具有一种或多种增强的产量相关性状的植物和其生产方法
【专利摘要】本发明涉及用于在植物中增强产量相关性状的方法，所述方法通过以特定的方式调节在植物中编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达，本发明还提供了迄今未知的构建体，可用于实施本发明的方法。本发明还涉及具有表达受特定类型的启动子调节的编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。
【专利说明】具有一种或多种增强的产量相关性状的植物和其生产方法
[0001] 本申请要求下列申请的优先权：2012年4月2日提交的EP 12162834. 1和2012 年4月2日提交的US 61/618864,其均通过引用全文整合到本文中。引用整合的还有作为 W02003/035881公开的国际专利申请PCT/GB02/04612,具体是第35至45页，特别是其中列 举的黄素氧还蛋白和转运肽；引用整合的还有作为W02004/070039公开的国际专利申请中 公开的HMGP启动子。
[0002] 发明背景 发明领域
[0003] 本发明一般涉及植物分子生物学领域，并且涉及增强一种或多种植物产量相关性 状的方法，所述方法通过特定方式增加在植物中编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达。本 发明还涉及具有专门增加的编码靶向质体的黄素氧还蛋白多肽的外源核酸表达的植物，所 述植物相对于相应的对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状。本发明还提供了在本 发明方法中有用的构建体、用途、植物、可收获的部分和产物。
[0004] 现有技术说明
[0005] 持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。 常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。但是，此 类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经 常含有异源的遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的受欢迎性状。分子生物学 进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质 (一般处于DNA或RNA形式）并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备 多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
[0006] -个具有经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的 可测量结果。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造（例如枝的数 目）、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势（early vigor) 也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对提高作物产量有贡献。
[0007] 种子产量是一个重要的性状，因为许多植物的种子对人与动物营养是重要的。作 物如玉米、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费 种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用 许多类型代谢物的来源。种子含有胚（新枝条和新根的起源）和胚乳（萌发期间及籽苗早 期生长期间用于胚生长的营养来源）。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎 转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为 贮藏大分子以灌满籽粒。
[0008] 对于许多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计 划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在稻 直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的枝条 与萌发势相关。在实施条播（drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好 出幼苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如， 不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质（Corn Belt germplasm)在欧洲大西洋地区 引种玉蜀黍（Zea mayes L.)杂种。
[0009] 又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失 的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50% (Wang等、Planta 218， 1-14,2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、缺乏营养、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引 起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大经济优势并且会 允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
[0010] 环境胁迫是植物生产力和农作物产量的主要限制因素。暴露于负面环境条件下 的植物所经历的许多有害过程是由光合成装置的错误性能在叶绿体中生成的活性氧（ROS) 介导的（Foyer，C.H.等人，（1994)Plant Cell Environ. 17, 507-523, Hammond-Kosack，K. Ε·和 Jones, J.D.G. (1996)Plant Cell 8，1773-1791，Allen，R. (1995)Plant Physiol. 107 I 1049-1054)，光合成电子传递链组分的自发氧化导致了形成超氧化物自由基及其衍生 物、过氧化氢和羟基自由基。这些化合物与多种生物分子反应（最明显的，DNA)，导致细胞 停滞和死亡。
