使用重组负链rna病毒载体表达异源蛋白质的方法

使用重组负链rna病毒载体表达异源蛋白质的方法
【专利摘要】本发明提供一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法，所述方法包括通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染所述细胞以将至少一种异源核酸序列引入至细胞中，其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白。此外，本发明提供由所述方法体外制备的细胞或细胞群和包含所述细胞或细胞群的药物组合物。
【专利说明】使用重组负链RNA病毒载体表达异源蛋白质的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用复制缺陷的但有转录能力的重组负链RNA病毒在细胞中表 达至少一种异源核酸序列的方法。特别地，本发明涉及将细胞重编程为较低分化状态的体 外方法和使用所述重组负链RNA病毒载体的体内和体外基因治疗方法。此外，本发明涉及 由所述体外方法制备的细胞或细胞群和所制备的细胞或细胞群作为药物的用途。

【背景技术】
[0002] 重组病毒载体为已知可用于将外源基因引入哺乳动物细胞中W介导稳定的转基 因表达的几种试剂中的一种。已将不同的病毒用于该目的，包括逆转录病毒，疮疹病毒，腺 病毒，和腺相关病毒。该些重组病毒因其在病毒疫苗生产中的用途和作为基因治疗载体用 于治疗基因缺陷疾病而被知晓。重组病毒的其它应用包括通过逆转录病毒或慢病毒介导的 转导和特定细胞的重新分化和重编程因子的表达而将细胞去分化为被称作诱导性多功能 干细胞（iP巧的多能细胞。
[0003] 在上述病毒介导方法中，与基因传递相关的一个严重问题是来自病毒载体的遗传 物质整合到宿主细胞基因组DNA中，该可导致宿主细胞的恶性转化。特别地，逆转录病毒介 导的基因（例如编码重编程因子的基因）传递，可导致转基因的基因组整合。该可能会触 发原癌基因的激活或破坏肿瘤抑制基因，导致细胞的恶性转化。与整合病毒载体相关的另 一个问题是整合的和下调的转基因可被重新激活导致细胞转化。
[0004] 其它问题包括用于基因传递的病毒可被传递到患者的邻近的健康细胞或从患者 传递到其他个体或环境中的可能性。另一个问题是所述病毒载体可能存留并造成不良影 响，如对病毒成分的免疫反应或病毒性感染的延迟效应。此外，长期的外源基因的表达可导 致对自身抗原的类自身免疫反应或干扰细胞过程如信号通路。
[0005] 为了增加在体外和体内过程中外源基因传递到宿主细胞的安全性，尤其是考虑到 所述病毒载体的不期望的传播，已提出不同的策略。例如，在WO2006/084746Al中描述了 复制缺陷的但有转录能力的负链RNA病毒。由于其改进的安全性，该种病毒被描述为适合 作为活疫苗使用。
[0006] 此外，为避免基因插入祀细胞基因组中引起的任何问题，尝试引入不在祀细胞基 因组中整合的病毒基因构建体并允许异源基因产物的瞬时表达。例如，WO2010/008054Al 描述了一种用染色体非整合的病毒载体如仙台病毒（Sendaivirus)载体生产类ES(胚细 胞）细胞的方法。然而，该病毒载体能在被感染的祀细胞中有效复制，并因此所生成的病毒 颗粒将在每次细胞分裂后的子细胞中均匀分布。因此，所产生的类ES细胞在它们的细胞质 中包含不需要的高病毒载量。
[0007] 在WO2010/134526Al中描述了相似的方法，其中仙台病毒载体被用于将体细胞 重编程为诱导性多能干细胞（iPS)，所述仙台病毒载体不导致载体序列整合入宿主细胞的 基因组中，并因此降低由载体序列随机整合入宿主基因组引起的致瘤性转化的风险。然而， 由于WO2010/134526Al中所描述的仙台病毒载体是有能力复制的，在重编程后需要付出 相当大的努力去除它W确保足够的安全性。此外，由于在WO2010/134526Al使用的用于 去除所述病毒的SiRNA的递送率（deliveryrate)和SiRNA介导的表达抑制都没有达到 100%，该方法不能充分的排除与使用活病毒相关的健康风险。
[0008] 发明目的
