膜归巢多肽瞬时转染的树突细胞及它们的应用的制作方法

专利名称：膜归巢多肽瞬时转染的树突细胞及它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及转染树突细胞的改良方法。更具体来说，本发明提供 了产生用膜归巢多肽瞬时转染的树突细胞的方法。在某些实施方案中， 树突细胞可在静脉给药后将抗原递送至淋巴结。
背景技术：
每年有超过50万的美国人死于癌症，每天超过1,500人。每4位 死亡的美国人中就有1位死于癌症。每年有超过200万的新i貪断的癌 症病例(参见American Cancer Society, Qwce厂Fa加朋J F/gwms* 200"。 对癌症患者有效的治疗成为了主要的挑战。典型的治疗方法包括手术 切除术、外线束辐射治疗和/或全身化学治疗。这些治疗方法已部分成 功地用于治疗某些类型的恶性肿瘤，但在其他类型的恶性胂瘤中并没 有产生令人满意的结果，并且它们对患者可具有引人注目及不希望的 副作用。
基于树突细胞的疫苗接种是一种相对新的癌症治疗方法，已显示 在某些病例中显示非常成功。树突细胞(DCs)是专职的免疫系统抗原呈 递细胞并且具有显著刺激免疫应答的潜力。在包括外周血的几乎所有 的组织中它们作为岗哨细胞(entmel cells),在外周血中它们不断地摄取 并加工它们所暴露的抗原。DCs随后迁移至引流'淋巴结，在此它们呈 递抗原至'淋巴细力包。未成熟DCs特別善于抗原纟聂取和加工，但生产性 (productive)T-细胞应答需要成熟且完全活化的DCs。非常少量的活化 DCs就能高效产生针对病毒、其他病原体以及内源性癌症的免疫应答。
对树突细胞免疫调节能力的开发有很大希望能用于癌症治疗。因 此，已进4亍了大量工作来开发用于治疗不同疾病和病症的DCs"疫苗"。 DC疫苗包含已负载抗原如肿瘤相关抗原的DCs。 一旦施用予患者，DC 疫苗就被认为诱导了针对带有所负载抗原的细胞的免疫应答，例如针 对带有该抗原的任何癌细胞的抗原特异性T-细胞应答。
然而，尽管早期的结果是有希望的，但至今尚未有DC疫苗被批准 用于治疗疾病或病症。为了正确地评价临床试-验的结果并提供能满足符合管理机构核准之严格要求的标准化治疗，需要细致的研究设计以
及使用标准化的临床和免疫学标准(参见如Figdor等.(2004) A^. A/ed. 10: 475)。对于基于DC的治疗，在临床试验中仍然需要评价许多重要 参数，并且如果这些参数单独或集体得到优化，则有可能提高DC疫苗 的有效性。因此，认识到需要开发并使用得以充分鉴定且标准化的DC 疫苗(参见如Figdor等.(2004)淑她d 10: 475)。
DCs可大量产生自血液来源的单核细胞(在本文中称为"单核细胞 来源的DCs"或"moDCs")并已在许多I期和II期临床试验中得到使 用。在大多数这些试验中，DCs经由皮内或皮下注射施用予患者(参见 如Markiewicz等.(2004) Ca匿〃證化22: 417-434; Gilboa和Vieweg (2004)/麵腳/iv. 199: 251-263; Paczesny等.(2003) 5"e膽.C騰er B/o/. 13: 439-447; Banchereau等.(2001) Ce〃 106: 271-274; Figdor等. (2004) A^/. A&6/. 10: 475-480)。然而，为了到达发生抗原特异性T-细 胞刺激的周围淋巴组织，DCs必须从注射部位迁移至引流淋巴结。不 幸的是，当DCs经由皮内或皮下注射施用时，它们迁移至局部淋巴结 (LNs)的效率非常低，以致于至多约1%-2%的DCs到达局部淋巴结(参 见如Ridolfi等.(2004)7>"m'/. A/W. 2: 27; de Vries等.(2003) Omcw
63: 12-17; Morse等.(1999) Omcer 59: 56-58)。这种效率低 的迁移造成了有效DC接种的主要障碍(参见如Rosenberg等.(2004) 淑她d 10: 909-915)。
经由皮内或皮下注射的另一个可能的缺点涉及外周组织对T细胞 的影响。越来越多的证据表明不同器官的淋巴结中的T细胞获得了在 与DCs接触后使T细胞靶向该器官而非提供遍及全身的更广泛分布的 归巢才莫式(hommg pattern)(参见^口 von Andrian等.(2000) iVew Ewg/. >/ A/ed 343: 1020-1034; Robert等.(1999) A^w五"g/.丄M^/. 341: 1817-1828; Campbell等.(2002),/.五jc尸.Met/. 195: 135-141; Dudda等. (2004),/. /mm丽o/. 172: 857-863; Dudda等.(2005)五紅《/. /mm丽o/. 35: 1056-1065)。实际上，已报道了其中皮内或淋巴内注射DC导致有效清 除大多数皮肤转移的DC疫苗接种策略(参见如Nestle等.(1998) Ato. Mec/. 4: 328-332; Thurner等.(1999)丄五孕.^fed 190: 1669-1678; Banchereau等.(2001) Qwcer61: 6451-6458)。
另一个可选择的用于将DCs递送给受试者的递送系统涉及直接注射入'淋巴结中。然而，该方法具有重大的风险和缺点。可注射入'淋巴 结中的疫苗体积是有限的，并且需要特殊装备及经验来产生效果。如 果该方法不能正确执行，则DCs可能无法递送至淋巴结，或甚至淋巴 结的结构可能遭到破坏。因此，该方法产生非常可变的结果是并不令
人惊奇的(参见如de Vries等.(2003) Ca"c" i 仏63: 12-17)。
迄今为止，其他递送方法也已被证实是无效的。例如，静脉注射
射的DCs无法从血液直接迁移至淋巴结中，并且会最先积聚在肺中并 随后积聚在肝、脾和骨髓中(参见如Morse等.(1999) C "cw W" 59: 56-58)。虽然该分布有利于Th2-极化的免疫应答，但该类型的免疫应答 并不利于癌症治疗(参见如Fong等.(2001) ./ /www朋/. 166 : 4254-4259)。
已知某些免疫细胞(如T细胞和某些树突细胞亚群)能从高内皮微 静脉(HEV)进入淋巴结(参见如Yoneyama等.(2005)/欣，/ T/ewWo/. 3: 204-207)。该迁移有可能是由各种细胞表面蛋白，包括E-选择蛋白、 L-选4奪蛋白、CCR7和LFA-1所促成的。CCR7和LFA-1蛋白也在来源 于单核细胞("moDCs")的成熟DCs上表达，但L-选才奪蛋白并不如此。 选择蛋白是对于白细胞归巢至特定组织重要的细胞表面分子(参见 Janeway， Jr.,等.,编.(2001) Immunobiology (第5版,Garland Publishing, New York))。
有几种类型的选择蛋白都享有共同的核心结构，但在它们的胞外 部分具有不同的凝集素样结构域。L-选择蛋白在幼稚T细胞上表达并 导引它们从血液迁移到外周淋巴组织中，而P-选择蛋白和E-选择蛋白 在感染部位的血管内皮上表达以募集效应细胞进入周围组织。L-选择 蛋白结合硫酸化唾液酰-Lewisx,即 一种称为血管地址素的粘蛋白样分 子的碳水化合物部分，其在血管内皮细胞表面上表达。还已知L-选择 蛋白结合周围淋巴结地址素(PNAd),其是在淋巴结中高内皮微静脉 (HEV)上高表达的。
L-选一奪蛋白(如登录号CAB55488或AAH56281)有时也称为 CD62L; E-选择蛋白(如登录号AAQ67702)有时也称为CD62E; P-选择 蛋白(如登录号AAQ67703)有时也称为CD62P。
Robert等.((2003) Ge脱77w. 10: 1479-1486)已指出可通过逆转录
6病毒转导而遗传修饰鼠DCs,使得DCs在它们的细胞表面上表达嵌合 的E/L选择蛋白(也参见美国专利第6,929,792号)。该嵌合的E/L-选择 蛋白将E-选择蛋白的蛋白酶抗性胞外部分与L-选择蛋白的胞内域相组 合，以便避免从富含蛋白酶的DC细胞表面脱落，与此同时保持有L-选择蛋白的结合特异性。当静脉注射表达该嵌合的选择蛋白的DCs到 受试者中时，它们能与外周淋巴结地址素结合并通过HEV迁移到淋巴 结。
然而，该方法具有一些明显的缺点，阻碍了将该方法用于人类治 疗。首先，通过逆转录病毒转导而修饰的细胞并不适于在人中治疗， 特别是基于管理机构的立场(参见如Haviernik和Bunting (2004) Cwr.
77zer. 4: 263-276)。 <吏用逆转录病毒转导最大的缺点在于前病毒 可随机整合入被转导细胞的基因组中，有可能破坏重要基因如与细胞 周期控制有关的那些基因的表达。该不幸事件的 一个众所周知的实例 发生在对严重联合免疫缺陷(SCID)的基因治疗临床试验中。在该试验 中，用含有编码在SCID患者中缺陷的共有Y链的基因的逆转录病毒载 体转导自身造血干细胞；在至少两个病例中，整合入LMO-2致癌基因 的前病毒导致患者白血病样症状(参见如Buckley (2002) /^mcW 360: 1185-1186; Hacem隱Bey-Abma等.(2002) M w 丄A^ t/. 346:
1185-1193; Marshall (2002) 5""e騰298: 34-35)。
使用逆转录病毒转导来产生DCs的另一个缺点在于转染效率易变 且逆转录病毒转导^又可用于分裂细胞，如来源于增殖的CD34+细胞的 DCs,并不能用于来源于非增殖性单核细胞的DCs(参见如Ardeshna等. (2000) S/: T/"ewWo/. 108: 817-824)。然而，CD34+干细胞的分离费时 且操作复杂，对于患者而言也是一种负担，因此通常优选其他替代方 案。
可用于转导非分裂树突细胞的替代方案包括慢病毒转导或腺病毒 转导。然而，慢病毒转导造成所导入分子的异源表达(参见如Dullaers等. (2004) 7kfo/. 7'/2e,: 10: 768-779; Breckpot等.(2003),/. Gewe 5: 654-667; S職誦to等.(2002),/./麵騰/. M"/z. 271: 153-165)。腺病 毒转导(参见如Korokhov等.(2005) Omcer B/o/. r/2e广4: 289-294; Ophorst等.(2004) 7"ccme 22: 3035-3044; Rea等.(2001) J. /附m簡o/. 166: 5236-5244)也造成所导入分子的异源表达(参见如Cho等.(2003)Kaccme 22: 224-236),并且可甚至导致调节T细i包而非有效的抗癌反 应的诱导(参见如Lundqvist等.(2005) J. /讀國L 28: 229-235)。
另一种已用于转导细胞的方法是RNA电穿孔。由于不会发生染色 体整合，因此该方法确保了仅发生瞬时蛋白表达；从而，该方法仅暂 时改变细胞的特性。RNA电穿孔非常适用于仅需要瞬时表达某些分子 的场合，例如DCs从血液靶向淋巴结并通过DCs呈递抗原。尽管结果 通常一皮混杂，但RNA电穿孔已和DCs —起使用(参见如Van Tendeloo等. (1998) 77zm 5: 700-707)。然而，如果使用优化的电穿孔法，则可 获得约95Q/o的高转染率(参见如Schaft等.(2005)丄/wmw"o/. 174: 3087-3097)。
至今为止，RNA电穿孔4又用于有限的场合中，例如用于递送抗原 (Ag)至DCs或增加DC的刺激能力(参见如Abdel-Wahab等.(2005)丄 Swrg. 124: 264-273; Dannull等.(2005)105: 3206-3213; Grunebach等.(2005) Qmcer Ge"e 77ze广12: 749-756; Cisco等.(2004) 丄//wmwo/. 172: 7162-7168)。虽然在这些研究中表达的蛋白显示能作 为涉及某些信号传递级联的信号传递受体或蛋白起作用，但所报道的 表达水平相当低。然而，为了获得能从血液迁移至外周淋巴结的DCs, 相信更高的细胞表面上蛋白的表达水平应当是必需的，而且这样高的 表达水平应当是困难的，但如果利用RNA转染则并非不可能实现。
因此，仍然需要产生在静脉施用后能归巢至淋巴结并可用作为疫 苗用于治疗各种疾病和病症的DCs的方法。
发明概述
本发明提供了产生瞬时表达膜归巢肽以及任选表达至少 一种额外 抗原的树突细胞("DCs")的改良方法。这些DCs具有在体内归巢至'淋 巴结的能力。在某些实施方案中，可经静脉施用这些DCs予患者并可 随后刺激针对目标抗原的免疫应答。本发明的方法和DCs具有治疗多 种疾病牙口病症的用途。
附图简述


图1表明在E/L-选4奪蛋白RNA电穿孔后DC细胞中E/L-选一奪蛋白 的高表达。成熟DCs用或不用E/L-选择蛋白(ELS)RNA电穿孔并在4 h后低温保存；然后解冻细胞并通过FACS分析在解冻后0h、 24h和48h 测定ELS表达。图(a)显示ELS RNA电穿孔的DCs(黑色直方图)和冲莫拟 电穿孔的对照DCs(灰色直方图)的ELS表达。对于每个时间点，图(a) 还提供ELS-阳性细胞的百分数及平均荧光强度(MFI)。所示数据代表三 次独立的标准化实^r。图(b)显示来自ELS RNA电穿孔的DCs(白色正 方形)和模拟电穿孔的DCs(黑色圆形)的DC产率。"产率"是电穿孔及 低温保存后与电穿孔前细胞数目相比的活细胞的百分数；通过台盼蓝 染色测定细胞的生存力。所示数据代表三次独立的标准化实验的平均 值+/-平均值标准误(SEM)。
图2表明ELS RNA转染的DCs保留它们的成熟表型。成熟DCs 用E/L-选l奪蛋白(ELS) RNA(灰色分布图)或不用ELS RNA(黑线)电穿 孔，^f吏之l争息4h，低温保存，解冻并对特有的成熟表面标志CD25、 CD80、 CD83、 CD86、 HLA I类和HLA-DR进行染色。虚线分别代表 每种标志的同种型对照。所示数据代表三次独立的标准化实验。
图3表明E/L-选择蛋白转染的DCs保留它们的CCR7-介导的迁移 能力。DCs用E/L选择蛋白RNA( "ELS RNA")电穿孔或无RNA才莫 拟电穿孔("无RNA，，)，并接着在标准的趋化孔(transwell)迁移实验(黑 条；"朝向")中测试它们的CCR7-介导的朝向含CCL19培养基的迁移 能力(参见实施例2)。通过在上室和下室中无CCL19(白条；"阴性 (neg.)")以及在上室中包括CCL19的另一种对照(灰条；"逆向(anti)") 的趋化孔中温育细胞测定自发迁移。显示了三次标准化实验的平均值 (+/- SEM)。