[0011] 为了处理活性氧（ROS)的伤害效应，好氧生物进化出非常有效的抗氧化防御体 系，该体系由酶组件和非酶组件组成。在不同的组织和生物中，抗氧化剂发挥不同的、且通 常是互补的保护功能，例如指导被破坏的氧化敏感型生物分子的ROSl替换性拯救和DNA修 复活性（Fridovich I L (1997). J. Biol. Chem. 272, 1851-1857)。抗氧化胁迫的至少一部 分细胞应答是适应性本能，涉及从头合成抗氧化剂屏障的中坚成员。已经在兼性好氧菌大 肠杆菌中识别出多种多基因的应答，包括由soxRS和oxyR调节子调控的（Hidalgo, E.和 Demple, B. (1996). In Regulation of Gene Expression in Escherichia coli, Molecular Biology Intelligence Unit Series (E. C. C. Lin 和 A. S. Lynch 编著），第 434-452 页， Austin, TX:R. G. Landis) 〇
[0012] soxRS应答似乎经过特定调整，以应对由于细胞暴露在超氧化物自由基或 一氧化氮下所产生的问题。已经鉴别了多种不同的应答组分，包括两种可溶性的黄 素蛋白：含有FAD的铁氧还蛋白-NADP +还原酶（FNR)，及其电子对底物黄素氧还蛋白 (Liochev 等人，（1994) Proc. Natl Acad. Sei. USA 91，1328-1331，Zheng，M.等人，（1999) J. Bacteriol. 181, 4639-4643) 〇
[0013] 黄素氧还蛋白是小的单体蛋白质（Mw 18,800)，含有1分子的非共价结合的 FMN(Razquin，P.等人，（1988) J. Bacteriol. 176, 7409-7411)。FNR 能够以几乎相似的效率 使用黄素氧还蛋白和铁硫蛋白质铁氧还蛋白作为其NADP (H)氧化还原酶活性的底物。在蓝 细菌中，黄素氧还蛋白是在铁饥饿的条件下不能合成铁氧还蛋白时诱导表达的。
[0014] 作为E. coli的soxRS应答的一部分，在用增加超氧化物的化合物（例如氧化 还原循环除草剂甲基vialogen (MV))处理细菌后，FNR和黄素氧还蛋白的水平增加了 20倍以上，而铁氧还蛋白的量则不受影响（Rodriguez, R.E.等人，（1998)Microbiology 144, 2375-2376)。与广泛分布在质体、线粒体和细菌中的FNR和铁氧还蛋白不同，黄素 氧还蛋白的存在似乎大部分局限在细菌中。尚未从植物组织中分离出黄素氧还蛋白， 在拟南芥基因组中也尚未识别出任何黄素氧还蛋白同源物（The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Nature 408,796-815)。已经描述了当暴露在环境胁迫条件下时，相比未 处理过的植物对照，经改造表达黄素蛋白（例如黄素氧还蛋白）的植物表现出增强的耐受 性（参见 申请人:PLANT BIOSCIENCE LTD于2002年10月10日提交的国际专利申请PCT/ GB02/04612,其作为 W02003/035881 公开，下文中按 WO 03/035881 引用）。
[0015] 作物产量因而可以通过优化前述因素之一而提高。
[0016] 取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应 用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应 用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中， 某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对提高种子产量有贡献，无 论形式为增加的种子大小或是提高的种子数目。
[0017] 现在已经发现通过在植物中调节植物中编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达来 改善植物的多种产量相关性状。
[0018] 发明概述
[0019] 本发明涉及了通过专门增加编码靶向质体的黄素氧还蛋白多肽的核酸在植物中 的表达，增强植物的一种或多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有表达特异性增加 的编码质体靶向型黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物，所述植物相比对照植物，具有一种或 多种增强的产量相关性状。本发明还提供了迄今为止未知的包含黄素氧还蛋白编码核酸的 构建体，所述构建体可用于实施本发明的方法。
[0020] 优选的实施方案是用于在植物中相对于对照植物增强一种或多种产量相关性状 的方法，包括在植物中以特定的方式增加编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸表达 的步骤，优选通过重组方法，其中表达是处于与编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸有 效连接的特定启动子序列的控制下的，以及生长所述植物。
[0021] 因此，本发明的一个目标是提供表达构建体和载体构建体，所述构建体包含与有 利的启动子序列有效连接的编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸。提供了这类遗传构建 体用于制备转基因植物的用途，所述转基因植物相比对照植物，具有一种或多种增强的产 量相关性状，优选增加的生物量和/或种子产量。
[0022] 优选的实施方案还有用本发明的一个或多个表达构建体转化的转基因植物，因而 以特定的方式表达编码转运肽和黄素氧还蛋白的核酸，其中所述植物具有一种或多种增强 的产量相关性状。本发明的转基因植物的可收获的部分和源自所述转基因植物的产物及其 可收获部分也是本发明的一部分。
[0023] 特别是还令人惊讶的发现，编码本文定义的转运肽和黄素氧还蛋白的外源核酸在 下文定义的HMGP启动子的控制下表达，导致了在标准的和/或非生物的胁迫条件下，包含 与所述HMGP启动子功能性关联的所述外源核酸的组合的植物相比对照植物增加的生物 量、种子产量和/或增加的糖含量。
[0024] 若干附图简介
[0025] 下面将参考以下附图描述本发明，其中：
[0026] 图1表示具有保守基序和/或结构域的SEQ ID N0:2的结构域结构。使用 软件InterProScan鉴别和可视化所述结构域（参见Zdobnov E.M.和ApweiIer R.; 〃InterProScan_an integration platform for the signature-recognition methods in InterPro. 〃 ；Bioinformatics, 2001，17(9):847-8 ;InterPro database, release Release 36. 0, 2012 年 2 月 23 日）和 InterproScan 软件 4. 8 版，InterPro 数据库 release 41，2013 年2月13日（B)。