[0009] 考虑到现有技术，本发明的目的是提供一种具有改进的安全性且能在足够长的时 期内有效地表达异源核酸序列的新型病毒载体。特别地，本发明旨在提供用于在祀细胞中 传递和表达编码治疗性蛋白质的基因的方法，作为用于多种疾病的基因治疗方法。此外，本 发明旨在传递和表达编码细胞重编程或编程因子的基因W将至少部分分化的细胞重编程 为适合在再生治疗中使用的较低分化的细胞或将细胞编程为具有所需分化状态的细胞。
[0010] 发明概沐
[0011] 第一方面，本发明涉及一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法。所述方 法可为体内或体外方法且包含通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载 体感染细胞将至少一种异源核酸序列引入至细胞中的步骤，其中所述重组负链RNA病毒载 体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒 基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白质。
[0012] 在一个优选的实施方案中，通过体外方法将至少部分分化的细胞重编程为较低分 化的细胞，所述体外方法包括；(a)提供来自供体的至少部分分化的细胞，化）通过用包含 至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染所述细胞W将至少一种异源核酸序 列引入至所述细胞中，和（C)在能有效表达所述至少一种异源核酸序列的条件下培养所述 受感染的细胞，其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而 病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编 码细胞重编程因子。
[0013] 在另一个优选的实施方案中，通过体外方法将要被编程的细胞编程为所需的分化 状态，所述体外方法包括：(a)提供来自供体的要被编程的细胞，化）通过用包含至少一种 异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染所述细胞W将至少一种异源核酸序列引入至 所述细胞中，和（C)在能有效表达所述至少一种异源核酸序列的条件下培养所述受感染的 细胞，其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录 能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞编 程因子。
[0014] 在另一个优选的实施方案中，通过体内方法治疗遗传病，所述体内方法包含将包 含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体施用于患者W将所述至少一种异源核 酸序列引入至患者细胞中，其中所述重组负链RNA病毒包括编码导致病毒基因组复制能力 丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸 序列编码能治疗所述遗传病的治疗性蛋白质。
[0015] 在另一个仍然优选的实施方案中，通过体外方法治疗遗传病，所述体外方法包含： (a)提供来自供体的细胞，化）通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体 感染所述细胞W将至少一种异源核酸序列引入至所述细胞中，和（C)在能有效表达所述至 少一种异源核酸序列和/或允许细胞扩增的条件下培养所述受感染的细胞，其中所述重组 负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变 的P蛋白的病毒基因组，且其中所述至少一种异源核酸序列编码能治疗所述遗传病的治疗 性蛋白质。
[0016] 第二方面，本发明涉及通过本发明所述体外方法制备的细胞或细胞群。该细胞和 细胞群可用于药物，尤其是用作在基因治疗或再生治疗中使用的药物。
[0017] 第H方面，本发明涉及包含由本发明所述体外方法制备的细胞或细胞群，或包含 源自通过本发明体外重编程方法制备的细胞或细胞群的再分化的细胞或再分化的细胞群 的药物组合物。
[0018] 本发明优选的实施方案在权利要求书中提出。
[0019] 通过参考下面详细的说明、实施例和附图可更加充分地理解本发明。