图4表明E/L-选择蛋白转染的DCs保留它们刺激幼稚CD8+ T-细 胞的能力。DCs不用RNA(空心圆形；"无RNA")、单独用E/L-选拷， 蛋白RNA(黑色圆形；"ELS")、单独用MelanA RNA(空心正方形； "MelARNA")或用MelanA和E/L-选择蛋白RNA组合(黑色正方形； "ELS+MelA RNA")电穿孔，并用于刺激自体幼稚CD8+细胞。此外， 将已模拟电穿孔或单独用E/L-选择蛋白RNA电穿孔的某些DCs用 MelanA-衍生的类似肽(MelA pep.)负载并用于刺激幼稚CD8+ T细胞。 在一周的刺激后，评价MelanA/A2-四聚体-结合的CD8+ T细胞的表型 (图(a))和细胞溶解能力(图(b))。功能性T细胞表型分类如下溶解效应 物("LE"; CD45RA+/CCR7—);效应物记忆("EM"; CD45RA7CCR7);
9中心记忆("CM"; CD45RA7CCR7+);幼稚("N，，； CD45RA+/CCR7+)。 利用负载MelanA类似肽或不相关的gpl00肽的T2细胞的粑，在标准 的Cr51 -释放测定中测定细胞溶解能力(b)。图(b)中所示数据是用MelanA 类似肽负载的T2耙细胞的溶胞百分数；对于所测试的所有T细胞群， 用gpl00肽负载的T2细胞的溶胞小于10%。耙:效应物比率(T:E)在水 平轴上显示。所示数据来自三次独立的标准化实验中的 一 次代表't生的 实验。
图5表明E/L-选择蛋白RNA转染的DCs得到了在唾液酰-LewisX-包被的载玻片上滚动的能力。来自三个人供体的DCs用E/L选择蛋白 RNA( "ELS RNA，，)电穿孔或不用RNA ("无RNA，，)电穿孔并低温 保存。然后解冻它们并Y吏用包一皮有唾液酰-LewisX的载玻片评^介它们在 平行平板流动腔(parallel plate flow chamber)中滚动的能力(参见实施例 4)。使用无脉冲泵(pulse-free pump)以1.04达因/s2的剪切速率在20°C 下进行灌注。在灌注期间，实时记录显微相差图像(描述了一张代表性 的图像(10x物镜))。在灌注10分钟后，记录四个不同的显微视野并对 每个视野的滚动(即粘附)细胞的数目进行计数。所示值是每个供体四个 视野细胞数目的平均值(+ASEM)。提供了 P-值，显示数据的统计显著 性(斯氏T-检验)。
图6表明已用E/L选择蛋白转染的DCs能在体内迁移入外周淋巴 结。鼠树突细胞(C57/B6，雌性)用E/L-选择蛋白RNA( "ELS RNA，，) 或不用RNA("无RNA")电穿孔，用5-二乙酸氯曱基焚光素(CMFDA) 染色，并注射入C57/B6雌性小鼠的尾部静脉中。注射后16小时，处 死小鼠并制备脾和外周淋巴结的冷冻切片(cryosections)。用CD90.2 (Thyl.2)/alexa555染色T-细胞区并通过荧光显微镜术分析冷冻切片。所 示照片是出自四次实验中的一次实验的器官的代表性区域(100 x物 镜)。
发明详述
本发明提供了产生瞬时表达膜归巢肽并具有在体内归巢至淋巴结 的能力的树突细胞("DCs")的改良方法。在某些实施方案中，本发明 提供了能产生(例如在静脉注射入患者后)能归巢至淋巴结的DCs群的 RNA电穿孔的改良方法。还提供了通过本发明的方法产生的DCs;这些DCs不含有逆转录病毒，并且通过该DCs的膜归巢肽的表达不会干 扰其他细胞表面蛋白的表达或功能。因此，本发明的DCs可用作为疫 苗用于治疗各种疾病和病症并可通过,争脉注射施用。因此，本发明还 提供了用DCs治疗患者的方法。
在某些实施方案中，使DCs -故转染以致于瞬时表达膜归巢多肽和 至少一种其他抗原(在本文中有时称为"目标抗原")。在静脉施用后这 些树突细胞可归巢至淋巴结，从而将所述的至少一种其他抗原递送至 -淋巴结。于此，DCs可将抗原呈递给T细胞并刺激免疫应答。
本发明改良的转染方法产生了高DCs转染率及高产率(甚至在低温 保存后)，并且还提供了非常高水平的转染核酸表达。以此方式，如通 过DCs在包被有膜归巢肽配体的表面上"粘连"(即"粘附")和/或"滚 动"的能力所证实的(参见例如实施例4),本发明第一次提供了功能性 表达膜归巢肽的DCs。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种 已用编码膜归巢多肽的RN A瞬时转染的分离的树突细胞，其中树突细 胞可在包被有膜归巢多肽配体的表面上滚动。因此，在某些实施方案 中，还提供了一种分离的DC。
DCs在体外对某些表面"粘连"、"粘附"和/或"滚动"的能力与 在静脉施用后DCs在体内/人血液迁移至、淋巴结的能力有关。对于表达 选择蛋白的DCs,如在操作实施例4中所证实的，可使用包被有唾液 酰-LewisX的表面，在平行平板流动腔实验中评价这些粘连、粘附和滚 动特性(也参见Robert等.(2003) Ge"e T7zera/ y 10: 1479-1486)。因此， 无论是在体外还是在体内，与合适的对照细胞相比，本发明的方法产 生了显示在包被有合适的配体的表面上增加的粘连、粘附和/或滚动的 DCs。
具体来说，"粘连"或"粘附"和"滚动"意在指处于溢出合适的 测试表面的培养基悬浮液中的已用编码膜归巢肽的RNA转染的DCs 会常常结合表面并以不大于培养基流速的20%的速度滚动。合适的测 试表面是包被有所导入的膜归巢肽能在体外或体内结合的物质或配体 的表面。因此，如果单个DC结合并在表面上以不大于培养基流速的 20%的速度滚动，则其被认为展示了 "粘连"或"粘附"和"滚动"特 性。如果与所观察到的在类似条件下滚动的对照细胞的数目相比，7见 察到多10倍的细胞结合并在测试表面的规定区域上滚动，则一群细胞^L认为展示了 "粘连"或"粘附"和"滚动"特性。因此，例如，如
果与在相同环境下的合适的对照细胞相比，如果多10倍的DCs结合并 以小于20%的流动速度在1-5达因/cm2的剪切力下在包被有唾液酰 -Lewisx的表面上前进，则 一群DCs展示了粘连和滚动特性。
对于本文中所描述的该实验以及其他测定法，合适的对照细胞是 没有用编码膜归巢肽的RNA转染的细胞。因此，例如，合适的对照细 胞可以是已模拟电穿孔的DC或可以是已用不编码膜归巢肽的RNA电 穿孔的DC。本领域技术人员熟悉选择和制备用于任何特定测定法的合 适的对照。
本发明的改良方法提供了许多会展示期望特性(即当DCs已用膜归 巢肽转染并使用包被有膜归巢肽配体的表面在平行平板流动腔实验中 进4亍纟全测时的粘连、粘附和/或滚动特性)的DCs。因此，例如与对照细 胞群(如才莫拟转染的DC或用不相关的RNA如编码EGFP的RNA转染 的DC)相比，在一群已根据本发明的方法转染(如用编码选择蛋白的 RNA电穿孔)的DCs中，至少多IO倍的细胞会在合适的测试表面上(如 在包一皮有唾液酰-LewisX的载玻片或高内皮樣il争脉上)粘连、粘附和滚 动。
本发明的DCs在静脉注射后能"归巢"至淋巴结，即从血液迁移 至至少一个、淋巴结中。因此，当本发明的DCs ,争月永注射时，在注射时 间之后的时间点例如至少1小时、2小时、4小时、8小时、18小时、 24小时、48小时或更久有可能在至少一个淋巴结中检测到本发明的 DCs。本发明的DCs可从高内皮微静脉("HEVs，，)中的血液中迁移出 来。
本发明的方法第 一 次提供了显示作为表面受体表达结果的改变的 迁移特性的DC群，该表达是细胞瞬时转染而非永久性遗传修饰的结 果。换言之，通过本发明的方法产生的DC群获得了新的所期望的特性， 与此同时避开了对基因组可遗传的遗传修饰的需要。以这种方式，本 发明使得用于多种用途的新的及改良的DC疫苗变成可能。
由于本发明的方法提供了在数量上及质量上优于之前已知方法所 产生的那些DCs的DCs，这就有可能治疗之前用DCs难治的疾病和病 症，例如转移性黑素瘤。应当理解虽然本发明可用于治疗存在的癌症， 但其还可用于预防癌症。本发明所提供的另一个优点是本发明的DCs并不仅靶向单个淋巴结，而是会归巢至多个淋巴结，预计其增加了 DCs
和T细胞之间的接触并因此产生更有效的抗原特异性T细胞刺激。
本发明所提供的又一个优点是本发明的DCs可通过静脉注射施用 予患者。业已报道了通过皮内或皮下注射施用DCs使得该DCs仅进入 皮肤-引流淋巴结，如此可赋予产生针对皮肤和皮肤有关的疾病和病症 的免疫应答的归巢模式，而非提供更普通的免疫应答。与此相反，静 脉施用使得DCs进入引流广语组织和器官的淋巴结，并因此能更有效 地用于诱导除皮肤之外的器官中及周围的免疫应答。
此外，本发明的方法提供了保持三种对于DC疫苗是重要的DCs 特征的DCs:成熟DC表型(即如实施例1中所证实的，高表达的CD80、 CD83、 CD86、 CD25、 HLA-I类，以及HLA-DR表达)；保持正常的 CCR7-介导的迁移能力(如实施例2中所证实的)；以及保持抗原特异性 T细胞刺激能力(如实施例3中所证实的)。
术语"树突细胞"(DCs)指存在于各种'淋巴样组织和非'淋巴样组 织中的形态学相似的细胞类型的不同的群(参见如Steinman (1991)」朋. Wev. /wmww /. 9: 271-296)。树突细胞是最有效和优选的抗原呈递细胞 (APCs)。树突细胞可分化自单核细胞或其他前体细胞并且具有与这些 前体所不同的表型。例如，单核细胞表达CD14抗原，而成熟树突细月包 则不表达。同样地，成熟树突细胞并非吞噬细胞，而单核细胞则是强 吞噬细月包。
月包表面标志。然而，表面标志可随成熟过程而改变。因此，当在本文 中使用时，"树突细胞"指表达至少一种表征成熟树突细胞的标志且不
成熟扭j"突细刃包能以高水平表达CD83而非CD14。表I细胞类型表面标志
造血干细月包CD34+
单核细胞CD14++, DR+, CD86+, CD16+/-, CD54+,
CD40+
未成熟树突细胞CD14+/-, CD16-, CD80+/-, CD83画，CD86+,
CDla+,
CD54+, DQ+, DR++
成熟一对突细月包CD14画，CD83++, CD86++, CD80++, DR+++,
DQ++,
CD40++, CD54++, CDla+/-
相对于未成熟DCs,目前优选成熟DCs用于免疫治疗。只有完全 成熟DCs缺少GM-CSF受体(GM-CSF-R)并在刚一除去GM-CSF时(即 在没有GM-CSF的情况下)就会保持稳定的成熟。已表明在体外和体内 诱导T细胞应答方面成熟DCs优于未成熟DCs,其可提供T细胞活化 和增殖必需的所有信号。与此相反，报道了未成熟DCs诱导调节性T 细胞并因此诱导体外以及体内耐受性(参见如Jonuleit等.(2000) A . 192:1213; Dhodapkar等.(2001) Exp. A/et/. 193:233)。成熟树突细 胞在体外或体内l聂取并呈递抗原至T-'淋巴细胞。本发明的抗原呈递DCs 和/或为这些DCs所驯化的T细胞(即已经由这些DCs呈递抗原至并因 此识别该抗原的T细胞)具有包括研究、诊断和治疗在内的许多应用。
成熟DCs难以从组织中提取，由于小于1%的白细胞属于该类别， 因此4艮难从外周血中分离成熟树突细胞。因此，已有许多针对/人其他 来源产生成熟树突细胞的方法的研究。开发了一些方法，可通过它们 由含DC前体细胞的合适的组织来源分离或制备未成熟DCs并在体外 分化产生成熟DCs。例如，合适的组织来源包括骨髓细胞、外周血 祖细胞(PBPCs)、夕卜周血干细胞(PBSCs)和脐带血细胞。优选地，组织 来源为外周血单核细力包(PBMC)。该组织来源可以是新鲜或冷冻的。在 某些方法中，细胞或组织来源用促进非干细胞或祖细胞生长及分化的 有效量的生长因子预处理，该非干细胞或祖细胞随后更易于与目标细胞相分离。这些方法为本领域所知并简要描述于例如Romam等.(1994) J. ￡jc/7. A^c/. 180: 83和Caux等.(1996)丄五jc尸.A/et/. 184: 695-706中。 在本发明的某些实施方案中，未成熟DCs分离自外周血单核细胞 (PBMCs)或其亚群。PBMCs可通过密度离心分离制备自除去白细胞的 产物或健康供体的全血。在白细胞介素4 (IL-4)和/或IL-13存在或不存 在的情况下，用有效量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理 PBMCs,使得PBMCs分化为未成熟DCs。在某些实施方案中，在 GM-CSF和IL-4存在的情况下培养PBMCs约4-7天，优选约5-6天， 以产生未成熟DCs。第一次成熟信号可在第4、 5、 6或7天，以及最 优选地在5或6天发出。此外，GM-CSF以及IL-4和/或IL-13可在 第一次和/或第二次信号传导时存在于培养基中。这样的方法是本领域 已知的。
通过在含GM-CSF和IL-4或GM-CSF和IL-13的培养基中培养， DCs可产生自外周血中常见的但非增殖的CDM+前体细胞(单核细胞) (参见如WO 97/29182; Sallusto和Lanzavecchia (1994) ,/. A/et/. 179:1109; Romam等.(1994)丄180: 83; Berger等.(2002)丄 /www脂/. A/e仇268: 131-140)。他人已报道了通过该方法产生的DCs 呈现相当的同质性，并可以未成熟状态或成熟(即完全分化的)状态产 生。可使用自体单核细胞条件培养基以刺激成熟(参见如Romam等. (1996)丄/ww朋o/. A/"/z. 196: 137-151; Bender等.(1996)丄/mmwwo/. A/e仇196: 121)获得完全成熟并不可逆地稳定的DCs或可利用确定的 成熟混合物(参见如Jonuleit等.(1997) 丄/附m頭o/. 27: 3135; Schaft 等.(2005)./. /m附丽o/. 174: 3087誦3097)获得。
虽然本发明的DCs通常制备自PBMCs或单核细胞，但树突细胞还 可制备自其它细胞例如CD34+千细胞。在本领域中已知许多用于分离 和扩增CD34+干细胞以及用于将它们分化为树突细胞的方法(参见如美 国专利第5,1",942号)。
