细胞的悬液接触，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌 株CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物。
[0013] 还提供一种在植物中瞬时表达目的DNA序列的方法，所述方法包括使所述植物或 所述植物上的所述叶与包含以登录号DSM25686保藏的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍 生菌株的细胞的悬液接触，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌 株含有菌株CryX的vir质粒或所述vir质粒的衍生物。
[0014] 本发明也提供具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生 菌株，其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir 质粒或所述vir质粒的衍生物；或菌株CryX或所述衍生菌株的农杆菌细胞。
[0015] 本发明也提供具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX细胞或其衍生物，所 述细胞含有双元载体，所述双元载体含有在T-DNA中待转染至植物细胞的目的DNA序列，其 中所述双元载体可以编码来自菌株CryX的VirG蛋白或如下文定义的密切相关的VirG蛋 白。
[0016] 本发明还提供一种试剂盒，其包含：
[0017] -如上文定义的所述菌株或所述衍生菌株的农杆菌细胞和
[0018] -含有在T-DNA中待转染至植物细胞中的目的DNA序列的双元载体。
[0019] 该双元载体可以编码来自菌株CryX的VirG蛋白或如下文定义的密切相关的VirG 蛋白。
[0020] 本发明也提供菌株CryX的vir质粒和具有菌株CryX的染色体的农杆菌细胞。
[0021] 本发明还提供具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生 菌株（如本文定义）的含水细胞悬液，所述悬液具有最多I. IxlO6CfuAil悬液、优选地最多 4. 4xl05cfu/ml悬液和更优选地最多I. lxl05cfu/ml悬液的细胞浓度。
[0022] 本发明的发明人已经发现一种强烈增加农杆菌瞬时转染植物的效率的方式。发 明人已经鉴定了用广泛类型的植物在植物中瞬时转染时实现特别高的效率的农杆菌菌株 (农杆菌菌株CryX)。尤其地，与作为植物转化或转染的标准使用的其他农杆菌菌株如菌株 LBA4404或EHA105相比，菌株CryX实现高得多的植物中瞬时转染效率（参见Slater等人 的第 64 页，引自：Plant Biotechnology，第 2 版，Oxford University Press，2008)。发明 人还已经发现菌株CryX比相关的农杆菌菌株如Chry5/KYRT1实现更高的瞬时转染效率。另 夕卜，发明人已经发现，在chrysopine型或琥拍碱（succinamopine)型根癌农杆菌菌株中表 达VirG基因、尤其来自农杆菌菌株LBA4404的VirG基因或与来自LBA4404的VirG基因密 切相关的VirG基因时，可以获得特别高的转染效率。
[0023] 附图简沭
[0024] 图IA和图IB显示在实施例中使用的载体的带有目的DNA序列的T-DNA区域。 Pact2 :拟南芥（Arabidopsis)肌动蛋白2基因启动子；〇 :来自TVCV(芜菁脉明病毒（turnip vein clearing virus))的5'末端；RdRp:来自cr-TMV(感染十字花科植物的烟草花叶 病毒）的RNA依赖性RNA聚合酶可读框（ORF) ;MP :来自cr-TMV的移动蛋白ORF ;N :来自 cr-TMV的3'-非翻译区；Tnos或nos :胭脂碱合酶终止子；间断RdRp和MP ORFs中灰色区段 的白色区段表示插入这些ORF中以增加植物细胞胞质中RNA复制子形成可能性的内含子， 这在WO 2005049839中详述；⑶S :⑶S蛋白的编码序列；GFP :绿色荧光蛋白编码序列；fs : 消除细胞至细胞移动能力的移码；P35S :35S启动子；P19 :番茄丛矮病毒的基因沉默阻抑蛋 白（参见 Plant J. 33, 949-56) ;Tocs :ocs 终止子；LB :T-DNA 左边界；RB :T-DNA 右边界。
[0025] 图2显示不同根癌农杆菌菌株的瞬时转染效率的比较。照片显示UV光下感染后 4日（4dpi)的GFP荧光，所述GFP荧光归因于如实施例2中所述用稀释的农杆菌培养物注 射器渗入本塞姆氏烟草（Nicotiana benthamiana)叶后基于TMV的GFP表达。数字10' 10_3和10_4表示对600nm处OD = 1. 3的过夜农杆菌培养物的浓缩倍数，其分别对应于IO2倍、IO3倍和IO4倍稀释。用于渗入的缓冲液的组成是5mM MES、pH 5. 5和IOmM MgSO4。使 用同一植物的三片独立叶一式三份进行每次渗入。
[0026] (A)能够进行细胞至细胞移动的基于TMV的载体：TMV (MP) -GFP (pNMD560)。
[0027] (B)缺乏细胞至细胞移动能力的基于TMV的载体：TMV (fsMP) -GFP (pNMD570)。
[0028] 1-根癌农杆菌菌株AGLl ;
[0029] 2-根癌农杆菌菌株EHA105 ;
[0030] 3-根癌农杆菌菌株GV3101 ;
[0031] 4-根癌农杆菌菌株ICF320 ;
[0032] 5-根癌农杆菌菌株CryX ;
[0033] 6-根癌农杆菌菌株LBA4404 ;
[0034] 7-根癌农杆菌菌株LBA9402。
[0035] 图3展示virG基因过量表达对AGL1、EHA105、ICF320和GV3101菌株瞬时转染效 率的影响。来自GV3101和LBA4404菌株的携带N54D突变的VirG序列以及来自LBA4404菌 株的天然序列用于比较。照片显示UV光下感染后4日（图3A)和感染后6日（图3B)的 GFP荧光，所述GFP荧光归因于如实施例3中所述用稀释的农杆菌培养物注射器渗入来自 3个独立植株的年龄相同的本塞姆氏烟草叶后基于TMV的GFP表达。数字10_2、10_3和10_ 4显示降低600nm处OD = 1. 3的过夜农杆菌培养物的细胞浓度的倍数。因此，倍数10_2、10_3和1〇_4分别对应于IO2UO3和IO4倍稀释。用于渗入的缓冲液的组成：5mM MES、pH 5. 3和 IOmM MgCl2。在全部情况下使用能够进行细胞至细胞移动的基于TMV的载体。
[0036] I - GV3101 中的 pNMD560(无 virG);
[0037] 2-GV3101 中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0038] 3-GV3101 中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0039] 4-GV3101 中的 pNMD062(virG/LBA4404);
[0040] 5-ICF320 中的 pNMD560 (无 virG);
[0041] 6-ICF320 中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0042] 7-ICF320 中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0043] 8-ICF320 中的 pNMD062(virG/LBA4404);
[0044] 9-EHA105 中的 pNMD560 (无 virG);
[0045] 10-EHA105 中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0046] 11-EHA105 中的 pNMD063 (virGN54D/LBA4404);
[0047] 12-EHA105 中的 pNMD062(virG/LBA4404);
[0048] 13-AGL1 中的 pNMD560 (无 virG);
[0049] 14-AGL1 中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0050] 15-AGL1 中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0051] 16-AGL1 中的 pNMD062 (virG/LBA4404)。