[0027] 图2表示用于在甘蔗中特异性表达编码与质体转运肽（TP)融合的黄素氧还蛋白 (FLD)的核酸的二元载体，以TP: :FLD表示，处于HMGP启动子（pHMGP)的控制下。黄素氧还 蛋白、转运肽和HMGP启动子描述在本文中。
[0028] 发明详述
[0029] 定义
[0030] 以下定义将在本申请中自始至终使用。本申请中的章节标题和节标题目的仅在于 方便和参考目的并且不应当以任何方式影响本申请的含义或解释。通常向本申请范围内所 用的技术术语和表述给予在植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的相关领域 中常适用于它们的含义。以下全部术语定义均适用于本申请的完整内容。应理解，如说明 书和权利要求中所使用的，"一"或"一个"可以意指一个或多个，取决于其使用的上下文。 因此，例如，提及"一个细胞"可以意指可利用至少一个细胞。
[0031] 与某属性或值相联系的情况下，术语"基本上"、"约"、"大约"等还分别具体地确切 限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语"约"特别设计处于给予的 所述值或范围的20%以内、10%以内或5%以内的值或范围。如本文所用，术语"包含"也 包括术语"由……组成"。
[0032] 狀/蛋白质
[0033] 除非本文中另外提到，术语"肽"、"寡肽"、"多肽"和"蛋白质"在本文中可互换使 用并且指由肽键连接在一起的处于任意长度的聚合形式下的氨基酸。
[0034] 多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0035] 术语"多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"、"核酸"、"核酸分子"在本文中可互 换使用并且指任意长度聚合无分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二 者组合。
[0036] 同源物
[0037] 蛋白质的"同源物"包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的 所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与其所源自的非修饰蛋白质具有基本 相同的生物学活性和功能活性。基因的"同源物"涵盖了相对于非修饰的所讨论蛋白质具 有核苷酸替换、缺失和/或插入的核酸序列的基因，并且与其所源自的非修饰基因具有基 本相同的生物学活性和/或功能活性，或者编码与非修饰的核酸序列所编码的多肽具有基 本相同的生物学活性和功能活性的多肽。
[0038] 术语"核苷酸"指由核碱基、戊糖和至少一个磷酸基组成的核酸构件。因此，术语 "核苷酸"包括核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。
[0039] 直向同源物和旁系同源物是同源物的两种不同的形式，并且涵盖用来描述基因或 蛋白质先祖关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内通过先祖基因或蛋白质复制而起源 的基因或蛋白质；直向同源物是来自不同生物的通过物种形成而起源的基因或蛋白质，并 且也来源于共同的先祖基因或蛋白质。
[0040] "缺失"指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸，或者从核酸中移除一个或多个核苷 酸。
[0041] "插入"指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入，或者一个或多个 核苷酸在核酸序列中预定位点内的引入。对于蛋白质，插入可以包含氨基端融合和/或羧 基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基 端融合或羧基端融合小，约1-10个残基的级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子 包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、 (组氨酸）-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、 Tag · 100表位、c-myc表位、FLAG?-表位、lacZ、CMP (钙调蛋白结合肽）、HA表位、蛋白 C表位和VSV表位。
[0042] "取代"指以具有相似特性（如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋 结构或折叠结构的倾向）的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个 残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束。氨基酸取代优选地是保守 性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的（见例如Creighton(1984)Proteins. W. Η· Freeman 和 Company (编著）和下表 1)。
[0043] 表1 :保守性氨基酸取代的例子
[0044]
【权利要求】
1. 相对于对照植物在植物中增强一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括增加 编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸在植物中的表达，其中所述表达处于与编码转 运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸有效连接的启动子序列的控制下，且其中启动子序列包括 高迁移率蛋白质（HMGP)启动子的核苷酸序列，优选稻的HMGP启动子；或其功能片段或衍生 物。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述HMGP启动子的核苷酸序列包括至少70%的SEQ ID NO:7所示序列。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述转运肽将黄素氧还蛋白多肽靶向质体，优选叶 绿体。
4. 根据权利要求3的方法，其中所述叶绿体转运肽选自表3列举的转运肽或其同源物。
5. 根据权利要求1至4的任一项的方法，其中所述黄素氧还蛋白多肽是由选自表2列 举的核酸序列或其同源物的核酸序列编码的。
6. 根据权利要求1至5的任一项的方法，其中所述黄素氧还蛋白多肽来自项圈藻属物 种，优选项圈藻PCC7119。