CD34+干细胞可分离自骨髓细胞或通过用结合不需要的细胞如 CD4+和CDS+细胞(T细胞)以及CD4^细胞(全B细胞)的抗体淘选骨髓 细胞或其他来源而分离(参见如Inaba等.(1992)丄176: 1693-1702)。人CD34+细胞可获得自多种来源，包括脐带血、骨髓外才直 块以及动员外周血。可通过抗体亲和方法实现CD34+细胞的纯化(参见如Paczesny等.(2004)丄A/et/. 199: 1503-11; Ho等.(1995) Ce〃s 13 (suppl. 3): 100-105; Brenner (1993) J.//ew^oAer 2: 7國17;和 Yu等.(1995)尸亂淑7. Jed 92: 699-703)。
可通过将细胞用合适的细胞因子温育，使CD34+干细胞分化为树 突细胞。这样的方法是本领域已知的。例如，Inaba等.((1992) J. Med. 176: 1693-1702)描述了通过将干细胞用鼠GM-CSF温育从而鼠干 细胞体外分化为树突细胞。简言之，在标准的RPMI生长培养基中将 分离的干细胞用1-200 ng/ml鼠GM-CSF、优选约20 ng/ml GM-CSF温 育，每隔一天用新鲜培养基更换一次。任选地添加相似范围的IL-4。 在培养约5-7天后，如通过表面标志表达以及细胞形态学所评价的，许 多细胞是树突细胞。然后可通过荧光激活细胞分选术(FACS)或其他本 领域已知方法分离树突细胞。
还可在体外通过将细胞用人GM-CSF和TNF-a培养，使人CD34+ 造血干细胞分化(参见如Szabolcs，等.(1995) /mm丽o/. 154: 5851-5861)。人GM-CSF以类似的范围使用，TNF-a也可以大约相同 的范围添加以利于分化。任选地，以类似的剂量范围添加SCF或另一 种增殖配体(如Flt3)来分化DCs。 WO 95/28479还4皮露了 一种用于制备 树突细胞的方法分离外周血细胞并富集CD34+血前体细胞，然后用 造血生长因子及细胞因子组合扩增。
欧洲专利出版物EP-A-0 922 758披露了从多能细胞来源的未成熟 树突细胞生产成熟树突细胞，所述多能细胞具有表达巨噬细胞或树突
细胞特征的潜能。该方法需要将未成熟树突细胞与包含I fn - y的#对突细 胞成熟因子接触。欧洲专利出版物EP-B-0 633930教导了人树突细胞的
生产首先将人CD34+造血细胞用(1) GM-CSF、 (ii) TNF-a和IL-3或(iii) GM-CSF和TNF-a培养，以诱导CDla+造血细胞形成。美国专利公开 第2004/0152191号纟皮露了通过将树突细胞与RU 41740接触而4吏树突 细胞成熟。美国专利公开第2004/0146492号教导了一种生产重组树突 细胞的方法转化造血干细胞，接着通过在含GM-CSF的培养基中培 养将所述干细胞分化为树突细胞。美国专利公开第2004/0038398号才皮 露了由哺乳动物外周血制备基本上纯化的DCs群和单核细胞的方法。 骨髓样细月包分离自哺乳动物，DCs分离自该群，以产生分离的单核细 胞亚群。然后通过用抗-CD2抗体负选择以去除T细胞从而富集DCs 。素、PGE2和任选的TNF- a使树突细胞成熟的方法。
如本领域中所知的，用于将干细胞和单核细胞分化为树突细月包的 剂量范围是相似的。来自不同供应商以及甚至来自同一供应商不同批 次的细胞因子在它们的活性上都会有所差异。本领域技术人员能容易 地测定每种细胞因子活性，由此用于确定对于任何特定细胞因子的最 佳剂量。
本发明的DCs可来源于获得自人供体的细胞，或可来源于获得自 任何动物供体(例如来自小鼠或狗)的细胞。为增加包括人的动物中树突 前体细胞的数目，可用刺激造血的物质(即造血因子)预处理受试者。这 样的物质包括^旦不限于G-CSF和GM-CSF。可通过监测正施用因子的 个体的细胞分化确定待施用的有效量的造血因子。典型地，诸如G-CSF 和GM-CSF的因子的剂量应与用于治疗由细胞毒性剂处理恢复的个体 的剂量相似。作为一个实例，GM-CSF或G-CSF可在除去源组织之前 以标准剂量施用4-7天以增加一对突细月包前体的比例。美国专利第 6,475,483号教导了每日300貼剂量的G-CSF持续5-13天以及每日400 叱剂量的GM-CSF持续4-19天产生了数量非常多的树突细胞。
重组技术)、微生物学技术:细胞i物学技术、生物化学和免疫学技术，
所有的这些技术都是本领域已知的。例如，用于实施本发明的多种技 术描述于下歹'J出版物中Sambrook等.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2 版 (1989); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等.编.(1987)); 丛书Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR: A Practical Approach (M. MacPherson等.IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A Practical Approach (MacPherson, Hames和Taylor编.(1995)); Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow和Lane编.(1988)); Using Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow和Lane编.(1999))以及 Animal Cell Culture (Freshney编.(1987》。
当在本文中使用时，"用于转染"或"转染"指将一个或多个外源 核酸或多核苷酸导入细胞。转染包括以所述核酸或多核苷酸编码蛋白 可,皮表达的这样一种方式的导入。转染方法是本领域已知的并且包括多种技术例如电穿孔，利用基于蛋白质的、基于脂质的以及基于阳离 子的核酸递送复合物的方法，病毒载体，"基因枪"递送以及多种其他 技术。
在本发明的优选的实施方案中，导入DC的多核苷酸不在遗传上修 饰DC并且不是稳定地维持的。术语"遗传修饰的"指包含和/或表达 外源基因或核酸序列，所述外源基因或核酸序列随之改变细胞或其后 代的基因型，有可能还改变细胞的表型。换言之，其指对细胞内源核 苷酸的任何添加、缺失或破坏。所导入多核苦酸的稳定维持通常需要 该多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或整合入宿主细胞复制子 如染色体外复制子(如质粒)或细胞核染色体或线粒体染色体中。
当在本文中使用时，"瞬时转染的，，指细胞以转化细胞后代不遗传 所转化的遗传物质(如核酸或多核普酸)这样一种的方式已得以转化。遗 传物质可转录为RNA,并且该遗传物质所编码的蛋白可表达。这样的 表达在本文中称为瞬时表达。 一般而言，瞬时表达并不通过将转染的 遗传物质整合入染色体中而得以完成。
在本发明的某些实施方案中，树突细胞是使用RNA电穿孔瞬时转 染的。 一般而言，mRNA并不成为细胞基因组(染色体或染色体夕卜)的永 久部分。能用于瞬时表达期望抗原的任何其他方法也预期落入本发明 的范围内。所述方法不涉及基因组的永久改变(即不导致对细胞的可遗 传改变)并因此避免了与使用病毒如逆转录病毒和腺病毒转染有关的不 利。
虽然RNA电穿孔是本领域所知的，^旦可4吏用之前已知方法获得的 表达水平没有高到足以产生具有功能性表面受体表达水平的DC群。本 发明的方法包括已得到优化的RNA电穿孔方法，所述优化使得通过该 方法产生的DCs中表达水平类似于用病毒转染获得的水平，还避免了 病毒转染的不利。更确切地说，本发明的方法提供了这样的高转染率， 以致于至少60%、 70%、 80%、 90%或95%或更多的才艮据所述方法处理 的细胞包含至少某些用于转染的核酸或多核普酸。无论是在低温保存 之前还是之后(参见如实施例1),本发明的方法还才是供了至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%或更多活的及转染的树突细胞的高产率。因此， 本发明还提供了通过任何一种本文所描述的方法制备的富集的成熟 DCs群。在某些实施方案中，树突细胞在转染和/或低温保存之前是成熟的。在另一个方面中，本发明提供了一种用于分选富集的成熟DCs
群的方法，包括在合适的条件下将本发明的富集的树突细胞群与合适 的低温保存剂接触。
在致力于开发改良的电穿孔法的过程中，改变许多参数并进行评
价。对于这些实-险，用于电穿孔的RNA编码测试蛋白(增强型GFP， 或"EGFP")。 一般而言，在评价条件下，蛋白表达与所使用的RNA 浓度成正比，但与最高达60 x 106 DC/ml的浓度的细胞浓度无关。对于 人和鼠DCs,通常使用150貼/ml或约150貼/ml终浓度的RNA,例如 100、 125、 150、 175或200 jig/ml或约100、 125、 150、 175或200吗/ml 的浓度。对于人DCs,在电穿孔前将RNA与细胞在杯中一起温育约1、 2或3分钟。对于鼠DCs,尽管可任选地包括预温育步骤，但在电穿孔 前通常不将RNA与细胞一起在杯中预温育。
典型地，尽管可以使用其他细胞浓度，但将细胞以约4-6xl0 个细 胞/ml (人)或4-10xl07个细胞/ml (小鼠)的浓度重悬于无酚红的 OptiMEM(Gibco誦BRL, Long Island, USA)中。在0.5 ms和2 ms之间 蛋白表达与脉冲时间成正比，但2ms及更久脉冲时间，则更多百分数 的人细胞死亡。鼠DCs耐受2 ms脉冲时间，但在5 ms脉冲时间下死 亡。更高的电压通常更好，因为平均荧光强度(MFI)—其与表达的EGFP 的量成正比 一 随增加的电压而增加，〗旦更高的电压还增加了细力包死亡， 因此相较于其他参数所使用的电压对于成功而言较不重要。
本发明改良的RNA电穿孔法包括优化脉沖时间至产生高表达水平 同时不杀死太多DCs的值。具体来说，用于人DCs的改良的电穿孔条 件包括在Optimem培养基中于室温下使用电荷400V -600V的4 mm杯 以及0.8 ms-2 ms的方波月永沖。
通过将电荷除以杯的缝隙宽度测定场强；因此，例如使用电荷500V 与4mm杯产生了 125V/mm的场强，还可使用不同的电荷和杯宽度组 合获得场强。因此，本发明也提供了产生100 V/mm-150 V/mm场强的 电荷和杯宽度的其4也组合，例如产生100、 120、 125、 130、 140或150 V/mm场强的组合。因此例如，卩吏用4mm杯，改良的电穿孔条件包4舌 400V、 450V、 500V、 550V或600V或约400V、 450V、 500V、 550V 或600V的电荷，以及0.8、 1、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8或2 ms或约0.8、 1、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8或2 ms的方波脉沖持续时间。用于鼠DCs的最优化的电穿孔条件包括在Optimem培养基中于室 温下使用电荷500V与4 mm杯(即125 V/mm的场强)以及2 ms方波脉 冲。因此，对于鼠DCs的电穿孔，本发明也提供了产生100 V/mm-150 V/mm场强的电荷和杯宽度的其^也组合，例如，产生100、 120、 125、 130、 140或150 V/mm场强的组合。因此，例如^f吏用4mm杯，改良 的电穿孔条件包括400V、450V、500V、550V或600V或约400V、450V、 500V、 550V或600V的电荷和0.8、 1、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8、 2、 2.2、 2.4、 2.6、 2.8、 3、 3.2、 3.4、 3.6、 3.8、 4、 4.2、 4.4、 4.6、 4.8或5 ms 或约0.8、 1、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8、 2、 2.2、 2.4、 2.6、 2.8、 3、 3.2、 3.4、 3.6、 3.8、 4、 4.2、 4.4、 4.6、 4.8或5 ms的方波脉冲持续时间。
用于电穿孔的方波脉沖不同于指数式衰减脉冲并在本发明的方法 中提供了出众的结果。对于指数式衰减脉冲， 一般而言，电容器放电 至样品中，跨电极的电压快速上升至峰值电压，接着随时间的衰减， 具有指数式衰减波形(参见如Bio-Rad Instruction Manual for the Gene Pulser Xcell Electroporation System, Bio-Rad, Munich Germany)。 可 通过下列公式来描述指数式衰减脉冲
Vt = V0[e —(t/RC)]
其中Vt为在脉冲后时间二t毫秒处的电压，v。为电容器中的起始电压， e为自然对^:的底，R为电3各电阻(以欧姆表示)，以及C为电容(以樣吏法 拉表示)。
对于方波脉冲，通过设定细胞暴露于电场的时间直接控制l永冲持 续时间(即细胞暴露于电场的持续时间)。可通过在放电至样品后截断来 自电容的脉沖产生方波脉冲。在某些实施方案中，方波脉冲在脉冲结 尾具有较脉沖开始时更低的电压。可通过下列公式来描述方波脉冲
In (V。 / Vt) = t/ (RC) 其中变量如上所述。可给予方波脉冲的电穿孔装置是在商业上可获得。 例如，可使用Genepulser Xcell (Bio-Rad， Munich, Germany)。
本发明改良的RNA电穿孔法可提供已用RNA瞬时转染的DC群。 这样的细胞群可包含"i午多细胞例如至少1 x 106个细胞，或至少2 x 106、 3xl06、 4xl06、 5xl06、 6xl06、 7 x 106、 8 x 106或9 x 106个细月包， 或至少1 x 107、 2 x 107、 3 x 107、 4 x 107、 5 x 107、 6 x 107、 7 x 107、 8 x 107或9 x 107个细月包，或至少1 x 108、 2 x 108、 3 x 108或4 x 108个细胞。在某些实施方案中，在该细胞群中大多数的细胞(即至少60%、 70%、 80%、 90%、或95Q/o或更多)会以足够高的水平表达至少一种RNA编码 的肽以引起细胞群中表型改变，例如，在RNA编码选择蛋白的情况下， 体内归巢至淋巴结或在体外于包被有唾液酰-LewisX的表面上滚动的能 力。本发明的DCs和DC群可表达多于一种的转染的RNA编码的肽； 例如，它们可表达膜归巢肽以及可呈递至T细^^的目标抗原。此外， 它们可表达多于一种的目标抗原，或多种目标抗原。