[0052] 图4A和图4B显示virG基因过量表达对GV3101和CryX菌株瞬时转染效率的影 响。来自GV3101和LBA4404菌株的携带N54D突变的virG序列以及来自LBA4404菌株的 天然序列用于比较。照片显示UV光下感染后3、4、5日的GFP荧光，所述GFP荧光归因于如 实施例3中所述用稀释的农杆菌培养物注射器渗入来自3个独立植株的年龄相同的本塞姆 氏烟草叶后基于TMV的GFP表达。数字KT4和KT5表示对600nm处OD = 1. 3的过夜农杆 菌培养物的浓缩倍数。用于渗入的缓冲液的组成：5mM MES、pH 5. 3和IOmM MgCl2。使用能 够进行细胞至细胞移动的基于TMV的载体。
[0053] 1-GV3101 菌株中的 pNMD560(无 virG);
[0054] 2-GV3101 菌株中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0055] 3-GV3101 菌株中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0056] 4 - CryX 菌株中的 pNMD560 (无 virG);
[0057] 5-CryX 菌株中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0058] 6-CryX 菌株中的 pNMD063 (virGN54D/LBA4404)。
[0059] 图5显示使用注射器渗入本塞姆氏烟草叶时在过夜农杆菌培养物的从KT3至KT 7一系列稀释范围内CryX菌株和GV3101菌株瞬时转染效率的比较。数字10_3、10_4、10_ 5、10_6和KT7表示对600nm处OD = 1. 3的过夜农杆菌培养物的浓缩倍数。这些浓缩倍数分别对 应于103、104、105、106和10 7倍稀释。用于渗入的缓冲液的组成：在水中511111^、？115.3和 IOmM MgCl2。在感染后4日拍摄照片。
[0060] 1-GV3101 菌株中的 pNMD560(无 virG);
[0061] 2-GV3101 菌株中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0062] 3-GV3101 菌株中的 pNMD063(virGN54D/LBA4404);
[0063] 4_(：巧父菌株中的？匪0560(无￥化6);
[0064] 5-CryX 菌株中的 pNMD064(virGN54D/GV3101);
[0065] 6-CryX 菌株中的 pNMD063 (virGN54D/LBA4404)。
[0066] 图6显示使用农杆菌细胞悬液喷洒法测试不同农杆菌菌株瞬时转染大豆的结果。 将 PNMD2190 构建体（质粒骨架中的 35S:GUS ;35S:pl9 和 virGN54D/LBA4404)用于 AGL1、 EHA105, CryX和LBA4404菌株；将pNMD2180构建体（质粒骨架中的35S:⑶S ;35S:pl9和 virGN54D/GV3101)用于GV3101和ICF320菌株。在感染后11日针对⑶S活性进行叶的染 色。
[0067] (A)对于喷洒，将OD6tltl = L 3的液体农杆菌培养物用含有5mM MES，pH 5. 3 ;IOmM MgCl2和〇? 05 % (v/v) Tween? 20的缓冲液以I: io的比例稀释。
[0068] ⑶对于喷洒，将OD6tltl = 1. 3的液体农杆菌培养物以1:10、1:100和1:1000的比 例用按〇? 3% (w/v)浓度补充以Size 800的碳化硅粒子的（含有5mM MES，pH 5. 3 ;10mM MgCl2 和 0? 05% (v/v) Tween?: 20 的）缓冲液稀释。
[0069] 图7显示使用农杆菌细胞悬液喷洒法测试CryX菌株和EHA105菌株瞬时转染陆地 棉（Gossipium hirsutum L.)的结果。对于喷洒，将0D_= 1.3的液体农杆菌培养物用含 有 5mM MES，pH 5. 3 ;10mM MgCl2 和 0? 25% (v/v)Silwet L-77 的缓冲液以 1:10 比例稀释。 为了测试，使用构建体pNMD1971 (35S:⑶S ;35S:pl9)，pNMD2180(质粒骨架中的35S:⑶S ; 355卬19和￥1冗阳40/673101)和口匪02190(质粒骨架中的355:(^5;355:口19和 ￥1冗阳40/ LBA4404)。在感染后6日进行⑶S活性测试。
[0070] 图8显示使用能够进行细胞至细胞移动的基于TMV的载体（TMV-GFP，pNMD560载 体），对从不同实验室收到的两个根癌农杆菌Chry5/KYRT1菌株获得物的比较。照片显示 UV光下感染后4日（4dpi)的GFP荧光，所述GFP荧光归因于如实施例8中所述用600nm处 OD = 1. 3的经稀释过夜农杆菌培养物注射器渗入本塞姆氏烟草叶后基于TMV的GFP表达。 从肯塔基大学G. Collins博士实验室（列克星敦，美国）获得的菌株在每片叶的右侧上渗 入。来自细胞生物学和遗传工程研究所（ICBGE，基辅，乌克兰）的菌株在每片叶的左侧上渗 入。用于渗入的缓冲液的组成是5mM MES、pH 5. 5和IOmM MgSO4。使用同一植物的三片独 立叶一式三份进行每次渗入。
[0071] I-ICBGE 获得物（accession)，浓缩倍数 KT1 (10 倍稀释）；
[0072] 2-ICBGE获得物，浓缩倍数10_2 ;
[0073] 3-ICBGE获得物，浓缩倍数10_3 ;
[0074] 4-肯塔基大学获得物，浓缩倍数KT1 ;
[0075] 5-肯塔基大学获得物，浓缩倍数KT2 ;
[0076] 6-肯塔基大学获得物，浓缩倍数10'
[0077] 本发明的详细描沭
[0078] 在本发明中，将特定类别的根癌农杆菌菌株用于瞬时转染植物，如植物上的叶。这 种类别的农杆菌包含根癌农杆菌菌株CryX及其如下文定义的衍生菌株。根据布达佩斯条 约，将菌株CryX在2012年2月23保藏于DSMZ-德意志微生物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),位于德国茵霍芬街 7B(Inhoffenstra3e 7B)，38124布劳恩斯切魏格。已经赋予它登录号DSM25686。菌株CryX具有染色体整合的 利福平抗性。
[0079] 菌株CryX与已经在1991年由Busch和Puepke鉴定的源自菊花（Chrysanthemum morifolium)的农杆菌菌株Chry5相关。在他们的论文中，已经显示按常规的生物型 试验，该菌株是生物型I并且它在至少10个植物物种上产生肿瘤。已经将它表征为不 寻常的，原因在于它能够在大豆（Glycine max)上高效地形成大肿瘤并且出于这个原 因，它随后由众多研究小组在许多论文中进一步表征。Chry5不能利用章鱼碱或甘露 碱作为碳源；相反，它能够异化每种胭脂碱和琥珀碱的单种异构体，同时它对土壤杆菌 素84不敏感（Busch和Puepke, 1991)。此外，Chry5菌株诱导的肿瘤产生一个阿马多 里型冠瘿碱（Amadori-type opine)家族，其包括脱氧果糖基谷氨酰胺（Dfg)及其内酯 chrysopine (Chy) (Palanichelvam等人，2000)。已经显示Chry5的分离株含有至少两种质 粒，一种与pTiB6具有同源性。Torisky等人（1997)已经通过同源重组从Chry5的285-kb Ti质粒移除包含约4kb致癌性T-DNA的大约16. 5kb区段，部分地使该菌株卸甲。已经显示 这个缺失突变体（命名为KYRT1)是有效的载体生物，并且从那时起，这种部分卸甲的Chry5 衍生物已经由一些研究者使用。另外最近，Palanichelvamet等人（2000)已经开发出充分 卸甲的衍生物。
[0080] 在导致本发明的研究中，发明人已经首次测试了来自不同实验室的两个登录号的 Chry5/KYRT1。从G. Collins博士实验室（Torisky等人，1997)获得的菌株在我们的瞬时研 究中不显示胜过标准比较菌株EHA105和GV3101的任何优越性并从进一步研究排除。在另 一方面，已经发现来自细胞生物学和遗传工程研究所（乌克兰的基辅）的登录号在其瞬时 转染和表达效率方面异常有效并且已经在本发明中使用。将后一个登录号根据布达佩斯条 约在官方保藏机构DSMZ-德意志微生物保藏中心，位于德国布劳恩斯切魏格，以名称CryX 保藏，以反映如下事实：不存在关于它的清晰出处信息。