【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1显示了用SeV-PA2-77/GFP(绿色英光蛋白）转导的Vero细胞在第一天（dl)、 第六天（d6)、第12天（dl2)和第30天（d30)在100倍放大下的光学显微图像（上部）和 英光图像（中下部）。
[0021] 图2为显示与作为负对照的未转导的人包皮成纤维细胞（HF巧和作为正对照的含 GFP转基因和0ct4转基因的重组慢病毒载体相比，在用SeV-PA2-77/0ct4分别W3或20 的感染复数转导的HFF细胞中，在第2天、第5天、第8天和第12天（d2、d5、d8和dl2)的 mRNA表达的柱状图。
[0022] 图3为显示与作为负对照的未转导的人包皮成纤维细胞（HFF)和作为正对照的含 GFP转基因和Nanog转基因的重组慢病毒载体相比，在用SeV-PA2-77/Nanog分别W3或 20的感染复数转导的HFF细胞中，在第2天、第5天、第8天和第12天（d2、d5、d8和dl2) 的mRNA表达的柱状图。
[0023] 发明详沐
[0024] 本发明提供一种在细胞中表达编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白质的异 源核酸序列（本文有时称作"转基因"）的方法。所述方法基于特定的重组负链RNA病毒载 体的使用。该重组负链RNA病毒载体被设计为携带至少一种异源核酸序列且其特征在于其 复制缺陷但仍具有在一定程度上使感兴趣的异源蛋白质有效生产的转录能力。
[0025] 本发明总体上不涉及接种疫苗，特别是所述重组负链RNA病毒载体作为疫苗的用 途。也就是说，由所述重组负链RNA病毒载体编码的细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白 质不被用于，且通常不适用于，接种疫苗的目的。
[0026] 在本发明的方法中，所述重组的复制缺陷的负链RNA病毒载体被用于感染细胞 (本文有时称作"宿主细胞")，从而在所述细胞中引入至少一种异源核酸序列。所引入的核 酸为RNA，其不整合到所述细胞的基因组中而是留在细胞质中，在细胞质中它作为病毒RNA 依赖的RNA聚合酶（vR服P)的模板W产生由祀细胞的翻译组件解码的正RNA链W产生所需 的异源蛋白质。
[0027] 令人梅奇地，发现本发明所述方法导致高的转基因表达水平而同时具有优良的安 全性。在用本发明中使用的所述复制缺陷的RNA病毒感染期间，出现比野生型RNA病毒更 少的模板。考虑到模板数量的减少，使用本文中描述的复制缺陷的RNA病毒所观察到的异 源蛋白质表达是出乎意料地高。
[0028] 此外，本发明的方法排除了与染色体整合相关的恶变的风险，因为负链RNA病毒 被认为不整合入宿主染色体中。此外，排除了随后的编码重编程因子的染色体整合的基因 在分化的细胞中重新表达的风险。同时，所述复制缺陷的负链RNA病毒载体不被传递到患 者的邻近的健康细胞或从患者传递到其他个体或传递到环境中。
[0029] 此外，所述复制缺陷的负链RNA病毒颗粒平均分布于在每个细胞分裂循环中产生 的子细胞中，并因此被逐步稀释到检测不到的水平。换句话说，复制缺陷的负链RNA病毒载 体从被感染的祀细胞中完全清除而不需额外的如现有技术中描述的复杂的纯化。
[0030] 此外，本发明的复制缺陷的负链RNA病毒载体绕开了与病毒载体的存留有关的风 险，如对病毒成分的免疫反应，病毒性感染的延迟效应，对自身抗原的类自身免疫反应，内 源宿主基因的表达改变和不可预知的不良事件。
[0031] 所述RNA病毒载体在具有复制缺陷的同时所具有的转录其RNA基因组的能力是所 述病毒P蛋白中突变的结果。所述P蛋白是由P蛋白质和L蛋白质组成的病毒RNA依赖的 RNA聚合酶（vR服P)的一部分。所述VRd化既进行病毒的转录也进行病毒的复制。该两个 功能因此在负链RNA病毒中禪合。发现P蛋白中的突变导致所述病毒基因组复制能力的丧 失而引入的异源核酸序列的表达所必需的病毒转录能力并没有丧失。换句话说，P蛋白中 的某些突变解开了所述VRd化的复制和转录活性的禪合。
[0032] 祀细胞感染后，本文描述的复制缺陷的负链RNA病毒允许所述病毒蛋白质和由包 括在所述病毒基因组中的至少一种异源核酸序列编码的异源蛋白质的表达。为了表达所述 异源基因产物，本发明中使用的重组病毒必须能进行早期初级转录。如本文所用，所述术语 "早期初级转录"是指在受感染的宿主细胞中首次转录事件，其中所述病毒RNA基因组由最 初包括在病毒颗粒中的vRd化分子转录。