当在本文中使用时，"膜归巢多肽"是一种能与另一表面(如细胞表
标l、。在某i实施方案中，膜归巢多肽结合高二皮微静脉表面上存在
的配体。合适的膜归巢多肽还可结合另 一种类型的血管如低位淋巴结 微静脉表面上存在的配体。任何膜归巢多肽只要其表达有助于表达其 的DC向淋巴结迁移，皆可用于本发明的组合物和方法中。可以理解膜 归巢多肽可在由转染的RN A翻译后被进 一 步加工或修饰。
在某些实施方案中，膜归巢多肽为选择蛋白。当在本文中使用时， "选择蛋白"是一种结合包括但不限于外周淋巴结选择蛋白("PNAd") 的特定糖蛋白上糖部分的多肽。PNAd指一组存在于淋巴结微静脉内 皮表面上的糖蛋白和/或复合糖(参见如美国专利第5,538,724号)。在某 些实施方案中，外周淋巴结地址素一皮定义为单克隆抗体MECA-79,其 识别唾液酸粘蛋白所携带的硫酸化寡糖；该表位与6-磺基-唾液酰 画LewisX重叠(参见如Rosen等.(2005) /.尸"Ao/. 166: 935-944; Streeter等.(1988)丄Ce〃. 107: 1853)。所述MECA-79抗体在商
业上可获得自BD Biosciences Pharmingen (San Diego， CA)。 可选地， PNAd被定义为L-选择蛋白结合的配体。L-选择蛋白通过选择性结合几 种存在于外周淋巴结的高内皮微静脉上的糖蛋白配体包括但不限于 GlyCAM-l (Sgp50)、 CD34 (Sgp-90)、 Sgp200、 MAdCAM隱l、 PSGL-1、 PCLP和PCLP-2得以识别(参见如美国专利笫6,929,792号和第 6,395,882号)。
"选择性结合"指通过ELISA测定所评价的， 一种分子(例如L-选择蛋白)与特定配体的结合比显示的与对照配体如牛血清白蛋白 (BSA)的结合高5、 7、 9、 10、 20或更多4咅以上。可选地，例如在美国 专利第5,484,891号中所描述的，可通过利用L-选择蛋白-IgG嵌合体沉淀来自在器官培养中用"S-硫酸盐标记的淋巴结的无机硫酸盐标记的 材料以测定L-选择蛋白的选择性结合。当在本文中使用时。"结合"指 分子可彼此共价或非共价结合。
因此，术语"选择蛋白"包括各种形式的天然选择蛋白如L-选择 蛋白、E-选择蛋白和P-选择蛋白，以及修饰形式的选择蛋白，包括那 些已被工程化以改变或除去存在于天然选择蛋白中的蛋白酶切割位点 的选择蛋白。术语"选择蛋白"还包括功能性嵌合蛋白如美国专利第 6,929,792号中所描述的E/L选3奪蛋白嵌合体，以及还包括组合来自不 同天然选择蛋白的部分或结构域的嵌合蛋白，例如包含天然人E-选择 蛋白的胞外域和天然人L-选择蛋白的跨膜和胞内域的嵌合分子("E/L-选才奪蛋白，，)(参见如Robert等.(2003) Ge"e 77ze广10: 1479-1486)。其 他天然选择蛋白的结构域是在本领域中已知的并且可组合入嵌合蛋白 中(参见如Smalley和Ley (2005)丄Ce〃. A/o/. 9: 255-266)。当在本 文中使用时，"嵌合体"或"嵌合蛋白"组合了来自一种蛋白的至少一 个结构域与来自另一种蛋白的至少一个结构域。所述蛋白可以是天然 的或它们可以是修饰的。
除非上下文另有明确说明，否则本文中使用时，单数形式"一个" 和"一种"和"该"包括复数形式。例如，术语"一种细胞'，包括多
种细胞，包括其混合物。除非另有明确说明，所有的数值表示，如pH、 温度、时间、浓度和分子量，包括范围，是以0.1增量(+)或(-)变化的
近似值。
当在本文中使用时，术语"包含，，意指组合物和方法包括所列举 的要素，但不排除其它要素。"基本上由……组成"当用于限定组合物 和方法时，指排除了对组合有任何重要意义的其它要素。因此，本文 中所定义的基本上由所述要素组成的组合物应不排除来自分离和纯化 方法的痕量污染物也不应排除药学上可接受的载体或其他通常使用的 添加剂，例如磷酸盐緩冲盐水、防腐剂等。"由......组成，，指排除了超
过痕量的其它成分要素或对于方法除那些明确提及的步骤以外排除了 实质上的方法步骤。由这些过渡术语的每一个所限定的实施方案都落 入本发明的范围之内。
当在本文中使用时，"分离的"指细胞与它们的天然环境相分离并 以足以容许鉴定和使用该细胞的量存在。当在本文中使用时，就树突血液等)移开。对于在本文中的应用如在疫苗中的应用，DC细月包培养 物可以是基本上纯的，但无需是纯的。
"免疫应答"广义地指淋巴细胞对外物质的抗原特异性反应。任 何可激发免疫应答的物质都被认为是"免疫原性的"，并称为"免疫原"。 所有免疫原都是抗原，但不是所有抗原都是免疫原性的。本发明的免 疫应答可以是体液介导的(经由抗体活性)或细胞介导的(经由T细胞活 化)。
术语"主要组织相容性复合物"或"MHC"指细胞表面分子编码 基因的复合物，所述细胞表面分子对抗原呈递至T细胞和快速移植排 斥是必需的。在人中，MHC也称为"人白细胞抗原，，或"HLA，，复合 物。由MHC编码的蛋白称为"MHC分子"，并分类为I类和II类MHC 分子。I类MHC分子包括膜异二聚化蛋白，其由在MHC中编码的、 与(32-微球蛋白非共价连接的01链组成。I类MHC分子由几乎所有具核 细胞所表达，并已表明其在抗原呈递至CD8+T细胞中起作用。人中的 I类分子包括HLA-A、 B和C。 II类MHC分子也包括由非共价締合的 a和p链组成的膜异二聚化蛋白。已知II类MHC分子在抗原呈递至 CD4+T细胞中起作用，并且在人中包括HLA-DP、 -DQ和-DR。
术语"抗原呈递细胞"(APCs)指一类能够以免疫系统特异性效应 细胞可识别的肽-MHC复合物形式呈递一种或多种抗原，由此诱导针对 所呈递的 一种或多种抗原的有效的细力包免疫应答的细月包。APCs可为完 整的全细胞如巨噬细胞、B-细胞、内皮细胞、活化T细胞和树突细胞； 或者可为天然存在的或合成的其它分子如与p2-微球蛋白复合的纯化的 MHC I类分子。虽然许多类型的细胞可呈递抗原至其细胞表面上供T-细胞识別，但只有树突细胞具有在适合于活化幼稚T-细胞的细胞毒性 T-淋巴细胞(CTL)反应的范围内如与适当的共刺激分子一起呈递抗原的 能力。
术语"免疫效应细胞"指能结合抗原并介导免疫应答的细胞。这 些细胞包括但不限于T细胞、B细胞、单核细胞、巨嗟细胞、NK细胞 和细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，例如CTL系、CTL克隆和来自肺瘤、 炎症或其他浸润物的CTLs。"幼稚"免疫效应细胞是一种从未暴露于 能活化该细力包的抗原的免疫效应细胞。幼稚免疫效应细力包的活化既需要肽:MHC复合物的识别，也需要专职APC同时传递共刺激信号，以 便增殖并分化为抗原特异性的、武装的效应T细胞。
当在本文中使用时，术语"驯化的"抗原特异性免疫效应细胞是 一种之前已遭遇抗原的免疫效应细胞。与其幼稚对应物形成对比，驯
物的识别就足够^:入术语"活化的"当用于;T细胞口时，意味着所述 细胞不再处于GO期，并开始产生一种或多种细胞毒素、细胞因子和表 征细胞类型(如CD8+或CD4+)的其它相关膜结合蛋白，并能够识别和 结合在表面上展示特定肽/MHC复合物的任何靶细胞，并释放其效应分 子。
"共刺激分子"涉及在抗原呈递细胞和T细胞的表面上表达的受 体-配体对之间的相互作用。过去几年内积累的研究结果已令人信服地 证实，静息T细胞需要至少两个信号用于诱导细胞因子基因表达和增 殖(参见如Schwartz (1990) Sc固ce 248: 1349-1356和Jenkms (1992) /mmw脂/. 7b^_y 13: 69-73)。 一个信号是赋予特异性的信号，可由 TCR/CD3复合物与合适的MHC/肽复合物的相互作用产生。另 一个信 号不是抗原特异性的并称为"共刺激信号"。该信号最初定义为由巨噬 细胞和树突细胞之类的骨髓来源的辅助细胞(所谓的"专职"APCs)所 提供的活性。
业已显示几种分子提供和/或增强共刺激活性。这些分子包括热稳 定抗原(HSA)(Liu等.(1992) J. Exp. Med. 175: 437-445)、碌,酸软骨素 修饰的MHC不变链(li-CS) (Naujokas等.(1993) Ce〃 74: 257-268)、胞 内粘附分子l(ICAM誦l) (Van Seventer (1990) ./. /附/mwo/. 144: 4579-4586)、 B7.1/CD80和B7.2/B70/CD86(Schwartz (1992) Ce〃 71: 1065-1068)。这些分子各自似乎提供和/或通过与T细胞上的其关联配 体相互作用帮助共刺激。共刺激分子在正常生理条件下介导必须的共 刺激信号，以实现幼稚T细胞的完全活化。 一个示范性的受体-配体对 是APCs表面上的B7共刺激分子家族及T细胞上的其反受体CD28或 CTLA-4(Fr醒an等.(1993) Scze騰262: 909-911; Young,等.(1992)丄 C/w./m;eW. 90: 229和Nabavi等.(1992) 360: 266-268)。其它
重要的共刺激分子为CD40和CD54。
术语"共刺激分子"包括任何单个分子或分子组合，其在与T细
24胞表面上与TCR结合的MHC/肽复合物一起起作用时提供共刺激作用， 该共刺激作用实现了对结合肽的T细胞的活化。该术语因此包括B7或 在抗原呈递基质如APC上的其它共刺激分子、其片段(单独的、与其它 分子复合的或为融合蛋白的一部分)，它们与MHC复合物一起结合关 联配体，当T细胞表面上的TCR特异性结合肽时导致T细胞活化。术 语"共刺激分子"还指与野生型或纯化的共刺激分子具有类似生物活 性的分子(如重组产生的或其突变蛋白)。
当在本文中使用时，术语"细胞因子"指对细胞施加各种作用(例 如诱导生长或增殖)的众多可溶性因子中的任何一种。在实施本发明时 可单独或组合使用的细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素 -2(IL-2)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、 白细胞介素-12(IL-12)、 G-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、白细胞介素-1 ct(IL-la)、白细胞介素-lL(IL-l 1)、 MIP-ll、 白血病抑制因子(LIF)、 c-kit配体、血小板生成素(TPO)和flt3配体。细 胞因子可市售自几个供应商例如Genzyme (Frammgham , MA)、 Genentech (South San Francisco, CA)、 Amgen (Thousand Oaks, CA)、 R&D Systems (Minneapolis, MN)和Immunex (Seattle, WA)。术语"细 胞因子"还包含与野生型或纯化的细胞因子具有类似生物活性的分子 (如重组产生的或其突变蛋白)。
术语"多核苷酸"、"核酸"和"核酸分子"可交换地用于指任何 长度的核苷酸的多聚形式。多核苦酸可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核 苷酸和/或其类似物。核苷酸可具有任意三维结构，并可执行任何已知 或未知的功能。术语"多核苷酸，，包括例如单链、双链和三螺旋分子、 基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、 tRNA、 rRNA、核酶、cDNA、 重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、 任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。除天然核酸分子以外，本 发明的核酸分子还可包含修饰的核酸分子。当在本文中使用时，mRNA 指能在树突细胞中翻译的RNA。这样的mRNAs通常是加帽的，具有 核糖体结合位点(Kozak序列)和在编码所选肽或蛋白的可读框之前的翻 译起始密码子，并且通常含有聚腺普酸尾。
术语"肽"在其最广义上用于指两个或多个亚单位氨基酸、氨基 酸类似物或肽模拟物的化合物。所述亚单位可通过肽键连接。在另一个实施方案中，所述亚单位可通过其它键连接，例如酯键、醚键等。 当在本文中使用时，术语"氨基酸"指天然和/或非天然或合成的氨基 酸(包括甘氨酸以及D和L光学异构体)、氨基酸类似物和肽才莫拟物。 如果肽链短，则3个或更多个氨基酸的肽通常叫做寡肽。如果肽链长， 则该肽通常叫做多肽或蛋白。
可^f吏用市售自动4tJ大合成4义如Perkm Elmer/Applied Biosystems, Inc.， Model 430A或431 A, Foster City, CA, USA制造的那些自动化 肽合成仪，通过化学合成获得供本发明的方法使用的多肽和蛋白。所 合成的蛋白或多肽可被沉淀，并例如通过高效液相层析(HPLC)进一步 纯化。可选地，可使用已知的重组方法获得蛋白和多肽。
当在本文中使用时，"表达"指多核苷酸转录为mRNA; mRNA可 进一步翻译为肽、多肽或蛋白的过程。因此，除非另有指示，当在本
文中使用时，术语"表达"包括转录和翻译。mRNA和肽、多肽或蛋 白表达所需的调节元件是本领域所知的。"在转录控制下"是本领域理 解的术语，表示多核苷酸序列(通常为DNA序列)的转录依赖于其与有 助于转录起始或促进转录的元件的可操作连接。"可操作连接的"指元 件处于容许其起作用和/或对另 一种元件发挥它们的作用的排列方式。 例如，当两者都包含于同一个表达载体中时，转录增强子能可操作连 4妻启动子。
含有通用克隆位点和表达必需元件的载体是本领域中已知的。取 决于环境，可使用具有不同特征的载体，本领域技术人员熟悉所述不 同特征以及它们所适合的环境。载体可含有例如下列元件的某些或全 部用于选择在哺乳动物细胞中稳定或瞬时转染的选择标记基因(如新 霉素抗性)；用于高水平转录的增强子和/或启动子序列(如来自人CMV 的立即早期基因)；用于mRNA稳定性的转录终止和RNA加工信号(如 来自SV40); SV40多瘤病毒复制起点和用于正确的游离型载体复制的 ColEl;通用的多克隆位点；以及用于有义和/或反义RNA的体外转录 的启动子(如T7和/或SP6启动子)。这些元件的其他实例和其他有用 的元件是本领域已知且可获得的。例如，某些有用的载体能在体外或 体内转录RNA,并可在商业上获得自诸如Stratagene (La Jolla, CA)和 Promega Biotech (Madison， WI)的来源。在某些实施方案中，表达载体 用于产生RNA,该RNA随后神皮用于转染细胞群。为了优化表达和/或体外转录，某些本领域已知的修饰可能是必需