[0081] 首发论文和后续论文已经以更多细节表征了 Chry5菌株。这些研究的目的是标准 表征该菌株的分子生物学和遗传学，以及其诱导肿瘤以造成不同植物物种遗传转化的对比 性能力，以及其在农杆菌处理的外植体中造成瞬时表达的能力。下文简要总结这些研究的 结果。
[0082] 用来表征根癌农杆菌Chrv5的比较方法
[0083] 1 ?关于致瘤性的数据
[0084] 在Bush和Pu印ke (1991)的首发论文中，已经确立Chry5菌株能够在代表7个植 物科的10个植物物种上造成肿瘤。试验涉及相对于常见实验室菌株B6,半定量评价具有 这个菌株引起的肿瘤的植物的数目。各菌株之间在9个物种中的6个物种（甜菜、伽蓝菜 (kalanchoe)、金盖花（marigold)、向日葵、烟草和番爺）中不存在致瘤性的显著差异。与B6 相比，在羽衣甘蓝上，Chry5大约两倍更高效，并且在大豆上大约3倍更高效，而在豌豆上， 它或多或少地效率较低。Torisky等人（1997)提供关于肿瘤在烟草和番茄的茎上形成的额 外数据；在这项研究中，Chry5菌株和其部分卸甲的衍生物KYRTl已经与转化研究中经常使 用的两个其他农杆菌菌株比较，包括A281 (在C58染色体背景中含有B〇542Ti质粒的琥珀 碱型菌株）及其卸甲的衍生物EHA105菌株。已经在那项研究中显示，所用的原始Chry5菌 株和另一个琥珀碱菌株A281均是高度致肿瘤的，但部分失能的衍生物KYRTl和EHA105无 活性。
[0085] 2.关于使用部分失能和完全失能的菌株时转化效率的数据
[0086] Torisky等人（1997)展示了 KYRTl成功地转移P -葡糖醛酸糖苷酶（⑶S)基因 至烟草叶外植体中，产生可以再生成有活力植物的表达GUS的愈伤组织。在这些实验中， KYRTl菌株的转化效率与对EHA105所显示的转化效率大致相同。Grant等人（2003)发现 用于评价具有三个不同植物基因型的子叶外植体，就产生豌豆转基因植物而言，KYRT1菌株 平均三倍更有效于AGLl。
[0087] 在Palanichelvam等人（2000)的工作中，已经显示KYRTl衍生物仅部分地卸甲并 且含有全部致瘤性T右区域和T左区域的片段。然而，就稳定转化大豆而言，具有完全卸甲 的Ti质粒pKPSF2的Chry5衍生物（Palanichelvam等人，2000)较不高效，因为KYRTl菌株 保留了对植物外植体的某种激素效应，增强大豆中的体细胞胚发生（Ko等人，2004)。
[0088] 3.表征瞬时活性的数据
[0089] Torisky等人（1997)再次通过利用大豆子叶节外植体中⑶S表达的定量分析，首 次研究了 Chry5衍生物KYRTl引起的￠-葡糖醛酸糖苷酶转基因的瞬时表达。这些数据表 明与EHA105或GV3850相比时，KYRTl衍生物在造成瞬时表达方面大约2. 5倍更高效。对 于在顽抗性豆科植物兵豆（Lens culinaris M.)的子叶柄上产生瞬时￠-葡糖醛酸糖苷 酶（⑶S)基因（gus)表达而言，KYRTl比EHA105和C58C1平均2. 8倍更高效（Akcay等人， 2009)。在用KYRTl和两个其他常见的载体C58C1和EHA105处理后，Akbulut等人（2008) 已经测量源自受伤籽苗的外植体中的GUS活性。对GUS表达点的定量评价已经显示在16 小时吸液后，KYRTl和C58C1之间不存在统计显著差异，并且40小时后，KYRTl大约50%更 好，但是仅在两个测量点之一中如此。
[0090] 完整解释上文提及数据是困难的，因为不同作者使用不同的植物物种、不同的植 物外植体、不同的农杆菌菌株用于比较，并且基于三种不同的活性方法：致肿瘤性活性、遗 传转化效率和瞬时表达效率，得出他们的结论。植物细胞和农杆菌相互作用的过程非常复 杂，并且它涉及T-DNA-蛋白质复合物的转移、蛋白质如VirE2(通过独立分泌系统）的转 移、在植物细胞中瞬时表达T-DNA基因、所表达基因的激素效应、一些T-DNA分子整合入植 物染色体DNA等。这些中间过程的任一个可能影响最终结果；因此，关于致瘤性和关于转化 效率的数据未给出有关T-DNA转移及瞬时表达效率的信息。在另一方面，展示的关于瞬时 活性的数据有限并且观察到的轻微差异不是结论性的或实际上不相关。
[0091] 本文所述的方法及菌株和在上文描述的现有技术中使用的方法的主要差异是用 于瞬时表达研究的植物材料的不同生物学。尽管全部先前作者均使用体外培养或切下的富 含分生组织的植物外植体（最终目的是转化植物细胞并从所述转基因细胞再生出完整植 物的能力）如切下的胚、嫩籽苗的部分等，本发明涉及瞬时转染与农杆菌差异性相互作用 的完整、发育的植物。在完整植物上，农杆菌通过气孔（其在其他器官中和分生组织中不存 在）并且不通过植物外植体上的伤口进入叶。如之前提到，当处理植物外植体时，全部作者 无一例外地使用高细菌密度。
[0092] 本发明的菌株CryX含有至少部分卸甲的vir质粒。"卸甲的"意指vir质粒和其 宿主农杆菌不具有致瘤性，即，它不向植物细胞插入癌基因或用来生产冠瘿碱类的基因，因 为它不含有这类基因或它不能转移这类基因。vir质粒包含T-DNA转移至植物细胞中所需 的vir基因（毒力基因）。Vir基因和它们在T-DNA转移中的功能是本领域已知的并且例 如在 Slater 等人的书 Plant Biotechnology,第 2 版；Oxford University Press, 2008 中 总结；还见 Hellens 等人，Trends in Plant Science 5(2000)446-451。
[0093] 本发明的菌株CryX是双元菌株，S卩，T-DNA转移至植物细胞中所需的vir基因和 T-DNA位于分立的质粒上（参见例如关于双元农杆菌菌株和载体系统的Slater等人书籍和 Hellens等人文章）。在双元农杆菌菌株的情况下，含有vir基因的质粒在本文中称作"vir 质粒"或"vir辅助质粒"。含有待转染的T-DNA的质粒称作"载体"或"双元载体"。术语 "菌株"或"农杆菌菌株"涉及除双元载体之外的农杆菌组分。因此，本文中，不含有双元载 体并且在引入双元载体后的双元农杆菌菌株由相同的菌株名称提及。保藏的菌株CryX含 有vir质粒，但是不含有双元载体。
[0094] 本发明还涉及菌株CryX的衍生菌株。在一个实施方案（i)中，菌株CryX的衍生 菌株具有菌株CryX的染色体背景。它可以具有与CryX相同的染色体。在另一个实施方案 (ii)中，菌株CryX的衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒。在又一个实施方案（iii)中， 菌株CryX的衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒的衍生物，并且可以具有菌株CryX的染色 体。在实施方案（ii)中，菌株是双元菌株并且在引入含有目的T-DNA的双元载体后用于本 发明的方法中。在实施方案（i)和（iii)中，菌株可以是双元菌株。如果它们是双元菌株， 则这些双元菌株在引入含有目的T-DNA的双元载体后用于本发明的方法中。备选地，在实 施方案（i)和（iii)中，可以将在本发明的方法中待转移至植物细胞的T-DNA插入vir质 粒中，从而vir基因和T-DNA存在于一个相同的质粒分子上。然而，通常更便利并且因此优 选使用双元菌株。
[0095] 术语"染色体背景"是农杆菌转化或转染领域的标准术语（参见Hellens等人， Trends in Plant Science 5(2000)446-451)。它涉及所述农杆菌菌株除Ti质粒、vir辅 助质粒和双元载体之外的遗传物质。在一个实施方案中，菌株CryX的衍生菌株具有与菌株 CryX相同的染色体。与CryX的vir质粒相比，具有菌株CryX的染色体背景的衍生菌株可 以与CryX不同，例如，在vir质粒中不同。因此，菌株CryX的衍生菌株可以含有vir质粒， 所述vir质粒是菌株CryX的vir质粒的衍生物。
[0096] 可以通过比较来自菌株CryX的含有T-DNA的双元载体的T-DNA转移效率（或转染 效率）与含有CryX的vir质粒和相同双元载体的待测试菌株，实验地测试具有与菌株CryX 不相同的染色体的给定农杆菌菌株是否具有菌株CryX的染色体背景。如果待测试菌株实 现菌株CryX的至少70 %、优选地至少80 %的T-DNA转移效率，则认为它具有CryX的染色 体背景。转染效率可以如实施例2中所述那样确定。备选地，转染效率可以如实施例2中 所述那样，但使用编码不能够细胞至细胞移动的TMV-病毒复制子的双元载体如pNMD570确 定。T-DNA转移效率也可以通过如WO 2005049839中所述的原生质体计数法确定。在一个 实施方案中，具有菌株CryX的染色体背景的农杆菌菌株的染色体具有在碱基序列方面与 菌株CryX相同的染色体。