[0033] 此外，本发明中使用的重组病毒必须能进行晚期初级转录。所述术语"晚期初级转 录"，如本文所用，是指全新的蛋白质（denovoprotein)合成开始且转录越来越多地由新 合成的VRd化实施的阶段。与早期初级转录不同，在晚期初级转录过程中所述病毒复制取 决于全新蛋白质的合成。值得注意的是，在现有技术中，但不是在本文中，术语"次级转录 (secondarytranscription)"有时被用作晚期初级转录的同义词。
[0034] 一旦已产生出足够量的N蛋白质，所述VRd化切换到复制模式W合成反基因组 (antigenome)。从反基因组模板，新的基因组被复制且被N蛋白质包壳。随着细胞中用于 病毒转录的模板数量增加，所谓的"次级转录"阶段开始，其具有比初级转录更高的转录效 力。如本文所用，术语"初级转录"是指早期和晚期初级转录二者，除非另有说明。
[00巧]优选地，所述重组病毒载体实施晚期初级转录的能力为该样的，蛋白质合成是对 应的野生型病毒（即在基因P中无本文描述的突变的病毒）的病毒蛋白合成的至少1%，至 少2%，至少3%，至少4%，或至少5%。所述晚期初级转录活性优选比对应的野生型病毒 的晚期初级转录活性低不超过20倍，更优选低不超过10倍。晚期初级转录能力可通过异 源基因产物例如报告蛋白的定量测定来确定，正如所描述的（参见，例如，WO2006/084746 Al的实施例7. 1和7. 3,其公开的内容通过引用并入本文）。
[0036] 在该一点上，应该注意上述异源表达水平出乎意料地高，考虑到在用（具有复制 能力的）野生型RNA病毒感染期间，与本文中使用的不能产生作为转录和复制模板的核糖 核蛋白复合物（RN巧的复制缺陷的RNA病毒相比，有约500至约1000倍更多的模板。
[0037] 在本发明的含义中，"复制能力的丧失"是指在祀细胞也就是不提供和补充任何受 P基因突变影响的反式（intrans)功能的细胞中，不能检测出残余的复制能力，即不能检 测出病毒基因组的扩增。实际上，认为所述病毒复制被完全废除。与减少的或有条件的复 制缺陷不同，并没有允许病毒基因组复制的允许条件。复制能力的丧失可按照本领域中描 述的方法测定（参见，例如WO2006/084746Al中实施例8,其公开的内容通过引用并入本 文）。
[0038] 本发明中使用的重组的负链RNA病毒载体优选来源于单股反链病毒目 (Mononegavirales)的非节段负链RNA病毒，包括野生型株、突变株、实验室传代株、疫苗接 种株、遗传构建株等等。如本文所用，术语"病毒载体"是指可被转染入细胞且可在细胞基 因组内或独立于细胞基因组进行复制的来源于病毒的核酸，包括完整的病毒或病毒颗粒， 或由病毒基因组和相关蛋白质组成的病毒核也。本发明中使用的复制缺陷的负链RNA病毒 载体可通过基因改造原始的负链RNA病毒获得。
[0039] 重组负链RNA病毒载体所来源的病毒可选自属于副粘病毒科（Paramyxovirdae)、 弹状病毒科巧h油doviridae)、丝状病毒科（Filoviridae)、波纳病毒科炬ornaviridae)、 沙粒病毒科（Arenaviridae)或布尼亚病毒科炬unyaviridae)的负链RNA病毒，或其重组 变体。在本发明中特别优选使用的是副粘病毒，如仙台病毒；副流感病毒（PIV)，如人类副 流感病毒化PIV)l、2、3、4a或4b型；鸡新城疫病毒；腮腺炎病毒；麻疹病毒；牛癌病毒；人 类呼吸道合胞体病毒巧SV);或弹状病毒，如为水疮性口炎病毒（VSV)或狂犬病病毒。在本 发明的一个特别优选的实施方案中，所述病毒为仙台病毒，如仙台伏见株（Sendai化Shimi strain)(ATCCVR105)、仙台哈里斯株（SendaiHarrisstrain)、仙台Cantell株（Sendai Cantellstrain)或仙台Z株（SendaiZstrain)。
[0040] 可根据受感染细胞的类型和应用来选择合适的重组负链RNA病毒载体。例如，仙 台病毒和腮腺炎病毒具有非常宽的宿主细胞特异性。仙台病毒可感染多种组织类型的各种 动物细胞，如马源细胞和各种动物的B淋己细胞。可选地，使用具有高宿主特异性的负链 RNA病毒如麻疹病毒或牛癌病毒可能是可取的。也可使用具有人工改造的宿主细胞特异性 的病毒。