或有益的。在某些实施方案中，优化体外转录的mRNA的稳定性和翻 译效率。例如，可通过在mRNA中包括3'UTRs和/或5'UTRs而增加 mRNA稳定性和/或翻译效率。3' UTRs优选的实例包括那些来自人 CD40、 P-肌动蛋白和轮状病毒基因6的3'UTRs。 5'UTRs优选的实例 包括来自CD40L的5'UTR,以及Hsp70、 VEGF、脾坏死病毒RU5和 烟草蚀紋病毒的5'UTRs中的翻译增强子。其它调节元件的实例包括但 不限于下列元件。
P-肌动蛋白是一种在人非肌肉细胞中大量表达的基因。人(3-肌动蛋 白启动子已广泛用于驱动哺乳动物细胞系和转基因小鼠中的基因表 达。在包含该启动子的构建体中，业已证实包含P-肌动蛋白3'UTR+侧 翼区进一步增加了 mRNA累积的水平(参见如Qm和Gunning (1997),/. A0c/7e附.jBz'op/z". A/e,/ . 36: 63-72)/
猿猴轮状病毒基因6 mRNA的3'UTR在其加帽的非聚腺苷酸化病 毒转录物中起翻译增强子的功能。还已表明，3'UTR在兔网织红细胞 裂解物中增强异源报道mRNA的翻"i奪(参见如Yang等.(2004)爿rc/z. Kto/149: 303-321)。
已经表明，人hsp70基因的5'UTR在不存在应激诱导的情况下增 加报道mRNA的翻译，且未显著影响信息稳定性。业已在众多人细胞 系中证实了增强子功能(参见如Vivinus，等.(2001)五紅《/ Bwc/iew. 268: 1908-1917)。
小鼠VEGF 5'UTR增强单顺反子报道RNA的翻译，还具有IRES (内部核糖体进入位点)活性。其增强子活性业已在大鼠、仓鼠和人细胞 系中得以-〖正实。全长5'UTR为1014个核苷酸， <旦163个核苷酸的突变 形式显示更有活性(参见如Stem等.(1998) Mo/. Ce〃. Bzo/. 18: 3112-3119)。
脾坏死病毒(SNV)是一种禽类逆转录病毒。病毒5'LTR的RU5区 刺激人293细胞中的非病毒报道RNA的翻译效率(参见如Roberts和 Boris-Lawne (2000),/. P7ra/. 74: 8111-8118)。
烟草蚀紋病毒RNA的143个核香酸的5'前导序列促进了报道 mRNA在植物和动物细胞系中的不依赖于加帽的翻i,。尽管所述前导 序列未进 一 步增强加帽转录物的翻译，但树突细胞中的不依赖于加帽
27的CD40L表达是对体外加帽的非常有吸引力的替代(参见如Gallie等. (1995) 165: 233-238; Niepel和allie (1999) J. Kzra/. 73: 9080-9088; Gallie (2001) J. 75: 12141-12152)。
当在本文中使用时，"基因递送"或"基因转移，，指将外源多核香 酸导入宿主细胞中，而与用于导入的方法无关。基因递送(或转移)指核 酸可整合入宿主细胞基因组中或可不依赖于宿主细胞基因组复制的递 送。基因递送不指将mRNA导入细胞中。"基因递送载体，，是能携带插 入宿主细胞中的多核苷酸的任何分子。基因递送载体的实例包括例如 脂质体；生物相容的聚合物(天然或合成的)；脂蛋白；多肽；多糖；脂 多糖；人工病毒包膜；和金属微粒。基因递送载体的实例还包括细菌 或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、载体(如粘粒 和质粒)和其他本领域已知— 皮描述用于在多种原核和真核宿主中表达并 可用于基因治疗以及产生多核普酸或蛋白的重组载体。
如本领域中所知的以及本文所描述的，多种载体能介导基因转移 到哺乳动物细胞中。"病毒载体"定义为重组产生的包含待递送(无论是 在体内、离体或体外)至宿主细胞中的多核苦酸的病毒或病毒颗粒。病
毒载体的实例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、 甲病毒载体等。诸如基于塞姆利基森林病毒的载体和基于辛德毕斯病 毒的载体的甲病毒载体也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见如 Schlesinger和Dubensky (1999) C匿(9戸.B她c/mo/. 5:434-439以及 Zaks等.(1999) Ato.7: 823-827。
在基因转移由逆转录病毒载体介导的情况下，载体构建体指包含 逆转录病毒基因组或其部分和治疗基因的多核苷酸。当在本文中使用 时，术语"逆转录病毒介导的基因转移"和"逆转录病毒转导"具有 相同含义，是指基因或核酸序列依靠进入细胞并将其基因组整合入宿 主细月包基因组的病毒而稳定地转移入宿主细J包中的过程。病毒可通过 其正常的感染机制进入宿主细胞中，或被修饰，使得其结合不同的宿 主细胞表面受体或配体，以进入细胞。当在本文中使用时，"逆转录病 毒载体"指能够通过病毒或病毒样进入机制将外源核酸导入细胞中的 病毒颗粒。逆转录病毒以RNA形式携带其遗传信息；然而， 一旦病毒 感染细胞，RNA就逆转录为DNA,其整合入感染细胞的基因组DNA 中，整合的DNA称为前病毒。两个或更多个多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)可享有某
一百分数的"序列同一性"。使用带缺省参数的BLAST比对程序进行 核苷酸或氨基酸序列所享有的序列同一性的比对和评价。该BLAST程 序是一种由Karlin和Altschul改良(1993) /Voc. A^r/. Jcfld Sc. t/&4卯 5873-5877的执行Karhn和Altschul算法(1990)TV"//.爿cac/. S". [/&4 87: 2264的程序。替代的程序是BLASTN和BLASTP,使用了下 列缺省参数遗传密码=标准；过滤器=无；链=两条；截止值=60; 期望值=10;矩阵-BLOSUM62;描述=50条序列；分选方式=高分 值；数据库=非冗余的，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻译+ SwissProtein + SPupdate + PIR。还可使用GAP程序比较序 列，该程序使用了使匹配数目达到最大并使空位数目减至最少的 Needleman和Wunsch算法((1970) ,/. A/o/. Ao/. 48:443-453)以获得两条 完整序列的比对。这些程序可详见 于 URL ncbi.nlm.mh.gov/cgi-bin/BLAST。包括BLAST和GAP程序的序列比较 软件是市场上可买到的，如Accelrys GCG软件包(ll.O版，Accelrys, San Diego)。序列可享有改变的序列同 一性百分数，例如至少75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多的序列同 一性。亦可 使用上述算法或另外算法手工进行比对和序列同一性评价。
氨基酸序列或编码其的核苦酸序列的"保守改变"是一种产生类 似的电荷密度、亲水性或疏水性、大小和/或构型的替代氨基酸序列(例 如Val替代Ile)的改变。相比之下，"非保守改变，，是一种产生明显不 同的电荷密度、亲水性或疏水性、大小和/或构型的替代氨基酸序列(例 如Val替代Phe)的改变。产生这样的修饰的方法在本领域众所周知， 还可通过市售试剂盒和载体(例如那些可获得自New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.; Clontech, Palo Alto， Calif.的试剂盒和载体)实 现。
"分离的"或"纯化的"核酸分子、多核苷酸、肽、多肽、蛋白、 抗体或它们的片段是实质上或基本上不含有正常伴随核酸分子或蛋白 或对其有影响如存在于其天然存在的环境中的组分。因此，分离的或 纯化的核酸分子或蛋白是实质上不含有其它细胞物质或当通过重组技 术产生时不含有培养基的，或当化学合成时实质上不含有化学前体或 其它化学药品的。例如，"分离的"多核苦酸优选不含有天然侧接该多
29核苷酸所来源的生物体基因组DNA中该多核苷酸的序列(如蛋白编码 序列)(即位于核酸5'和3'末端的序列)。例如，在多个实施方案中，分 离的多核苷酸可含有小于约5 kb、 4 kb、 3 kb、 2 kb、 1 kb、 0.5 kb或 0.1 kb的天然侧接基因组DNA中该多核苦酸的核苦酸序列。实质上不 含有细胞物质的蛋白包括具有小于约30%、 20%、 10%、 5%或1% (按 干重计算)的污染蛋白的蛋白制备物。当本发明的蛋白或其生物活性部 分为重组产生时，优选培养基代表了小于约30%、 20%、 10%、 5%或 1 %(按干重计算)的不同于目标蛋白的化学前体或化学物质。
多核苷酸可通过本领域已知的任何方法复制。PCR技术是一种用 于复制DNA的方法并描述于美国专利第4,683,195; 4,800，159; 4,754,065和4，683,202号中；且还描述于PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis等.编，Birkhauser Press, Boston (1994))及其中所引 证的参考文献中。产生多核苷酸的另外的方法是本领域中已知的。
"浓缩的"多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或它们的片段可与 天然存在的对应物相区分，因为每体积的分子浓度或数量大于其天然 存在的对应物。如本领域技术人员所显而易见的，非天然存在的多核 苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或它们的片段并不需要"分离"以使之 与天然存在的对应物相区分，因为其可与其天然存在的对应物相区分， 例如通过其一级序列或可选地通过另一种特性如其糖基化模式，或通 过某些其他特性相区分。
术语"宿主细胞"、"耙细胞"和"受体细力包"意在包括任何能作 为或已作为载体的受体或整合外源核酸分子、多核普酸和/或蛋白的个 体细胞或细胞培养物。其还意在包括单个细胞的后代，并且由于自然 的、偶然的或有意的突变，所述后代并不必定与原始亲本细胞完全相 同(在形态学或在基因组或在总DNA补充)。细胞可以是原核或真核细 胞，包括但不限于细菌细力包、酵母细胞、动物细胞和哺乳动物细力包如 鼠、大鼠、猿猴或人细胞。
"受试者"是脊推动物，例如哺乳动物或人。哺乳动物包括但不 限于鼠、猿猴、人、畜牧动物、体育动物及宠物。"患者，，是需要治疗 的受试者，例如对于特定的疾病或病症如癌症需要治疗的受试者。然 而，对于待治疗的患者无需鉴定准确的疾病或病症。"对照"是在实验 中供比较使用的替代的受试者或样品。对照可以是阳性或阴性的。例如，在实验目的是确定免疫应答与特定培养条件的相互关系的情况下， 通常优选使用阳性对照以及阴性对照。合适的对照的标准和参数是本 领域已知的并可易于为本领域技术人员所确定。例如，在某些环境下
用于转染的树突细胞的合适的对照是已"模拟转染的"(如不用RNA 电穿孔的)的相同或相似:^普系的树突细胞。可选地，在某些环境下对于 转染的树突细胞，适合的对照是已用编码预期不影响目标表型的不同 蛋白的RNA转染的树突细胞。
"癌症"指表现出相对自发生长的至少一个异常细胞。癌细胞表 现出具有特征为明显丧失细胞增殖控制的异常生长表型。癌细胞可以 为良性的或恶性的。癌症可影响多种组织或器官的细胞，包括例如膀 胱、血、脑、乳房、结肠、消化道、肺、卵巢、胰腺、前列腺或皮肤 的细胞。当在本文中^f吏用时，癌细胞的定义不Y又包括原发性癌细月包， 还包括来源于癌纟田胞祖细胞的任何纟田胞。这些细胞包括转移癌细胞以 及来源于癌细胞的体外培养物和细胞系。
癌症包括但不限于实体瘤、液体瘤、血液恶性肺瘤、肾细胞癌、 黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、 胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、成一见 网膜细胞瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、肝细胞瘤、腺瘤、肉瘤、癌、 母细胞瘤等。当指一般表现为实体瘤的癌症类型时，"临床可检测的" 肿瘤是一种基于肿瘤团块可检测的肺瘤，例如通过CAT扫描、磁共振 成像(MRI)、 X-射线、超声或触诊之类的方法。单独的生物化学或免疫 学观察结果可能不足以满足该定义。
术语"培养"指细胞的体外维持、分化和/或增殖或处于合适的培 养基中。"富集的"指组合物所包含细胞占总细胞的百分率大于所述细 胞在生物体中所存在的组织中发现的占总细胞的百分率。例如，由本 发明方法制备的DCs的富集培养物和制备物与其在生物体中所存在组 织(例如血液、皮肤、淋巴结等)中的百分率相比，以较高的占总细胞的 百分率存在。
在某些实施方案中，"组合物"意在包括活性成分与另一种惰性化 合物或组合物(例如可斥全测的物质或标记)或活性化合物或组合物(例如 佐剂)的组合。"药物组合物"或药物意在包括活性剂和栽体(惰性或活 性的)的组合，使得该组合物适用于体外、体内或离体诊断或治疗应用。当在本文中使用时，术语"药学上可接受的载体"包括任何标准的药 物载体，例如磷酸盐緩冲盐水溶液、水和乳剂如油/水或水/油乳剂以及 多种类型的润湿剂。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂
和佐剂的实例参见Martin REMINGTON'S PHARM. SCI.,第18版. (Mack Publ. Co., Easton (1990》。
"有效量"是足以实现至少一种有益或期望结果的量，所述结果 例如增强的免疫应答或医学状况(疾病、感染等)的改善。有效量可在一 次或多次给药、应用或剂量中来给予。合适的剂量应根据体重、年龄、 健康情况、待治疗的疾病或状况以及给药途径而有所变化。
在某些实施方案中，所述方法的步骤可在体内或离体进行。当离 体实施时，该方法可在开》文或封闭系统中实施。用于培养和富集细月包 群的方法和系统是本领域已知的。参见美国专利公开第2004/0072347 号的实施例1和2。还参见美国专利公开第2003/0235908号，其描述 了用于细胞扩增的封闭系统。