[0097] 当在具有与菌株CryX相同的染色体的农杆菌细胞中存在时，菌株CryX的vir质 粒的衍生物从这些细胞中存在的含有T-DNA的双元载体实现相似的T-DNA向植物细胞转中 的转移效率。出于这个目的，衍生性vir质粒具有与菌株CryX的vir质粒充分相似的vir 区。衍生性vir质粒可以编码菌株CryX的virG蛋白或密切相关的virG蛋白。优选地， 衍生性vir质粒含有菌株CryX的VirG基因。在一个实施方案中，衍生性vir质粒含有编 码CryX的以下毒力蛋白中至少两种毒力蛋白的基因：VirA、virG、VirBl-BirBlU VirCU VirDl、VirD2、VirD4、VirEl、VirE2、VirF 和 VirJ。在又一个实施方案中，衍生性 vir 质粒 至少含有编码CryX的以下毒力蛋白的基因：VirA、virG、VirD2和VirE2。在又一个实施方 案中，衍生性vir质粒含有完整的vir区，即，菌株CryX的vir质粒的全部vir基因。衍生 性vir质粒可以在质粒骨架方面不同CryX的vir质粒。例如，衍生性vir质粒可以具有不 同或额外的选择性标记基因或可以从vir区外部进一步缺失其他核酸部分。在一个实施方 案中，衍生性vir质粒是pKYRTl (US5, 929, 306)，尤其如果该衍生菌株具有与CryX相同的染 色体。
[0098] 可以通过以下方式实验地测试给定的vir质粒是否为本发明意义下的衍生性vir 质粒：在其他方面相同的条件下比较农杆菌菌株CryX和除了待测试的vir质粒之外具有菌 株CryX的染色体的农杆菌之间来自含有T-DNA的双元载体的T-DNA转移效率。在一个实 施方案中，含有本发明衍生性质粒的农杆菌实现菌株CryX的至少70%、优选地至少80%、 更优选地至少90% T-DNA转移效率。转染效率可以如实施例2中所述和如上文提到那样确 定。
[0099] 相对于CryX的virG蛋白而言"密切相关的virG蛋白"意指与CryX的virG蛋白 差异最多3个非保守性氨基酸置换或最多6个、优选地最多3个保守性氨基酸置换的virG 蛋白。非保守性氨基酸置换可以在与SEQ ID NO: 1的第6、7或106位置相对应的位置处， 所述SEQ ID NO: 1是来自农杆菌菌株LBA4404的VirG蛋白，全部其他氨基酸残基如SEQ ID NO: 1那样。此外，密切相关的virG蛋白可以在与SEQ ID NO: 1的第54位置相对应的位置 处具有天冬酰胺至天冬氨酸置换。保守性氨基酸置换可以在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的 第6、7和/或106位置处。
[0100] 本文中，保守性置换是置换以下四组中每个组内部的氨基酸残基：
[0101] -Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser、Thr
[0102] -Val、lie ;Leu、Met
[0103] -Lys Arg、His
[0104] -Phe、Tyr、Trp
[0105] 将全部其他氨基酸残基置换视为非保守的。
[0106] 本文中，"目的T-DNA"是在T-DNA左边界序列和右边界序列之间含有目的DNA序 列的DNA。目的T-DNA可以存在或可以已经通过亚克隆并入vir质粒如菌株CryX的vir质 粒中。在本发明的方法中，优选使用双元载体系统。因此，目的T-DNA优选地存在或将被并 入双元载体中。
[0107] 待用于本发明中的双元载体是包含待转染至植物细胞中的目的DNA序列的DNA分 子。目的DNA序列一般编码在转染植物的细胞中待表达的蛋白质或RNA。一般通过将含有 目的DNA序列的核酸构建体插入或克隆至前体双元载体的T-DNA内部的克隆位点中产生双 元载体，如农杆菌介导的植物转染中通常所做那样。在所述插入后，使核酸构建体旁侧分布 有T-DNA左边界序列和右边界序列以允许用所述T-DNA转染所述植物。在双元载体的T-DNA 中，目的DNA序列如此存在，从而在植物细胞中可表达。为此目的，目的DNA序列例如在所 述核酸构建体中一般处于植物细胞中有活性的启动子控制下。目的DNA序列的例子是编码 DNA病毒复制子或RNA病毒复制子或待表达基因的DNA序列。该基因可以编码在植物细胞中 待表达的目的RNA或目的蛋白质。病毒复制子一般也编码在植物中待表达的目的RNA或蛋 白质。除了目的DNA序列外，DNA构建体还可以包含其他序列，例如用于表达目的DNA序列 的调节序列。在本发明中可用的双元载体是技术人员已知的，例如从引言中引用的参考文 献、或从植物生物技术方面的教科书例如Slater, Scott和Fowler, Plant Biotechnology, 第2版，Oxford University Press, 2008中获知。双元载体一般具有允许在细菌如大肠杆 菌中选择的抗生素抗性基因。
[0108] 为了增加转染效率，双元载体可以在T-DNA外部包含在所述农杆菌菌株中可表 达的VirG基因。备选地，可以将额外质粒插入所述农杆菌菌株中，因而所述额外的质粒 含有在所述农杆菌菌株中可表达的virG基因（Pazour等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 6941-6945)。VirG基因优选地编码来自根癌农杆菌菌株LBA4404的VirG蛋白或 密切相关的VirG蛋白。另外，VirG蛋白可以在与SEQ ID NO: 1(即，来自根癌农杆菌菌株 LBA4404的VirG蛋白）的第54相对应的位置处具有N54D突变。来自另一个农杆菌菌株的 VirG 蛋白中的 N54D 突变由 Jung 等人，Current Microbiology 49(2004)334-340 描述。
[0109] 密切相关的VirG蛋白可以是
[0110] (i)包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列或SEQ ID NO: 1氨基酸序列的N54D突变体的氨 基酸序列的至少235个、优选地至少239个连续氨基酸的蛋白质；或
[0111] (ii)包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1或其N54D 突变体的氨基酸序列的不多于3个非保守性氨基酸置换和不多于10个保守性氨基酸置换； 或
[0112] (iii)包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列具有SEQ ID N0:1或其 N54D突变体的氨基酸序列的不多于20个、优选地不多于10个保守性氨基酸置换。
[0113] 在项（ii)和（iii)中，所述蛋白质优选地在与SEQ ID NO: 1的第54位置相对应 的位置处具有天冬酰胺或天冬氨酸残基。
[0114] 在上文提到的实施方案中保守性氨基酸置换的可能位置是SEQ ID NO: 1的第6、7、 18、35、38、42、44、66、69、73、81、86、89、97、106、107、122、124、133、135、143、147、150、165、 188、208、212、213、232、235和238位置，而在其他位置的氨基酸残基是如5￡0 1〇勵：1中的 那些残基。非保守性置换的可能位置是SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的第6、7和106位置。
[0115] 在需要蛋白质或RNA强烈表达或其中不关注病毒核酸在所述植物的细胞中高量 累积和可能不利影响植物健康的实施方案中，核酸构建体或目的DNA序列可以编码能在植 物细胞中复制的复制型病毒载体。为了复制，病毒载体含有可以由植物细胞中存在的核酸 聚合酶（例如从复制子表达的病毒聚合酶）识别的复制起点。在RNA病毒载体的情况下， 病毒复制子可以在DNA构建体已经引入植物细胞核后，在植物启动子的控制下通过转录从 该DNA构建体形成。在DNA病毒复制子的情况下，病毒复制子可以通过DNA构建体分布于 编码病毒复制子的序列侧翼的两个重组位点之间的重组而形成，例如，如W000/17365和WO 99/22003中所述。如果病毒复制子由DNA构建体编码，则优选RNA病毒复制子。在过去至少 15年已经在文献中广泛地描述DNA和RNA病毒复制子的用途。一些例子是Icon Genetics 的以下专利公开：WO 2008028661、TO 2007137788、TO 2006003018、TO 2005071090、TO 2005049839、W0 02097080、W0 02088369 和 WO 02068664。DNA 病毒载体的例子是基于双生 病毒的那些。对于本发明，优选基于植物RNA病毒、尤其基于正义单链RNA病毒的病毒载体 或复制子。这类病毒载体的例子是在实施例中使用的烟草花叶病毒（TMV)和马铃薯X病毒 (PVX)。基于马铃薯X病毒的病毒载体和表达系统在EP2061890中描述。许多其他植物病 毒复制子在上文提及的专利公开中描述。