7. 根据权利要求1至7的任一项的方法，包括 (a) 用包含外源核酸的表达盒稳定转化植物细胞，所述外源核酸编码转运肽并编码黄 素氧还蛋白多肽，其中外源核酸与启动子序列功能连接的，所述启动子序列包括权利要求1 或2定义的HMGP启动子的核苷酸序列，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； (b) 从植物细胞再生植物；和 (c) 表达所述外源核酸。
8. 根据权利要求1至7的任一项的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状 包括相对于对照植物增强的生物量，优选相对于对照植物增强的地上生物量和/或种子产 量。
9. 根据任一前述权利要求的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状是相比对 照植物增加的植物种子产量。
10. 根据权利要求1至9的任一项的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状是 在非胁迫条件下获得的。
11. 根据权利要求9的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状是在非生物胁 迫，优选干旱胁迫、盐胁迫和/或氮缺乏的条件下获得的。
12. 表达构建体，包括： (i) 编码权利要求3或4的任一项定义的转运肽、和黄素氧还蛋白多肽的核酸序列； (ii) 能够驱动权利要求1或2定义的（i)的核酸序列表达的启动子序列；和任选的 (iii) 转录终止序列。
13. 包含权利要求12的表达构建体的重组表达载体。
14. 权利要求12的表达构建体或权利要求13的重组表达载体的用途，用于制备相对于 对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的转基因植物的方法，优选增加的生物量， 更优选相对于对照植物增加的地上生物量和/或种子产量。
15. 用于生产转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，所述转基因植 物、转基因植物部分或转基因植物细胞相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性 状，优选增加的生物量，包括： (a) 在植物、植物部分或植物细胞中导入权利要求13的重组载体构建体或权利要求12 的表达构建体； (b) 从转化的植物、转化的植物部分或转化的植物细胞产生转基因植物、转基因植物部 分或转基因植物细胞；和 (c) 表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸。
16. 权利要求15的方法，还包括收获转基因植物的繁殖材料和种植繁殖材料和将繁殖 材料生长成植物的步骤，其中繁殖材料包括编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸， 和与其有效连接的启动子序列。
17. 能够通过根据权利要求1至11、15或16的任一项的方法获得的转基因植物、转基 因植物部分或转基因植物细胞，所述转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞表达 编码权利要求1-7的任一项定义的所述处于启动子序列控制下的转运肽和黄素氧还蛋白 多肽的外源核酸。
18. 用权利要求12的表达构建体或权利要求13的重组表达载体转化的转基因植物、转 基因植物部分或转基因植物细胞，包括与权利要求1-7的任一项定义的编码转运肽和黄素 氧还蛋白多肽的核酸有效连接的启动子序列。
19. 权利要求17或18的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，其中转基因 植物、转基因植物部分或转基因植物细胞相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关 性状，优选增强的生物量，更优选增加的种子产量和/或地上生物量。
21.根据权利要求18至20的任一项的转基因植物的可收获部分，其中所述可收获部分 包括权利要求12的表达构建体并且是地上器官，优选是茎或其部分。
21. 由根据权利要求17至19的任一项的转基因植物或由权利要求20的转基因植物的 可收获部分生产的产品，其中所述产品包括权利要求12的表达构建体。
22. -种用于生产产品的方法，包括以下步骤：生长根据权利要求17至19的任一项的 转基因植物，并从所述植物或部分，优选植物的种子和/或茎生产所述产品，或利用所述植 物或部分，优选植物的种子和/或茎生产所述产品。
23. 用于植物改良的方法，包括 a) 通过权利要求1至11、15或16的任一项的方法获得转基因植物； b) 在一个植物细胞中，组合a)的植物的至少一个植物细胞的遗传材料，与至少一个细 胞的一个或多个基因不同于a)的植物的植物细胞的遗传材料，或杂交a)的转基因植物与 第二种植物； c) 从b)的一个植物细胞生成的至少一株植物或步骤（b)的杂交植物获得种子； d) 种植所述种子并将所述种子生长成植物；和 e) 从所述植物中选择表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物；和任选的 f) 从表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物生产繁殖材料。
24. 权利要求12的表达构建体或包含这样的表达盒的重组染色体DNA，所述表达盒包 含权利要求12的项目（i i)定义的启动子，如权利要求12的项目（i)定义的编码与黄素 氧还蛋白连接的转运肽的核酸，和功能连接的转录终止序列，其中构建体或重组染色体DNA 包含在植物细胞中。
25.根据权利要求1至11、15、16、22或23的任一项的方法，根据权利要求17至19的任 一项的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，或根据权利要求14的用途，根据 权利要求20的可收获部分，或根据权利要求21的产品，或权利要求24的构建体或重组染 色体DNA，其中所述植物细胞来自或所述植物选自菜豆、大豆、豌豆、三叶草、葛、紫花苜蓿、 兵豆、羽扇豆、野豌豆、落花生、稻、小麦、玉米、大麦、拟南芥、兵豆、香蕉、油菜籽油菜包括卡 诺拉油菜、棉花、土豆、甘蔗、苜蓿、甜菜、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、 单粒小麦（einkorn)、埃塞俄比亚画眉草（teff)、买罗高粱（mi 1〇)和燕麦（oat)。
【文档编号】C12N15/29GK104364379SQ201380028973
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年4月2日
【发明者】C·勒佐 申请人:巴斯夫植物科学有限公司