在本发明的某些实施方案中，树突细胞可额外地负载一种或多种 目标抗原，所述抗原随后会通过成熟DCs 一皮加工和/或呈递。当DCs 未成熟或成熟时，它们可一皮负载，或前体细月包可^皮负载，然后用于产 生成熟的、负载的DC。"负载的"或"负载抗原的"指抗原被掺入树 突细胞中，使得其能通过树突细胞呈递至T细胞。在某些实施方案中， 通过在含有抗原的培养基中培养，负载的树突细胞(有时称为"脉冲" 或"脉冲的，，；参见如Shaw等.(2002)/"/e". 70: 1097-1105)。
然后，DCs摄取并加工抗原，使之在细胞表面上与MHC分子締合。在 其他实施方案中，通过用编码抗原的核酸转染而用抗原负载DCs,如 用编码抗原的RNA电穿孔DCs,然后它们表达抗原。
术语"抗原"在本领域中被充分理解并包括免疫原性物质即免疫
此术语"抗原"包括但不限于自身抗原(正常或疾病相关的)、传染性或 病原体特异性抗原(如微生物抗原、病毒抗原等)或某些其它外源抗原 (如食物成分、花粉等)。例如，抗原包括但不限于病原体、病原体溶解 产物、病原体提取物、病原体多肽、病毒颗粒、细菌、蛋白、多肽、
癌细J包、癌细胞溶解产物、癌细胞纟是取物以及癌细月包特异性多肽。如 本领域中所知道的抗原还可起作用以增加存活力或免疫原性。"病原体特异性"抗原是一种为特定病原体或特定组的病原体(但不为另一病原 体或另 一组病原体)所分别产生的抗原。病原体特异性抗原的实例是本
领域所知的，包括HIV-特异性抗原(参见如Stratov等.(2004) Cwr. Z>wg5: 71-88)和HCV-特异性抗原(参见如Simon等.(2003) /"/e". /薩肌71: 6372-6380; Encke等.(1998) J./扁,/. 161: 4917-4923)。
抗原可以是天然存在或重组产生的。术语"抗原"适用于一种以 上抗原的统称，因此可同时调节针对多种抗原的免疫应答。此外，所 述术语包括抗原的各种不同制剂的任何一种。"表位"是激发免疫应答 的抗原的一部分(通常是表面部分或MHC-结合肽)并通常为本文中所使 用的术语"抗原"所含括。
抗原可作为多肽或蛋白递送至细胞，或它们可作为编码该抗原的 核酸分子或多核苷酸递送，使得在正被治疗的个体(当体内递送时)或细 胞培养系统(当在体外递送时)中所述核酸分子或多核苷酸的表达产生 抗原。因此，本发明的方法进一步包含通过任何合适的方法(如转染、 脉沖等)，将一种或多种抗原或编码一种或多种抗原的多核苷酸导入未 成熟或成熟DCs以产生负载抗原的DCs。在某些实施方案中，通过电 穿孔将编码抗原的mRNA导入细胞中。在某些实施方案中，该mRNA 可与编码CD40激动剂的mRNA —起或基本上与CD40激动信号同时 导入。
抗原可以其"天然"形式递送，即在无人为干预参与制备抗原或 诱导其进入其遭遇DC的环境的情况下递送。可选地或另外，抗原可以 粗制备物形式递送，例如以通常所施用的类型(常见的变态反应颗粒或 肿瘤裂解物)递送。抗原可作为选"^地为基本上纯的，至少约90%纯。 在某些实施方案中，抗原以分离或来源自赘生性细胞或病原体或病原 体感染的细胞的RNA形式(即大批)递送至抗原呈递细胞。用于才是取自 任何细月包的RNA的RT-PCR以及体外转录的方法4皮露于例如 PCT/US05/053271中。
在抗原是肽的情况下，其可通过例如蛋白水解切割分离的蛋白而 产生。可使用多种切割剂中的任何一种，所述切割剂包括但不限于 胃蛋白酶、溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶等。可选地，可化学合成肽， 优选在自动化合成4义上合成(参见例如Stewart等.，Solid Phase Peptide Synthesis,第2版，Pierce Chemical Co., 1984)。在某些实施方案中，重组技术可用于产生编码目标肽的核酸，并在期望条件下(如在宿主细 胞或其可容易地^L纯化的体外表达系统中)用于表达所述肽。
在某些实施方案中，抗原可具有不同于任何天然存在的化合物的 结构。在本发明的某些实施方案中，抗原是一种具有基本上类似于天 然存在的抗原的结构的结构，但包括 一 处或多处背离天然存在的化合 物精确结构的偏差的"修饰的抗原"。举例来说，在天然存在的抗原是 蛋白或多肽抗原的情况下，与蛋白或多肽抗原相比，修饰的抗原所具 有的氨基酸序列由于添加、取代或缺失一个或多个氨基酸而应当不同 于天然存在的抗原，和/或由于添加、取代或缺失一个或多个共价连接 到氨基酸的化学部分而应当包括一个或多个不同于天然存在的抗原中 相应氨基酸的氨基酸。在一个方面中，天然存在的抗原和修饰的抗原
共享有至少一个有至少5个氨基酸(至少大约75%同一性)的区。本领域 技术人员应当理解在比4交两条氨基酸序列以确定它们的同 一性程度 时，相同氨基酸段(即至少两个氨基酸的区域)之间的间隔不必总是被精 确保持。天然存在和修饰的蛋白或多肽抗原可在至少一个有至少5个 氨基酸的区的氨基酸序列中表现出至少约80%同一性，更可选85%、 90%、 95%或99%以上的同一性。通常，其可用于长得多的氨基酸序列 区(例如IO、 20、 50或100或更多个氨基酸)以显示指定的同一性程度。 在某些实施方案中，DCs表达至少一种来自癌细胞或病原体如HIV 或HCV的其他抗原。术语"肿瘤相关抗原"或"TAA"指与癌相关的 抗原。能通过本发明的DCs表达以诱导或增强针对癌细胞的免疫应答 的具体的肿瘤相关抗原的实例是本领域中已知的，并包括例如MAGE 蛋白、MART、 LAGE、 NY-ESO-l、酪氨酸酶、PRAME、前列月泉特异 性抗原(PSA)、 Melan-A和其他抗原(参见如Santm等.(2005) O^r.
Z)e& 11: 3485-3500; Rimoldi等.(2000)丄/mm朋o/. 165: 7253-7261; Watari等.(2000) F^5S k仏466: 367-371; Engelhard等. (2000) Owcw丄6 Suppl. 3: S272-S280; Chakraborty等.(2003) Owc'er /附mw"o/. /www即/7ze广52: 497-502; Romero 等.(2002) /ww節o/. 188: 81-96)。作为肿瘤相关抗原的目标抗原可用于调节受试者的免疫 应答用于治疗癌症。因此，在某些实施方案中，本发明提供了用于治 疗癌症的方法。
本发明提供了用于将负载抗原的树突细胞递送至患者中淋巴组织的方法，例如包括步骤(a)提供已用编码膜归巢多肽的RNA瞬时转 染并已负载至少一种其他抗原的分离的树突细胞；和(b)经静脉施用 树突细胞予患者。在某些实施方案中，所述其它抗原是规定的以及在 某些实施方案中其是没有规定的。当抗原的每种肽或蛋白的身份和长 度是事先已知时，抗原是"规定的"。相反地，在抗原的至少一种肽或 蛋白组分的身份和/或长度是事先未知的情况下，抗原是"未规定的" 或"没有规定的"。例如，包含总细胞蛋白的抗原(如作为总细胞mRNA 被提供至细胞的抗原)应当是未规定的抗原。
本发明的负载抗原的DCs能用于诱导或增强受试者中针对目标抗 原的免疫应答。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种诱导或 增强受试者中免疫应答的方法，包括给予受试者有效量的本发明的负 载抗原的DCs。对于受试者DCs可以是异源的或自体的。"有效量"的 DCs足以在受试者中随时间而实现期望的有益治疗反应，或足以抑制 癌细力包生长或抑制感染。
当在本文中使用时，术语"诱导"或"增强"受试者中的免疫应 答是本领域所充分理解的术语，指相对于抗原导入受试者前的免疫应 答(如果有)，在将抗原导入受试者后可检测或测量到的针对抗原的免疫 应答至少约2-倍、5-倍、10-倍、100-倍、500-倍或至少约1000-倍或更
及产生在其表面上表达4^^il结合抗原分子的:疫细胞、。 、、
确定所给予的抗原是否已诱导(或增强)免疫应答的方法是本领域 众所周知的。例如，可4吏用本领域已知的多种免疫测定法中的j壬4可一 种检测抗原特异性抗体，所述免疫测定法包括但不限于ELISA,其中 例如用可检测标记的第二抗体(如酶标记的小鼠抗人Ig抗体)检测样品 中抗体与固定的抗原的结合。
本发明的树突细胞可以适合于施用予(如静脉内)患者的制剂提供。 适于施用予患者的本发明的DCs在本文中称为"疫苗"或"DC疫苗"。 疫苗或DC疫苗可进一步包含额外组分以帮助调节免疫应答，或其可被 进一步加工以便适合于施用予患者。树突细胞静脉给药的方法是本领 域已知的，本领域技术人员应能改变静脉施用参数以便使所施用的DCs 疗效达到最大。
因此，DCs通常与至少一种药学上可接受的载体一起以任何适合的方式给予受试者。药学上可接受的载体的适用性部分取决于要施用 的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法。最通常地，进行质量 控制检测(如微生物测定、克隆发生测定、存活力检测)并将细胞再灌注
回受试者中，有时之前施用苯海拉明和氢化可的松。参见如Korbling等. (1986)说ooJ67: 529-532和Haas等.(19卯)五xp. i^mato/. 18: 94-98。
适合于肠胃外给药例如通过静脉施用的制剂包括水性等渗无菌注 射液，其可含抗氧化剂、緩冲剂、抑菌剂和使制剂与目标接受者的血 液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可含助悬剂、增溶 剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
一般而言，本发明的DCs可以通过有效剂量、细胞类型的毒性(如 LD-50)以及在不同浓度下细胞类型的副作用所确定的速率(如本领域技 术人员所确定的适合于受试者体型和总体健康的速率)施用予受试者。 可通过单次剂量或分份剂量完成施用。本发明的DCs可补充其他用于 疾病或病症的治疗，包括例如常规放射治疗、细胞毒性剂、核苦酸类 似物以及生物反应调节剂。
仅作为举例说明的目的，本发明的DCs可按如下给予受试者。在 输注前由受试者获取血样，并将某些等分试样保存用于随后的分析和 比较。通常在约60-120分钟内将至少约104-106以及典型地1 x 107-1 x 1(^个细胞经静脉输注入70kg患者中。 一般密切监测患者的生命体征 并通过脉冲血氧定量法密切监测氧饱和度。可相隔 一段时间获取血样 并保存用于分析。重复细胞再输注，例如，在一年的时间内约每月重 复一次总共10-12次治疗。在第一次治疗后，有可能基于临床医师之判 断对门诊患者进行输注。
本发明进一步提供了 一种可检测抗原肽有效性的方法。多种相似 的肽可作为免疫施用，并比较对每种肽的应答以便鉴定会产生最佳应 答的氨基酸序列。可基于已知参数例如HLA结合亲和力对肽进行修饰， 或随机产生修饰并测试致免疫能力。
要用于任何特定组合物或应用中的抗原的量将取决于特定抗原及 采用该抗原的应用的特性，其易于为本领域技术人员所理解。
通过在体外或体内将细胞与有效量的细胞因子或共刺激分子接触 可进一步改良该方法。这些物质可作为多肽、蛋白或可选地作为编码 它们的多核苷酸或基因递送。细胞因子、共刺激分子和趋化因子可作细胞的分离物)或以"纯化的"形式提供。纯化的制备物优选是至少约
90%、 95%或至少约99%纯。
在细胞因子和抗原都要,皮递送给个体的情况下，它们可一起或分 开提供。当它们作为多肽或蛋白递送时，它们可在相同的包嚢装置中 递送，或通过物理締合如共价4建、氲键、疏水相互作用、范德华相互 作用等递送。在一个替代的实施方案中，以提供编码二者的多核苷酸 形式一起提供化合物。在某些实施方案中，两种蛋白作为融合蛋白表 达自单个连续多核苷酸，在所述融合蛋白中细胞因子和抗原经肽键彼 此共价连接。可选地或另外，基因可连接至相同或等同的控制序列， 以便这两种基因应答于相同刺激物而在个体中表达。细胞因子和/或抗 原的施用可任选地与任何其它所需的免疫系统调节因子如佐剂或其他 免疫调节化合物的施用相结合。
为了测定DCs活化T细胞的能力，可使用本领域已知方法获得T 细胞。简言之，密度梯度离心可用于将PBMCs和红细胞及中性白细胞 相分离。可通过用偶联至柱子或磁珠的合适的单克隆抗体进行负选择 或正选才奪富集T细胞。如通过任何本领域已知和/或本文中所描述的适 合的测定法所测定的，通过本发明的方法制备的成熟DCs可在体内比 对照DCs刺激T细胞多至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或100%或更多。
细胞表面标志可用于鉴定和/或分离用于不同用途的特定的细胞类 型。例如，人干细胞通常表达CD34抗原。鉴定并分离特定细胞类型的 方法包括例如FACS、柱层析、》兹珠淘选、蛋白质印迹、放射照相术、 电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色镨(TLC)、超扩散色 i普(hyperdiffusion chromatography)等，以及各种免疫学方';i^列》口 '液体 或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射性免疫测 定(RIAs)、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、免疫荧光测定等。关于一般的 免疫学和免疫测定方法的述评，参见如Stites和Terr,编(1991)Basic and Clinical Immunology (第7版)；Harlow和Lane, 编(1988) Antibodies: A Laboratory Manual; Harlow和Lane,编(1999) Using Antibod正s : A Laboratory Manual 。
用于多种用途的抗体可以是任何适合类型的抗体例如单克隆或多克隆抗体；抗体可以是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。还可使用抗
体的功能片段或衍生物，包括例如Fab、 Fab'、 Fab2、 Fab'2和单链可 变区。可在细胞培养物、噬菌体或任何适合的动物中产生抗体。可通 过在一组给定的条件下，比较抗体与合适的抗原(即为抗体所识别或可 为抗体所识别的抗原)的结合和抗体与不相关的抗原或抗原混合物(即 不期望的抗原或不为所述抗体所识别的抗原)的结合，来观'J试抗体的结
合物的结合多至少2、 5、 7或10倍，则抗体结合被认为是特异的。