[0116] 当实施本发明的方法时,可以通过常规方法如电穿孔,将在T-DNA中含有目的DNA 序列的双元载体引入含有vir质粒或其衍生物的农杆菌菌株中。将含有双元载体的菌株的 培养物随后在合适的培养基中培育，一般在用于选择含有双元载体的农杆菌细胞的选择剂 存在下培育，并且，任选地，传代培养以产生所需量的包含农杆菌细胞的水悬液。获得的悬 液可以用水、合适的缓冲液或培养基稀释至所需的浓度并且用于转染植物或植物上的叶。 备选地,如果T-DNA是vir质粒的部分，则将含有T-DNA的vir质粒通过常规方法如电穿孔 法引入农杆菌中并如对双元系统所述那样进一步处理。
[0117] 在本发明的方法中，使用在植物中转染。在植物中（in planta)意指对苗期后的 整株活植株、优选地对充分发育的植株实施所述方法，而非切下或体外培养的植物组织或 器官。优选地，所述方法平行适用于许多植株，如生长在田间的植株。
[0118] 所述植株可以在施加或不施加真空的情况下通过渗入与农杆菌细胞悬液接触。 在一个实施方案中，尤其当平行应用于多个植株时，植株可以通过喷洒与悬液接触。在本 发明方法中使用的含水悬液可以具有至多I. lxl09cfu/ml农杆菌细胞的浓度，其大致对应 于LB培养基中600nm处光密度1的农杆菌培养物。然而，由于本发明中实现的高转染效 率，可以使用低得多的浓度，这允许处理许多植物例如整幅农田，且无需巨大的发酵罐用于 农杆菌生产。因此，浓度优选地是至多2. 2xl07cfu/ml、更优选地至多I. lxl07cfu/ml、更优 选地至多4. 4xl06cfu/ml。在一个实施方案中，浓度是每毫升悬液至多I. Ixl06cfu。在又 一个实施方案中，浓度是至多4. 4xl05cfu/ml悬液，并且在又一个实施方案中，浓度是至多 I. lxl05cfu/ml 悬液
[0119] 为了避免根据cfu/ml确定细胞浓度，经常通过使用分光光度计测量600nm处的表 观光密度评估农杆菌悬液的浓度。此处，I. lxl07cfu/ml的浓度对应于600nm处0. 01的计 算光密度，其中计算的光密度定义为：用水或缓冲液稀释600nm处具有光密度I. 0的悬液 100倍。类似地，4.4叉106。;1!\1/1111、1.1叉106。;1!\1/1111、4.4叉10 5。;1!\1/1111和1.1叉105。;1!\1/1111悬液的浓 度分别对应于600nm处0. 004、0. 001、0. 0004和0. 0001的计算光密度，其中计算的光密度 定义为：用水或缓冲液分别稀释600nm处具有光密度I. 0的悬液250倍、1000倍、2500倍或 10000 倍。
[0120] 因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明提供一种在植物中瞬时表达目的DNA 序列的方法和用于此方法的农杆菌细胞悬液，所述方法包括使所述植物或所述植物上的所 述叶与包含农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触，其中所述衍生菌 株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒或所述vir质 粒的衍生物，其中所述悬液具有在前述两个段落的任一段落中提到的任一个最大农杆菌细 胞浓度。在这个实施方案中，农杆菌菌株优选地是含有双元载体的双元菌株，所述双元载体 包含在所述菌株CryX或所述衍生菌株中可表达的VirG基因。所述VirG基因可以编码来 自根癌农杆菌菌株LBA4404的具有SEQ ID NO: 1的VirG蛋白，或是来自根癌农杆菌菌株 LBA4404的virG基因编码的VirG蛋白的N54D突变体。
[0121] 可以将磨料纳入悬液中以增加转染效率。磨料是在农杆菌细胞的水悬液中基本上 不可溶的颗粒状材料。认为磨料，尤其如果与湿润剂一起使用时，可以削弱植物组织（例如 叶）的表面，从而促进农杆菌细胞渗入植物组织的细胞间隙中。关于可用于本发明中的可 能磨料、其粒度、浓度和可能的商业产品，参考以WO 2012/019669公开的国际专利申请并 且在此引用此公开关于磨料的公开内容。
[0122] 本发明的水悬液以含有农用喷雾辅助剂。喷雾辅助剂可以是表面活性剂或润湿 齐u。表面活性剂和润湿剂在本发明中具有多重优点。它减少水悬液中水的表面张力且致使 植物叶的蜡质表面对于农杆菌更具可透性。它还可以改善悬液的稳定性和减少悬液中磨料 的沉降。不具体地限制可用于本发明方法中的表面活性剂，并且它们在WO 2012/019669的 国际专利申请中公开。优选的表面活性剂是HLB值为12或更大、优选地至少13的非离子型 表面活性剂。作为非离子型表面活性剂，在本发明中最优选有机硅氧烷表面活性剂，例如聚 环氧烧改性的七甲基三娃氧烧。商业产品是来自GE Advanced Materials的Silwet L77? 喷雾辅助剂。
[0123] 表面活性剂如在WO 2012/019669中公开的那些可以单独或与两种或更多种表面 活性剂组合使用。尤其，优选的有机硅氧烷表面活性剂可以与其他表面活性剂组合。表面 活性剂在本发明水悬液中的总浓度可以通过实施比较性喷雾实验容易地测试，类似于如实 施例中所做那样。然而，通常，表面活性剂的总浓度可以是所述悬液的〇. 005-2体积％、优 选地0. 01-0. 5体积％、更优选地0. 025-0. 2体积％。因为表面活性剂的密度一般接近于 I. Og/ml，所以表面活性剂的总浓度可以定义为0. 05-20g/升所述悬液，优选地0. 1-5. 0g、 更优选地0. 25-2. Og/升所述悬液（包含磨料）。如果使用上文的有机硅氧烷表面活性剂例 如聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷，则用于喷雾的农杆菌悬液中的有机硅氧烷表面活性剂 的浓度可以是〇. 01-0. 5体积％、优选地0. 05-0. 2体积％。备选地，用于喷雾的农杆菌悬液 中的有机硅氧烷表面活性剂的浓度可以定义为0. 1-5. 0g、优选地0. 5-2. Og/升所述悬液。
[0124] 为了改善水悬液的物理特性，可以添加高度分散的亚微米规格的硅酸（二氧 化硅）或多孔聚合物例如脲/甲醛缩合物（Pergopak?)。尤其，在磨料的中位值粒度 为0. 1-30 之间或处于上文给出的那个范围的优选子范围之一内的情况下，可以将 高度分散的亚微米规格的二氧化硅添加至悬液。此处，亚微米规格的二氧化硅是具有 0. 01-0. 5 ii m、优选地0. 02-0. 5 ii m、更优选地0. 02-0. I ii m的中位值粒度的二氧化硅。高度 分散的硅酸例如Hi-Sil?233 (PPG Industries)可以有助于水悬液的摩擦特性（见Jensen 等人，Bull. Org.mond. Sante, Bull. Wld Hlth 0rg.41(1969)937_940)。这些试剂可以按 1 - l〇g/升本发明悬液的量掺入。
[0125] 农杆菌悬液的其它可能添加剂是维持用于喷雾的悬液的pH处在所需pH( -般在 4. 5和6. 5之间、优选地在5. 0和5. 5之间）的缓冲物质。另外，可以添加无机可溶性盐，例 如氯化钠，以调节悬液的离子强度。营养肉汤例如LB培养基也可以包含于悬液中。
[0126] 可以如下产生用于与植物接触的水悬液。在一种方法中，将含有在本发明的方法 中待使用的目的双元载体的农杆菌菌株或细胞接种到培养基中并生长至高细胞浓度。更大 的培养物可以用小体积的高浓度培养物接种以获得大量培养物。一般将农杆菌培育到与 600nm处至少1、一般约I. 5的OD值对应的细胞浓度。随后将这种高度浓缩的农杆菌悬液 稀释以实现所需的细胞浓度。为了稀释高度浓缩的农杆菌悬液，使用水。水可以含有缓冲 齐IJ。水还可以含有本发明的表面活性剂。备选地，可以用水稀释这种浓缩的农杆菌悬液，并 且在稀释步骤之后或期间添加任何添加剂例如表面活性剂和任选的缓冲物质。可以在稀释 之前、期间或之后添加磨料。然而，优选在添加磨料期间搅拌悬液以在农杆菌悬液中均匀地 分散磨料。稀释浓缩的农杆菌悬液的步骤可以在用于喷洒稀释悬液的喷雾器的喷雾罐中实 施。
[0127] 所述植物、尤其所述植物上的叶随后与农杆菌细胞悬液接触以实现植物细胞的瞬 时转染。如上解释，可以通过喷洒实施接触。在本发明方法中待使用的喷雾器主要取决于 待喷洒的植物的数量或面积。对于待喷雾一个或少数植物，可以使用如家居和园艺中广泛 使用的泵式喷雾器。这些喷雾器可以具有0.5-2升的喷雾罐体积。对于中等规模的施加， 可以使用手动操作的液压喷雾器，例如手柄操作的背负式喷雾器或手动操做的压力喷雾 器。然而，在本发明中实现的高转染效率使本发明完全可能转染许多植物，例如在农田上或 在温室中生长的植物。为此目的，可以使用动力操作的液压喷雾器，例如配备喷杆的拖拉机 载式液压喷雾器。使用直升飞机或飞机的空中施加技术也可能用于大的田块。全部这些类 型的喷雾器是本领域已知的，并且例如在G. A. Matthews的书籍"Pesticide Application Methods",第3版，Blackwell Science, 2000中描述。为了确保喷雾器的喷雾罐中的均质 悬液，可以在喷雾期间以规律间隔或连续振摇小尺寸或中等尺寸的喷雾器。大喷雾器例如 拖拉机载式喷雾器应在喷雾箱中配备搅拌器。
[0128] 考虑待喷洒的悬液中存在农杆菌细胞和磨料，在本发明中使用的喷雾器应当产 生至少具有细雾滴液滴大小的喷雾。另外，可以使用处在G.A.Matthews的"Pesticide Application Methods"，第 3 版，Blackwell Science，2000,第 74 页中所用的喷雾分类内的 中等雾滴或粗雾滴。本发明中喷雾的主要目的是用悬液润湿植物组织。因此，确切的液滴 大小并非关键。然而，转染效率可以通过以增加的压力向植物表面提供喷雾而进一步改善。
[0129] 在本发明的方法中，喷洒植物的至少部分。在一个重要的实施方案中，喷洒在田间 土壤中生长的植物，即不在可移动盆或容器中生长的植物。不能将此类植物颠倒并浸入用 于真空渗入的农杆菌悬液。喷洒植物的至少部分，例如叶。优选地，喷洒大多数的叶或整个 植物。
[0130] 本发明用于瞬时转染植物或用于以目的DNA序列瞬时转染，所述目的DNA序列随 后可以瞬时表达。术语"瞬时"意指不使用选择方法，所述选择方法使用例如选择剂和能够 脱毒所述选择剂的选择标记基因，在未转染的细胞或植物的背景下选择出用目的DNA序列 转染的细胞或植物。由此，一般不将转染的目的DNA序列稳定引入植物染色体DNA内。取 而代之的是，瞬时方法在恰好转染的植物中利用转染效应。
[0131] 本发明一般用于转染多细胞植物，尤其高等植物。单子叶植物和双子叶植物均可 以被转染，其中优选双子叶植物。用于本发明中的植物包括任何植物物种，优选农业和园 艺上重要的作物物种。用于本发明中的常见作物植物包括苜蓿、大麦、豆、卡诺拉油菜、豇 豆、棉、谷物、三叶草、莲、小扁豆、羽扇豆、粟、燕麦、豌豆、花生、稻、黑麦、草木樨、向日葵、 香碗豆、大豆、高粱、黑小麦、豆薯、藜豆、野豌豆（vetch)、小麦、紫藤和坚果植物。优选用 于实施本发明的植物物种包括但不限于禾本科（Gramineae)、菊科（Compositeae)、爺科 (Solanaceae)和舊薇科（Rosaceae)的代表。
[0132] 在本发明中使用的其它优选物种是来自下述属的植物：拟南芥属（Arabidopsis)、 剪股颖属（Agrostis)、葱属（Allium)、金鱼草属（Antirrhinum)、序属（Apium)、落花生属 (Arachis)、天门冬属（Asparagus)、颠煎属（Atropa)、燕麦属（Avena)、簕竹属（Bambusa)、 芸苔属（Brassica)、雀麦属（Bromus)、Browaalia、山荼属（Camellia)、大麻属（Cannabis)、 辣椒属（Capsicum)、鹰嘴豆属（Cicer)、藜属（Chenopodium)、菊苣属（Chichorium)、柑橘 属（Citrus)、咖啡属（Coffea)、薏该属（Coix)、黄瓜属（Cucumis)、南瓜属（Curcubita)、狗 牙根属（Cynodon)、鸭茅属（Dactylis)、曼陀罗属（Datura)、胡萝卜属（Daucus)、毛地黄属 (Digitalis)、薯截属（Dioscorea)、油掠属（Elaeis)、穆属（Eleusine)、羊茅属（Festuca)、 草莓属（Fragaria)、老鹳草属（Geranium)、大豆属（Glycine)、向日葵属（Helianthus)、萱 草属（Heterocallis)、橡胶树属（Hevea)、大麦属（Hordeum)、天仙子属（Hyoscyamus)、番 薯属（Ipomoea)、莴苣属（Lactuca)、兵豆属（Lens)、百合属（Lilium)、亚麻属（Linum)、黑 麦草属（Lolium)、百脉根属（Lotus)、番煎属（Lycopersicon)、Majorana、苹果属（Malus)、 芒果属（Mangifera)、木薯属（Manihot)、苜猜属（Medicago)、龙面花属（Nemesia)、烟 草属（Nicotiana)、驴食草属（Onobrychis)、稻属（Oryza)、黍属（Panicum)、天竺葵属 (Pelargonium)、狼尾草属（Pennisetum)、碧冬煎属（Petunia)、豌豆属（Pisum)、菜豆属 (Phaseolus)、梯牧草属（Phleum)、早熟禾属（Poa)、李属（Primus)、毛茛属（Ranunculus)、 萝卜属（Raphanus)、荼薦子属（Ribes)、蓖麻属（Ricinus)、悬钩子属（Rubus)、甘鹿属 (Saccharum)、Salpiglossis、黑麦属（Secale)、千里光属（Senecio)、狗尾草属（Setaria)、 白芥属（Sinapis)、煎属（Solanum)、高粱属（Sorghum)、钝叶草属（Stenotaphrum)、可可属 (Theobroma)、车轴草属（Trifolium)、胡卢巴属（Trigonella)、小麦属（Triticum)JH^S 属（Vicia)、紅豆属（Vigna)、葡萄属（Vitis)、玉蜀黍属（Zea)和莪利竹族（Olyreae)、早熟 禾亚科（Pharoideae)及其他。
[0133] 优选地，本发明的方法适用于双子叶植物如本塞姆氏烟草、烟草、棉、大豆、油籽油 菜、椒、马铃薯或番茄。
[0134] 在一个实施方案中，本发明的方法可以用于在一株植物中或在田间生长的许多植 物中产生目的蛋白。为此目的，可以在植物的所需生长状态，用包含农杆菌细胞的悬液喷洒 植物，所述农杆菌细胞含有所需的双元载体。如果主要目的是实现最高的可能表达水平并 随后收获植物用于获得含有高量蛋白质的植物材料，则可以使用病毒载体，因为它们通常 广生最尚的表达水平。
[0135] 在另一个实施方案中，本发明的方法用于在植物中产生或改变性状例如输入性 状。在这个实施方案中，可能不希望目的蛋白质或RNA的过量表达以避免对植物健康的 有害影响。对于此类实施方案，优选非复制型载体（在本文中也称为"转录载体"），即缺 乏被植物细胞中存在的核酸聚合酶识别的功能性复制起点的载体。本发明的另一个应用 是RNA表达，例如用于RNA干扰，其中干扰信号可以在植物中从已表达信号的细胞传播到 其他细胞。一个例子是，如Pooggin在Nat. Biotech. 21 (2003) 131中所描述，在植物中对 不想要的病毒DNA打靶。可以适应于瞬时系统的癌基因沉默的一个例子由Escobar等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 13437-13442 描述。又一个例子是通过类似于 Baum 等 人，Nat. Biotech. 25 (2007) 1322-1326所描述的RNA干扰来控制鞘翅类病害昆虫，这可以 通过以下方式适用于本发明的瞬时方法：用编码dsRNA从而可以表达该dsRNA的目的DNA 序列瞬时转染害虫侵染的植物。适用于本发明瞬时方法的其它方法是Huang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 14302-14306 ;Chuang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 4985-4990 描述的那些。