本领域已知多种用于检测及定量蛋白和/或多肽的技术，包括但不 限于放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、"夹心"免疫测定、 免疫放射测定和/或免疫染色测定、原位免疫测定(使用如胶体金、酶 或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分神斤、免疫沉淀测定、免疫萸光测
表面才示志。参见例长口 Givan (1992) F/ovv Cyowe/y_y.' Fz>W尸h"cp/^ (John Wiley & Sons, New York, NY, USA)。
用于细胞低温保存的方法是本领域所知的；参见如Feuerstem等. (2000),/. /麵w脂/. A/"/z. 245: 15-29 。
可通过众所周知的方法测定树突细胞的免疫原性和通过本发明的 方法所诱导及扩增的驯化T细胞的性质和数量，所述方法包括但不限 于如下
510-释放溶解测定:可比较抗原特异性T-细胞溶解通过肽脉冲或 某些其它方式呈递抗原的510标记的輩巴的能力，"更具活性的"组合物 显示了作为时间函数的更多的耙的溶解。可通过溶解动力学以及在特 定的时间周期(例如4小时)内的溶解量来评价性能(参见如Ware等. (1983),/麵画/. 131: 1312)。
细胞因子释放测定:还可通过接触修饰的APCs时，T细胞所分泌 的细胞因子的类型和数量测定T细胞的功能活性。可通过ELISA或 ELISPOT测定法测定细胞因子以确定细胞因子产生的速率和总量(参
见^(口 Fujihashi等.(1993) /. /wmww /. MeA. 160: 181; Tanquay禾口 Killion (1994)丄，/ /7. Cy.13: 259)。
T-细胞的体外驯化:可测定DCs激发来自正常供体或患者PBMCs 的反应性T细胞群的能力。可测试激发的T细胞的溶胞活性、细胞因子释放、多克隆性和与抗原的交叉反应性(参见如Parkhurst等.(1996) J. /画画/. 157: 2539-2548)。
转基因动物模型:可通过用本发明的组合物接种HLA转基因小鼠 并测定所诱导的免疫应答的性质和量级以体内评价免疫原性。可选地， hu-PBL-SCID小鼠才莫型允许通过人PBL的过继转移在小鼠中重建人免 疫系统。这些动物可用所述组合物接种并如之前Shirai等.(1995)丄 /wm丽o/. 154: 2733; Mosier等.(1993)尸roc iVW/. Jcad t/&4 90: 2443中所提及的分析其免疫应答。
增殖试验:T细爿包应答于反应性组合物会增殖，并可通过测定例如 311-胸苷摄取定量监测增殖(参见如Caruso等.(1997) C少towe^y 27: 71)。
灵长类动物模型:黑猩猩享有与人MHC分子重叠的MHC-配体 特异性，并因此可用于测试HLA-限制配体的相关体内免疫原性(参见 如Bertom等.(1998)丄/mm腦o/. 161: 4447)。
监测TCR信号传导事件:通过MHC-配体复合物成功的TCR占据 与几个细胞内信号传导事件(如磷酸化)有关。这些事件在定性和定量上 与组合物通过TCR占据以活化效应细胞的相对能力相关(参见如 Salazar等.(2000) J1"/1.丄Ca匿r 85: 829; Isakov等.(1995)丄￡"平她d. 181: 375)。
根据以上描述，下列实施例意在举例说明而非限制本发明的不同方面。
实验
下列材料和方法用于以下本文所描述的可适用的实施例中。总体 来说，下列实验显示了将嵌合的E/L选择蛋白导入DCs,使该DCs变 得可以直接/人血流通过高内皮樣H争脉(HEV)进入淋巴结。
抗体为测定DCs的表型，使用下列抗体(Abs): FITC-标记的抗 -CD83、抗-CD86、抗-CD25和抗-CD80抗体(BD Pharmingen， Heidelberg Germany); FITC-标记的抗-HLA-DR抗体(BD Biosciences, Heidelberg, Germany); 以及FITC-标记的抗-HLA I类抗体(Chemicon International, Hampshire, United Kingdom)。同种型对照为IgGl-FITC (BD Pharmmgen) 和IgG2a-FITC (Chemicon International)。为了测定E/L-选择蛋白表达，使用FITC-标记的抗-人E-选择蛋白/CD62E mAb (克隆BBIG-E5) (R&D Systems GmbH, Wiesbaden画Nordenstadt， Germany)。为了测定T细月包 的表型，使用ECD-标记的抗-CD45RA、 PC7-标记的抗-CD8 (皆来自 Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany)和FITC國标记的抗-CCR7 (R&D Systems GmbH)。
来自白细月包除去法和全血的人DC产生基本上如之前在Berger 等.(2002)丄//mmmo/. Me仇268: 131-140中所描述的，制备单核细胞 来源的DCs( "moDCs，，)。简言之，使用Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norway)通过密度离心分离，从除去白细胞的产物或健康供体的全血制 备外周血单核细胞(PBMCs)。在知情同意并为制度评审委员会所批准后 获得血液制品。将PBMCs重悬于由含1%热灭活的人血浆、2mML-谷氨酰胺(Bio-Whittaker)和20 mg/1庆大霉素(Sigma-Aldnch Chemie GmbH, Taufkirchen， Germany)的RPMI 1640 (Cambrex, Verviers, Belgium)组成的自体培养基中。然后以1.2xl09个细胞/细胞工厂将 PBMCs转移至细胞工厂(Nunc, Roskilde， Denmark),或以30xlC)6个细 胞/皿转移至组织培养皿(Falcon (BD), Le Pont De Claix, France)用于小 规模产生DCs。在37。C下温育细胞1-2 h以使之粘附。然后除去非粘 附级分并低温保存，同时将200 ml(细胞工厂)或10 ml(培养皿)的自体 培养基添加到粘附细胞。用培养基和细胞因子(GM-CSF (Leukine, Berlex, MontvilleNJ, USA)禾口 IL陽4(Strathmann, Hamburg, Germany)) 飼养细胞，并基本上如之前在Schaft等.(2005)丄/mwwwo/. 174: 3087-3097)中所描述的进4亍DC成熟。在成熟24小时后，将细月包用于 电穿孔。
小鼠BM-来源的DC产生基本上如Lutz等.(1999) J. /ww朋o/. Mw/z. 223: 77-92中所述产生带有GM-CSF的骨髓(BM)-DC。细胞培养 基(R10)由添加有青霉素(100 U/ml， Sigma, Deisenhofen， Germany), 链霉素(100 jig/ml, Sigma)、 L-谷氨酰胺(2 mM, Sigma)、 2-巯基乙醇(50 |LiM, Sigma)和10%热灭活并过滤的FCS (FCS来自PAA， C6lbe, Germany; 用来自Millipore, Eschborn, Germany的0.22 jim过滤器过 滤)的RPMI-1640 (GIBCO BRL, Eggenstein, Germany)组成。在第0天， 将获得自鼠后腿的BM白细胞以2乂106个细胞/皿接种在10 ml含10% 来自用鼠GM-CSF基因转染的细胞系的GM-CSF上清液(Zal等.(1994)丄fjcp. Me《180: 2089-2099)的R10培养基中。在第3天，将另夕卜10 ml 含10。/oGM-CSF上清液的R10培养基添加到板中。在第6天，收集一 半的培养物上清液并离心，然后将细胞沉淀重悬于10 ml新鲜的含10% GM-CSF上清液的R10培养基中并放回到最初的皿中。在第8天，收 获细胞用于电穿孔。
体外转录RNA产生为了在体外产生RNA,使用了两个质粒 pGEM4Z64A-MelanA质粒(Heiser等.(2000)丄/w附w朋/. 164 : 5508-5514; I. Tcherepanova博士惠赠，其含有黑色素瘤抗原Melan-A 的全长可读框)和PSP73 SphA64+EL质粒(其在一个可读框内含有人E-选择蛋白的胞外域和人L-选择蛋白的跨膜域以及胞内域，Dr. C. Robert 博士惠赠)。如前所述(参见Schaft等.(2005) ,/. /mm冊o/. I74: 3087-3097),根据厂商使用说明使用Ambion mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒(Austin, Texas, USA)转录这两个质粒。
树突细胞电穿孔人和小鼠DCs收获自细胞工厂或培养皿并用纯 RPMI 1640洗涤一次以及用PBS洗涤一次(皆在室温下)。以4-6xl()7个 细胞/ml (人)或4-10xl07个细胞/ml (小鼠)的浓度将细胞重悬于无酚红 的OptiMEM(Gibco-BRL, Long Island, USA)中。基本上如之前所描述 的(参见Schaft等.(2005)乂/mww"o/. 174: 3087-3097),但具有修改的 时间常数和RNA浓度以增加表达水平，用Genepulser Xcell (Biorad， Munich, Germany)才几器将RNA电穿孔入DCs。
具体来i兌，确定对于人DCs的最佳电穿孔条件包括在Optimem培 养基中于室温下使用500V电荷和4 mm杯以及1 ms方波脉冲。RNA 以150貼/ml终浓度使用并在电穿孔前于杯中与细胞温育3分钟。对于 鼠DCs最佳电穿孔条件包括在Optimem培养基中于室温下使用500V 电荷和4 mm杯以及2 ms方波脉冲。RNA以150 |ug/ml终浓度使用， 但在电穿孔前不于杯中与细胞预温育。
一经电穿孔后就将细胞转移到添加有上文指出浓度的GM-CSF和 IL-4 (对人细胞)或补充有含10% GM-CSF上清液的R10培养基(对小鼠 细胞；如在之前标题为"BM-来源的DC产生" 一节中所描述)的自体 培养基中。
细胞低温保存基本上如之前所描述的进行低温保存(参见如 Feuerstein等.(2000)./. /麵画/. M /7z. 245: 15-29)。简言之，将纟田胞
41以5-10 x 106个细胞/ml(对于DCs)或20-50 x 106个细胞/ml(对于非粘附 细胞)的浓度摄取于20。/。人血清白蛋白(HSA， Pharmacia&1^01111)中并 在水上贮存IO分钟。将等体积的低温保存培养基(即55%HSA(20%)、 20%二曱亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich)和25%葡萄糖(Glucosteril 40TM， Fresenius, Bad Homburg, Germany))添力口到细胞悬液中。然后在《氐温 冷冻容器(Nalgene， Roskilde, Denmark)中以-1°0/分钟将细胞冷冻至 -80。C。通过将低温管置于37°C水浴中直至细胞脱离可见为止以进行 解冻。接着将细胞注入10ml的RPMI 1640培养基中、洗涤并加到含预 加热的、含250 IU IL-4/ml和800 IU GM-CSF/ml的自体培养基的细胞 培养皿中。在进一步实验之前于37。C恒温箱中让细胞静息1-2 h。
流式细胞分析为了表面染色，洗涤DCs并随后将1 x 105个细胞 悬于100 pl冷FACS溶液(含O.l y。叠氮化钠(Sigma-Aldrich)和0.2。/。HSA (Octapharma , Langenfeld , Germany)的 DPBS (Bio Whittaker ， Walkersville, Maryland, USA))中，并与单克隆抗体或合适的同种型对 照温育30分钟。然后洗涤细胞两次并重悬于100 pl冷FACS溶液中。 用FACSstar细胞分析仪(Becton-Dickinson)对染色细胞的免疫焚光进行 分析。使用前向散射和侧向散射设门(gate)从分析中除去细胞碎片。对 于每种表面染色细胞样品最少分析104个细胞。使用Cellquest软件 (Becton-Dickmson)分^f结果。
趋化孔(Transwell)迁移实验使用具有5 pm孔径的趋化孔插入物 (Costar, London, UK)和CCL19 (100 ng/ml, tebu-bio GmbH, Offenbach, Germany),基本上如之前在Schaft爭.(2005) 乂 /m/m/wo/. 174: 3087-3097中所描述的进4亍趋化孔迁移实-验。
细胞毒性T细胞(CTL)诱导实验不用RNA、单独用E/L-选择蛋 白RNA、单独用MelanARNA或用MelanA和E/L-选择蛋白RNA组 合电穿孔DCs。此外，为了比專支，在37。C下用10 pg/ml的MelanA-衍生的HLA-A2-结合类似肽ELAGIGILTV对模拟电穿孔的和E/L-选 择蛋白RNA-电穿孔的DC脉冲1 h。根据厂商使用说明使用MACS (Miltenyi Biotech, Bergisch隱Gladbach， Germany),将来自同一i^康供 体的非粘附细胞级分用作为产生CD8+T-细胞的来源。接着于补充有 100/o混合血清(Cambrex)、 10mMHepes、 1 mM丙酮酸钠、1% MEM非 必需氨基酸(100x)、 2 mM L-谷氨酰胺、20 mg/1庆大霉素和20 U/ml IL7的RPMI中，分别在lxl06/ml和lxl05/ml的终浓度下，将CD8+细胞与 上述不同预处理的DCs共培养。在第2和4天，添加20 IU/ml IL2和 20U/mlIL7。在第7天，收获并分析细胞。
抗原特异性CD8+ T细胞的四聚体染色和表型分析使用抗 -CCR7、抗-CD45RA和抗-CD8抗体的HLA-A2-MelanA四聚体染色 (Beckman Coulter GmbH)和T细胞表型分析基本上如之前在Schaft等. (2005) / /wmw"o/. 174: 3087-3097中所描述的进行。在来自Beckman Coulter的CYTOMICS FC500上分析细胞。
细胞毒性实验在基本上如之前在Schaft等.(2005) /www朋/. 174: 3087-3097种所描述的标准的4-h 51Cr释放测定中检测细胞毒性。
E/L-选择蛋白诱导的体外迁移测定用或不用E/L-选择蛋白RNA 电穿孔树突细胞并以lxl(^个细胞/ml的浓度重悬。矩形盖玻片(24x60 mm)包被5 |ug生物素化的结合唾液酰-LewisX和碌u酸化酪氨酸(Lectinity Holdings Inc.， Moscow, Russia)的聚丙烯酰胺并风干。所有的盖玻片 都用0.5%牛血清白蛋白(溶于PBS中)温育至少30分钟以阻止非特异 性结合。在连接到含1 ml细胞悬液的注射器之前，用补充有2 mM CaCl2 的汉克氏平tf盐溶液(HBSS)短暂地冲洗具有50 jam狭缝深度和500 pm 狭缝宽度并配备有包被或未包被的盖玻片的透明流动腔。使用无脉冲 泵以1.04达因/^2的剪切速率在20。C下进行灌注。在灌注期间，实时 记录显孩￡相差图^象。在灌注10分钟后，记录四个不同的显樣i镜碎见野(10x 物镜)并对每个视野计数粘附细胞的数量。使用MetaView成像软件 (Universal Imaging Corporation, Downington, USA)进4亍离线图<象分冲斤。
E/L-选择蛋白诱导的体内迁移用或不用E/L-选择蛋白RNA电 穿孔鼠DCs,并根据厂商指导用5-氯甲基荧光素二乙酸酯(CMFDA) (Molecular Probes, OR, USA)染色。将细胞注射入C57/B6小鼠尾部静 脉中；16小时后，处死小鼠并提取腹股沟淋巴结(LN)、脾和部分的肺， 然后马上在液氮中冷冻。将器官包埋在组织(Tissue)-Tek O.C.T.化合物 (Compound) (Sakura, NL)中并在-80。C下贮藏。然后在-20°C下用Leica CM3050 S Cryostat(Leica， Wetzlar, Germany)将冷冻的器官切成10 pm 厚切片并保存在SuperFrost Plus显樣i镜载玻片(Menzel GmbH, Braunschweig, Germany)上。
为了免疫荧光染色，解冻冷冻的切片并干燥10分钟。用4%多聚曱醛(Merck， Darmstadt, Germany)固定切片20分钟。在用PBS洗涤 并用0.1 M甘氨酸中和过量的醛基15分钟后，将切片用2%BSA(PAA， C6lbe, Germany)的封闭溶液温育15分钟并用以1:200在2% BSA溶液 中稀释的特异于CD90.2的抗体(Thy1.2， BD Bioscience, Heidelberg, Germany)染色。30分钟后，将细胞用1:1000在2% BSA中稀释的抗大 鼠Alexa555画纟晨合的4元体(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)温育。 温育30分钟后，将切片包埋于Fluoromount封固剂(Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany)中。使用Leica DMRD研究用显微镜 (Leica, Wetzlar, Germany)进行荧光分析。
实施例1: E/L-选择蛋白编码RNA电穿孔入成熟的人DCs产生高转染
效率和产率
使用上述在测试不同的电穿孔设定值后所确定的最佳的电穿孔实 验方案，将编码嵌合的E/L-选择蛋白的RNA电穿孔入DC。电穿孔后 将RNA-转染的DCs低温保存4h,解冻并评价。如图l(图a)中所示， 这些DCs显示高且均匀的E/L-选才奪蛋白表达。甚至在DCs解冻24h和 48h后还观察到高表达(图la),证实获得了延长的E/L-选择蛋白表达。
为了在人患者中使用DCs作为疫苗，关键在于DCs在制备过程中 能存活。DCs必须在电穿孔和^[氐温保存步骤存活，且应当不显示来自 表达归巢肽和任何目标抗原的过度损伤(如毒性效应)。因此，评价DCs 产率(即与整个操作之前的细胞数目相比，电穿孔和低温保存后活细胞 百分数)。4氐温保存用E/L-选4奪蛋白RNA或不用RNA电穿孔的DCs, 并接着解冻。通过在台盼蓝中计数测定产率。在解冻后0h评价细胞， 或在37° C下于含IL-4和GM-CSF的自体培养基中培养细胞并在解冻 后24h或48h评价细胞。如图l(b)中所示，刚一解冻后DCs的存活为 约80%,并在48h内緩慢降低。使用对照DCs获得了类似的结果，其 表明E/L-选才奪蛋白RNA的导入对DCs没有毒效应。
实施例2: E/L-选择蛋白RNA电穿孔的成熟的人DCs显示正常的
标记表型和CCR7-介导的迁移 为了最佳性能，DC疫苗应当包含最高可能频率的能呈递肿瘤相关 抗原("TAA")的成熟DCs。因此，评1介电穿孔的DCs以确定它们是完全还是部分保留其成熟表型。评价ELS RNA电穿孔的DCs或已被 冲莫拟电穿孔的DCs的CD80、 CD83、 CD86、 CD25、 HLAI类和HLA-DR 分子的表面表达。4企测到成熟表型并且在这两个DC群之间没有，见察到 差异；结果示于图2。
为了最佳性能，DCs应当还保留CCR7-介导的迁移能力，其对于 从皮肤到淋巴结中的正常DC迁移必不可少。此外，功能性CCR7表达 也是DCs在HEV上"滚动，，所必需的。因此，比较用ELSRNA电穿 孔或模拟电穿孔的DCs。在标准的趋化孔体外迁移实验中检验迁移能 力(参见如Scandella等.(2002) B/ooc/]00: 1354-1361)。在该实验中, 将DCs置于趋化孔系统的上孔中；然后将趋化因子CCL19置于上孔(即 与细胞相同的孔中)或下孔中。置于具有趋化因子的上孔中却迁移离开 该孔的细胞^f皮认为已"逆"趋化因子迁移，而置于与趋化因子不同的 孔中却朝趋化因子孔迁移的细胞被认为已"朝"趋化因子迁移。让细 胞迁移2小时然后进行评价。没有一组DCs逆CCL19梯度迁移，并 且最重要的是这两群DCs都显示相同的朝CCL19的迁移能力(图3)。 作为阴性对照，在无CCL19的趋化孔中温育细胞。
如上述实验所说明的，包括成熟标志表型和CCR7-介导的迁移能 力在内的DCs的几种特性并不受DC表面上E/L-选择蛋白表达的影 响。
实施例3:E/L-选择蛋白RNA电穿孔的DCs仍然是MelanA隱特
异性CTL的有效诱导物
为了抗癌的DC疫苗的最佳性能，DCs应能有效地诱导TAA-特异 性CTL。为测试该诱导，我们选择了黑素瘤相关抗原(Ag)MelanA。对 于该测定，MelanAAg表现良好，原因在于MelanA-特异性T细胞在志 愿者中是相对常见且为幼稚表型。如果使用了有效的DCs,则甚至在 一次刺激后都可能检测到这些T细胞扩增(参见如Schaft等.(2005)7. /ww柳o/. 174: 3087-3097; Pittet等.(1999) </. Exp. A^ t/. 190: 705-715; Romero等.(2002)/附mwwo/. Wev. 188: 81-96)。
接着测定不同DCs的诱导能力。比较单独用MelanA负载的DCs 的诱导能力和已用MelanA负载并用E/L-选一奪蛋白RNA电穿孔的DCs 的诱导能力。通过编码天然MelanA的RNA共电穿孔或通过用MelanA衍生的HLA-A2限制类似肽脉冲实现抗原负载，其在这些环境下提供 了较天然MelanA肽更好的刺激(参见如Schaft等.(200" /wmw"o/. 174: 3087-3097; Abdel-Wahab等.(2003) Ce〃./mww"o/. 224: 86-97)。
将电穿孔的DCs与自体CD8+ T细胞共培养一周，并测定 HLA-A2/MelanA-四聚体阳性T细胞的百分数。通过它们的CCR7和 CD45RA表达，还将四聚体阳性的T细胞分类到四种表型中的一种(参 见如Sallusto等.(1999) A^fwre 401: 708-712):幼稚、中心记忆、效应 物记忆以及溶解效应物。单独用MelanA RNA以及用MelanA RNA和 E/L-选择蛋白RNA组合电穿孔的DCs能扩增MelanA-特异性T细胞 群至相同程度，具有朝向效应细胞群的强烈倾向(图4a)。才莫拟电穿孔的 和E/L-选4奪蛋白RNA-电穿孔的DCs用作为阴性对照。负载MelanA类 似肽的DCs更强烈地刺激了抗原特异性T细胞，但在已用ELS RNA 电穿孔的DCs和模拟电穿孔的DCs之间所观察到的刺激能力上不再有 显著差异(图4a)。
使用负载特异性类似肽的T2细胞作为耙细胞，在标准的Cr"-释放 测定中4全查通过该操作产生的T细胞的细胞溶解能力。无论那些DCs 是已用ELS RNA电穿孔还是才莫拟电穿孔的，已用MelanA类似肽-负 载的DCs刺激的T细胞皆显示高的细胞溶解(图4b)。 T细胞还显示类 似的溶解能力，无论它们是通过单独用MelanA RNA电穿孔还是用ELS RNA和MelanA RNA组合电穿孔的DCs刺激(图4b)。当它们已用ELS RNA电穿孔或才莫拟电穿孔的DCs刺激时，T细胞并不显示细胞溶解(图 4b)。对于所有测试的T细胞群，负载不相关肽的T2靶细胞的背景溶 解<10%(数据未显示)。
总之，这些数据显示经DCs的E/L-选择蛋白共表达并不抑制DCs 通过呈递胂瘤相关Ag诱导CTLs的功能性能力，并且经DCs的MelanA 共表达不抑制E/L选择蛋白的膜表达。
实施例4:E/L-选4奪蛋白RNA电穿孔的DCs通过结合至唾液酰
-Lewisx而滚动
在平行平板流动腔中使用包被有唾液酰-LewisX(SLX)的载玻片，在 体外滚动实验中证实了所导入嵌合的EZL-选择蛋白的功能性。该实验 中的剪切力近似于高内皮农il争^K "HEV")中的剪切力，如1.04达因/s2)。用E/L-选择蛋白RNA电穿孔的DCs以低滚动速率在SLX-包被 的载玻片上滚动，而模拟电穿孔的DCs则不会在SLX-包被的载玻片上 滚动或粘附。这两个DCs群都不在未包被的载玻片上滚动或粘附。在 流动10分钟后，采集四个随机视野的照片，并计数细胞；对图5中三 个不同的DC供体概括数据并给出p-值，显示了数据的统计显著性(斯 氏T4企-验)。对于来自所有三个供体的DCs,不用RNA电穿孔的DCs 根本不在SLX-包被的载玻片上粘附或滚动(图5和7)，而用E/L-选择 蛋白RNA电穿孔的DCs则观察到既粘附也滚动(图5)。将E/L-选择蛋 白导入小鼠DC也引起这些DC在SLX-包被的载玻片上滚动。
总之，这些数据显示如通过体外滚动所证实的，用E/L-选择蛋白 RNA转染的DCs功能性地表达了嵌合的E/L-选择蛋白。
实施例5: E/L-选4奪蛋白RNA电穿孔的DCs在体内有效地从血液
中外渗并迁移至淋巴结 为证实所导入E/L-选一奪蛋白的体内功能性，用E/L-选4争蛋白RNA 电穿孔小鼠DCs(C57/B6)，用CMFDA染色，并注射入C57/B6小鼠尾 部静脉中。在14h-18h后，处死小鼠，并制备脾和'淋巴结的低温切片。 如图6中所示，在注射无论是已用ELSRNA电穿孔还是模拟电穿孔的 那些DCs后，在脾中都检测到阳性染色的DCs。然而，只有用ELS RNA 电穿孔的DCs迁移至外周淋巴结中，而^f莫拟电穿孔的DC则没有迁移 (图6),证实了表达E/L-选择蛋白的DCs获得了从血液迁移至淋巴结中 的能力。
总之，这些数据显示了 RNA电穿孔可用于提供经DCs的E/L选择 蛋白的功能性表达，即提供在静脉施用后可从血液迁移至淋巴结的 DCs。
在说明书全文中，各种出版物、专利和公布的专利说明书通过做 出引证而得以作为参考。每篇被引用的出版物、专利和公布的专利说 明书在此通过引用而明确地并入本发明的说明书中以更充分地描述本 发明所属的技术状态。
权利要求
1.包含已用编码膜归巢多肽的RNA瞬时转染的树突细胞的组合物，其中所述树突细胞可在包被有所述多肽的配体的表面上滚动。
2. 权利要求1的组合物，其中所述膜归巢多肽为选择蛋白，优选 地所述选择蛋白为E-选择蛋白、L-选择蛋白、P-选择蛋白或它们的嵌 合体，最优选地所述选择蛋白为E/L选择蛋白嵌合体。
3. 权利要求1的组合物，其中(i) 所述树突细胞在包一皮有唾液酰-LewisX的表面上滚动；和/ 或(ii) 所述树突细胞是成熟的；和/或(iii) 所述树突细胞是单核细胞来源的树突细胞；和/或(iv) 所述树突细胞是人树突细胞；和/或
4. 权利要求1的组合物，其中所述树突会:胞额外地负载目标抗原。
5. 权利要求4的组合物，其中通过选自脉冲和转染的方法将所述 抗原负载于树突细胞中。
6. 权利要求4或5的组合物，其中所述的抗原(i) 是肿瘤相关抗原；或(ii) 是病原体特异性抗原，优选所述病原体是HIV或HCV。
7. 包含根据权利要求1-6任一项的组合物的疫苗。
8. 根据权利要求1 -6任一项的组合物在制备用于治疗癌症的药物 中的应用。
9. 权利要求8的应用，其中药物适合于静脉施用。
10. 用RNA转染树突细胞的方法，包括在RNA存在下，于100伏 特/mm-150伏特/mm的场强和0.8 ms-2 ms的方波脉冲持续时间下电穿 孔成熟一对突细月包。
11. 在人受试者中递送树突细胞至淋巴结的方法，包括步骤a) 提供已用RNA瞬时转染的分离的树突细胞，其中所述RNA编 码膜归巢多肽；和b) 经静脉施用树突细胞予人受试者。
12. 权利要求ll的方法，其中所述树突细胞是负载抗原的。
13. 权利要求11的方法，其中所述树突细胞最初分离自人受试者。
14. 权利要求ll的方法，其中所述膜归巢多肽为选择蛋白。
15. 权利要求14的方法，其中所述选择蛋白为E/L选择蛋白嵌合体。
16. 权利要求ll的方法，其中所述分离的树突细胞已进一步用编 码肿瘤相关抗原的RNA瞬时转染。
17. 权利要求11的方法，其中所述分离的树突细胞已进一步用编 码病原体特异性抗原的RNA瞬时转染。
18. 权利要求17的方法，其中所述病原体特异性抗原是来自HIV 或HCV的抗原。
全文摘要
本发明提供了产生瞬时表达膜归巢肽以及任选表达至少一种额外抗原的树突细胞(“DCs”)的改良方法。这些DCs具有体内归巢至淋巴结的能力。在某些实施方案中，可经静脉施用这些DCs予患者并可随后归巢至淋巴结，从而刺激免疫应答。本发明的方法和DCs用于治疗多种疾病和病症。
文档编号A61K35/12GK101600445SQ200780014390
公开日2009年12月9日 申请日期2007年2月14日 优先权日2006年2月22日
发明者G·舒勒, J·德里, N·谢夫特 申请人:阿戈斯治疗公司;麒麟医药株式会社