[0136] 另外，本发明的方法允许在目的时间点及时改变性状，所述性状涉及调节开花时 间或果实形成，例如马铃薯中的块莖形成（tuborisation) (Martinez-Garcia等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(2002) 15211-15216)或利用转录因子调节类黄酮途径（Deluc 等人，Plant Physiol. 147(2008)2041-2053)。可以通过瞬时表达可移动性成花素蛋 白 FT 来诱导开花（Zeevaart，Current Opinion in Plant Biology 11(2008)541-547; Corbesier 等人，Science 316(2007) 1030-1033)。可以使用本发明和 Pandolfini 等人，BMC Biotechnology 2(2002)描述的方法在番爺中大规模产生单性果实。本发明还应用于通过 MYB转录因子改变棉纤维发育（如Lee等人，Annals of Botany 100 (2007) 1391-1401描述 的）或活化植物防御基因 （Bergey 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 12053-12058) 的情况。
[0137] 本发明还提供保护田间作物植物免遭害虫影响的方法。在这种方法中，可以从一 块田地或农田上生长的多株植物确定对至少一种植物的侵染。鉴于本发明方法的快速性， 只有确定害虫侵染时，才需要引起对害虫有害的蛋白质或RNA的表达。因此，在不存在侵染 风险的情况下，无需强烈和组成型表达害虫毒素或用于RNAi的dsRNA。在用携带相应的基 于PVX的表达载体的稀释农杆菌培养物喷雾后苏云金芽孢杆菌内毒素的瞬时表达保护了 本塞姆氏烟草植物不受烟草天蛾幼虫的采食损害（参见W02012/019660的图30)。 实施例
[0138] 参考实施例1 :根据菌落形成单位（Cfu)确定液体培养物中的农杆菌细胞浓度
[0139] 可以使用下述方案，根据菌落形成单位/ml液体悬液（cfu/ml)确定液体悬液中 农杆菌细胞的浓度。在含有25mg/L卡那霉素（AppliChem，A1493)和50mg/L利福平（Carl Roth，4163. 2)的7. 5ml液体LBS培养基中生长用构建体pNMD620转化的根癌农杆菌菌株 ICF 320的细胞。细菌培养物在28°C培育，伴随连续振摇。在600nm波长处使用分光光度 计，监测Iml培养物等分试样中以吸光度单位（AU)表示的细菌培养物的吸光度或光密度 (〇D_)。可以在OD6tltl值1 ;1. 3 ;1. 5 ; 1.7和1.8时，分析被估计为菌落形成单位数/毫升液 体培养物（cfu/ml)的细胞浓度。为此目的，将250 ill液体培养物等分试样用LBS培养基 稀释，以实现25ml最终体积（稀释度1:100)。将2. 5ml这种1:100稀释物与22. 5ml LBS 混合，以实现稀释度1:1〇〇〇。类似地制备液体培养物稀释物1:100 ;1:1，〇〇〇 ;1:1〇,〇〇〇 ; 1:100, 000 ;1: 1，000, 000 ;1:10, 000, 000 和 1:100, 000, 000。最后三个稀释物的等分试样涂 布在补充有25mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的琼脂固化LBS培养基上（250 ill细菌培养 物/90mm直径平板）。对于每个稀释度，一式三份进行等分试样的铺板。在28°C温育2日 后，对于每块平板计数细菌菌落。1: 1，〇〇〇, 〇〇〇和1:10, 〇〇〇, 〇〇〇稀释物的铺板分别产生每 平板数百个菌落和数打个菌落。由于稀释度1:100, 〇〇〇, 〇〇〇仅提供数个菌落/平板，所以 该稀释度不用于计算细胞浓度。根据下式估计细胞浓度：cfu/ml = 4x每平板菌落数X稀 释倍数。
[0140] 为了换算由600nm处吸光度量值（LB培养基中）所度量的细胞浓度和根据细胞形 成单位所度量的细胞浓度，本文中使用以下关系：1. 〇的OD6tltl对应于I. lxl09cfu/ml。
[0141] LBS培养某（液体）
[0142] 1%大豆蛋白胨（大豆柏的木瓜蛋白酶水解物；Duchefa，S1330)
[0143] 0.5%酵母提取物（〇11(：1^^3，￥1333)
[0144] 1 %氯化钠 （Carl Roth，9265. 2)
[0145] 溶解于水中，并且用 IM NaOH(Carl Roth，6771. 2)调节至 pH 7. 5
[0146] 为制备固体LBS培养基，向液体LBS培养基补充I. 5%琼脂（Carl Roth，2266. 2)。 将培养基在121°C高压灭菌20分钟。
[0147] 实施例1 :在下述实施例中使用的载体
[0148] 在这项研究中，我们使用基于TMV的和基于PVX的病毒载体以及基于35S CaMV启 动子的标准转录载体。
[0149] 基于Marillonnet等人（2006)中描述的载体产生了具有细胞至细胞移动能力的 基于TMV的载体pNMD560、pNMD062、pNMD063和pNMD064(图1A)。全部这些载体均设计 用于表达作为报道基因的GFP ;它们含有sGFP的编码序列的插入物，所述sGFP是来自维 多利亚多管发光水母（Aequorea victoria)的修饰绿色突光蛋白（GFP) (GeneBank登录 号EF030489)。pNMD560构建体按顺序含有来自拟南芥肌动蛋白2(ACT2)启动子的片段 (GenBank 登记号 AB026654) ;TVCV 的 5' 末端（GenBank 登记号 BRU03387,碱基对 1 - 5455) 和cr-TMV的片段[GenBank登记号Z29370,碱基对5457 - 5677,两者一起含有16个内含子 插入物];sGFP编码序列；cr-TMV 3'非翻译区（3' NTR;GenBank登记号Z29370)和胭脂 碱合酶（Nos)终止子。将整个片段克隆在双元载体的T-DNA左边界和右边界之间。
[0150] 基于pNMD560构建体产生pNMD062质粒。为此目的，通过PCR扩增以下DNA片 段并利用AfeI限制性位点插入质粒骨架中，所述DNA片段包含从5'末端侧翼存在序列 ctgtcgatc并且从3'末端侧翼存在序列aagatcgacag(SEQ ID N0:8)的来自根癌农杆菌 LBA4404菌株章鱼碱型Ti-质粒的VirG基因的编码序列和5'上游基因组区（GenBank登录 号 AF242881. 1，碱基对 160603 - 161600)。
[0151] pNMD063构建体与pNMD062除了 N54D突变不同外，其它均是相同的。
[0152] 为了产生PNMD064构建体，通过PCR扩增以下DNA片段并利用AfeI限制性位点插 入PNMD560构建体的质粒骨架中，所述DNA片段包含来自根癌农杆菌GV3101菌株胭脂碱 型Ti-质粒的VirG基因的含有N54D突变的编码序列和5'上游基因组区（GenBank登录号 AE007871. 2,碱基对 194307 - 193333)。
[0153] PNMD570构建体（缺乏细胞至细胞运动能力的基于TMV的载体）与pNMD560除了 MP-编码序列中导致MP翻译失真的可读框移码的点突变不同之外，其它均是相同的（图 1A)。
[0154] PNMD620构建体（用于GFP表达的无细胞至细胞和全身性移动能力的基于PVX的 载体）按顺序含有35S CaMV启动子、RNA依赖性RNA聚合酶的编码序列、包含25kDa、12kDa 和SkDa蛋白质的三重基因区段模块、sGFP编码序列和3'非翻译区。将整个片段克隆到双 元载体的T-DNA左边界和右边界之间（图1B)。
[0155] 全部转录载体均基于pICBV10(pBIN19衍生的双元载体）（Marillonnet等人， 2004,2006)产生。它们含有在相同T-DNA区的右边界和左边界内部插入的两个表达盒 (图1B)。在pNMD1971构建体的情况下，与右边界毗邻的表达盒按顺序包含花椰菜花叶病 毒（CaMV) 35S启动子、来自烟草花叶病毒的《翻译增强子、来自大肠杆菌的￠-葡糖醛酸 糖苷酶的编码序列（GenBank登录号S69414)，其含有来自矮牵牛（Petunia hybrids) PSK7 基因的内含子（GenBank登录号AJ224165. I，碱基对4411-4484)，和来自根癌农杆菌胭脂碱 合酶基因的终止子。第二表达盒在第一表达盒和T-DNA左边界之间插入。它按顺序含有花 椰菜花叶病毒（CaMV) 35S启动子，来自烟草花叶病毒的《翻译增强子、来自番茄丛矮病毒 (TBSV)的P19沉默阻抑蛋白的编码序列（GenBank登录号CAB56483.1)和来自根癌农杆菌 章鱼碱合酶基因的终止子。
[0156] 基于pNMD1971载体产生pNMD2180构建体。为此目的，将pNMD1971构建体的NotI/ NdeI片段替换为pNMD064构建体的相同片段，所述相同片段含有旁侧分布有5'上游基因组 区域的来自根癌农杆菌GV3101菌株的胭脂碱型Ti-质粒的virGN54D基因。
[0157] 以相似的方式产生pNMD2190。将pNMD1971构建体的Notl/Ndel片段替换为 PNMD063载体的相同片段，所述相同片段含有旁侧分布有5'上游基因组区域的来自根癌农 杆菌LBA4404菌株的章鱼碱型Ti-质粒的virGN54D基因。
[0158] 实施例2 :如果与常规使用的根癌农杆菌菌株相比，菌株CryX显示更强的本塞姆 氏烟草瞬时转染
[0159] 我们测试用于瞬时转染本塞姆氏烟草植物的根癌农杆菌菌株的数目，所述根癌农 杆菌菌株包括 AGL1、EHA105、GV3101、ICF320、CryX、LBA4404 和 LBA9402。为此目的，使用 无针头注射器，将植物叶用上述7个菌株的KT3和KT4稀释度的0D_ = 1. 3农杆菌培养物 渗入，所述菌株携带如图2A中所示的表达GFP的能够进行细胞至细胞运动的基于TMV的载 体（TMV-GFP，pNMD560构建体）。平行地，将叶用相同菌株的10_2和10_3稀释度的过夜农杆 菌培养物渗入，所述菌株携带如图2B中所示的缺乏细胞至细胞运动能力的基于TMV的载体 (TMV (f sMP) -GFP，pNMD570 构建体）。
[0160] 基于荧光点的密度和GFP荧光的强度，我们证明几个菌株（例如，AGLUEHA105和 LBA9402)的高效瞬时转染，然而如果与任何其他测试的菌株相比，对于两种构建体的全部 所测试稀释度的农杆菌培养物而言，CryX菌株的瞬时转染效率显著地更高。
[0161] 为了定量评价CryX菌株的瞬时转染效率，我们估计细菌悬液中在叶中渗入的细 胞数目和被视为单个转染事件的、产生的GFP荧光点数目之间的比例。为此目的,使用无针 头的注射器以200 ill 0D_ = 1. 3的农杆菌培养物渗入6周龄本塞姆氏烟草植物的叶，其 中所述农杆菌培养物用5mM MES、pH 5. 3和IOmM MgCl2组成的缓冲液按稀释倍数10_5、10_6和KT7稀释。CryX、EHA105、GV3101和ICF320农杆菌细胞携带构建体pNMD560 (TMV-GFP载 体）。为评价细菌细胞，将用于叶渗入的细菌悬液的100 等分试样一式三份涂布在含有 50iU/l利福平和50iU/l卡那霉素的LB琼脂平板上。将平板在28°C温育2日并且此后 计数cfu (菌落形成单位）数。根据我们的估计，100 ill CryX、EHA105、GV3101和ICF320 细菌培养物含有 7. 38+/-L 72、5. 00+/-L 50、2. 53+/-0. 87 和 6. 17+/-1. 37cfu (表 1)。平 行地在感染后4日，对本塞姆氏烟草叶评定GFP荧光点。平均而言，对于CryX，EHA105， GV3101和ICF320菌株，每100 ill KT7稀释度的渗入农杆菌培养物分别产生7. 38+/-1. 72、 5. 00+/-1. 50、2. 53+/-0. 87和6. 17+/-1. 37个荧光点。对于CryX菌株，每个农杆菌细胞产 生0. 46个转染位点，并且对于全部其他测试的菌株，产生0. Ol个转染位点，CryX菌株比 EHA105、GV3101 和 ICF320 菌株效率高 46 倍。
[0162] 表1在浓缩倍数10_7的农杆菌培养物时与其他菌株相比CryX的转染效率 (PNMD560构建体，感染后4日）。
[0163]
【权利要求】
1. 瞬时转染植物或植物上的叶的方法，包括使所述植物或所述叶与包含农杆菌菌株 CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触， 其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir 质粒或所述vir质粒的衍生物。
2. 在植物中瞬时表达目的DNA序列的方法，包括使所述植物或所述植物上的所述叶与 包含农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的细胞的悬液接触， 其中所述衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir 质粒或所述vir质粒的衍生物。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述菌株CryX或所述衍生菌株含有双元载 体，所述双元载体具有包含待转染入所述植物或叶的细胞中的目的DNA序列的T-DNA。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述菌株CryX或所述衍生菌株含有 卸甲vir质粒或卸甲Ti-质粒。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中菌株CryX的所述衍生菌株含有vir 质粒，所述vir质粒是菌株CryX的vir质粒的衍生物，并且所述衍生菌株实现T-DNA从含 有T-DNA的双元载体至植物细胞的转移效率是采用菌株CryX时的T-DNA转移效率的至少 70%。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中菌株CryX的vir质粒的所述衍生物 编码菌株CryX的virG蛋白。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中菌株CryX的vir质粒的所述衍生物含有菌株CryX 的vir质粒的vir区。
8. 根据权利要求3所述的方法，其中所述双元载体包含在所述菌株CryX或所述衍生菌 株中可表达的virG基因。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述virG基因编码来自根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株 LBA4404 的 SEQ ID NO: 1 的 VirG 蛋白、或来自根癌农 杆菌菌株LBA4404的virG基因编码的VirG蛋白的N54D突变体。
10. 根据权利要求1或2所述的方法，其中通过将目的T-DNA引入菌株CryX的vir质 粒中获得菌株CryX的vir质粒的所述衍生物。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中通过喷洒或者通过用所述悬液真 空渗入所述植物或者所述植物上的叶，使所述植物或者所述植物上的叶与所述悬液接触。
12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述植物是双子叶植物如本塞姆 氏烟草（Nicotiana benthamiana)、烟草、棉、大豆、油籽油菜、椒、马铃薯、番爺，或单子叶植 物。
13. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述农杆菌菌株CryX是具有DSM 登录号DSM25686的菌株。
14. 具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株，其中所述 衍生菌株具有菌株CryX的染色体背景或所述衍生菌株含有菌株CryX的vir质粒或所述 vir质粒的衍生物；或菌株CryX或所述衍生菌株的农杆菌细胞。
15. 根据权利要求14所述的农杆菌细胞，其中所述细胞还包含双元载体，所述双元载 体包含了含有待转染入植物中的目的DNA序列的T-DNA。
16. 试剂盒，其包含： -权利要求14中定义的所述菌株或所述衍生菌株的农杆菌细胞和 -含有在T-DNA中的待转染入植物细胞中的目的DNA序列的载体。
17. 具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX的Vir质粒。
18. 农杆菌细胞，具有DSM登录号DSM25686的菌株CryX的染色体。
19. 具有DSM登录号DSM25686的农杆菌菌株CryX或菌株CryX的衍生菌株的含水细胞 悬液，所述悬液具有最多1. lxl06cfu/ml悬液、优选地最多4. 4xl05cfu/ml悬液和更优选地 最多1. lxl05cfu/ml悬液的细胞浓度。
【文档编号】C12N15/82GK104334730SQ201380029089
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2012年4月3日
【发明者】P·勒默尔, L·波特西, D·泰德, A·吉里奇, Y·格莱巴 申请人:诺麦生物科学有限公司