[0041] 根据本发明，由本发明使用的重组RNA病毒的病毒基因组编码的突变P蛋白包含 导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的至少一种突变。所述至少一种突变 不受限于特定的突变类型且包括缺失、替换和/或插入，条件是它导致复制能力的丧失而 病毒转录能力不丧失，优选地不丧失所述早期和/或晚期初级转录能力。
[0042] 所述突变影响各负链RNA病毒的P蛋白的N端区域。优选地，在P基因中的所述 至少一种突变为仙台病毒P蛋白的氨基酸序列2-77(按照例如WO2006/084746Al编号） 尤其是氨基酸序列33-41的一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换，或如果不是仙台病毒， 则为与仙台病毒P蛋白的氨基酸序列2-77,尤其是氨基酸序列33-41对应或同源的氨基酸 序列的缺失、插入或替换。
[004引在本发明的含义中，术语"同源的"是指同源性程度至少50 %，60 %，70 %，80 %或 90%。在更优选的实施方案中，术语"同源的"是指氨基酸同源性值（identityvalue)高 于 45% ,55% ,65% ,75% ,85%或 95%。
[0044] 特别优选的是仙台病毒的P蛋白的氨基酸序列2-77的一个或多个氨基酸的缺失 或，如果不是仙台病毒，则为非仙台病毒的病毒的P蛋白对等物中对应的或同源的氨基酸 序列的缺失。最优选的是仙台病毒的氨基酸2-77或33-41的缺失或，如果不是仙台病毒， 则为非仙台病毒的病毒的P蛋白对等物中对应的或同源的氨基酸序列的缺失。此外，仙台 病毒P蛋白下游第320位氨基酸的C末端区域或非仙台的病毒的P蛋白对等物的对应的或 同源的C末端区域优选不包含突变，因为该C末端区域被认为对病毒的转录是必不可少的。
[0045] 除了上述的P基因中的突变外，所述重组RNA病毒载体可包含在一种或多种其它 病毒基因中的额外的突变，该些突变优选地减少病毒传播或病毒细胞毒性，改变病毒细胞 特异性或介导病毒的衰减。例如，所述重组RNA病毒载体可在编码病毒包膜蛋白的其中一 个基因中额外地具有突变或缺失。
[0046] 并且，所述重组RNA病毒载体由于病毒P蛋白中N端的缺失可在C，W，和/或V开 放阅读框（ORFs)中具有一种或多种突变，因为所述C，W和VORF与所述P基因的N端ORF 部分重叠。此外，本文中所用的重组RNA病毒载体可额外地具有C'基因的可选的起始密码 子ACG的缺失。所述C'基因编码已知在感染的细胞中表现出抗干扰素响应活性的非结构 性蛋白质。发现，C'基因中起始密码子的缺失导致在感染的祀细胞中异源基因产物的表达 水平增高。通常，因此获得的转基因表达的增高为至少约5%，优选至少约10%和更优选至 少约20%。
[0047] 根据本发明，所述重组负链RNA病毒载体进一步包含编码异源基因产物的至少一 种异源核酸序列。如本文所用，术语"异源"是指来源于非本发明中使用的复制缺陷的负 链RNA病毒载体源的蛋白质或核酸。所述异源基因产物优选为蛋白质，特别是介导或促进 细胞的细胞重编程至较低分化状态的重编程因子、分化给定细胞至所需的分化状态的编程 因子和治疗性蛋白质。然而，它也可为核酶（ribozoyme)、反义分子、SiRNA分子、miRNA或 PiRNA分子。所述异源核酸序列通常包括在病毒基因组中且与适当的表达控制序列可操作 地连接。
[004引如本文中所用，术语"重编程因子"或"细胞重编程因子"是指异源基因产物，优选 地指能够通过自身或与其它基因或异源基因产物结合将至少部分分化的细胞转化为较低 分化的细胞的蛋白质或miRNA。促进细胞重编程的辅助因子（即该些辅助因子提高细胞重 编程的效率）也包含在本文所用的术语"重编程因子"中。细胞重编程因子通常为由在胚 胎干细胞或早期胚胎中表达但在多数分化的体细胞内不表达或表现出降低的表达的基因 编码的蛋白质。该样的胚胎干细胞特异性基因通常是转录因子和核蛋白质。
[0049] 本文所用的优选的细胞重编程因子选自由Oct-3、Oct-4、Sox2、c-Myc、Klf4、 Nanog、Lin28、AS化 1、MYTIL、TBX3b、SV40 大T、hTERT、miR-291、miR-294、miR-295 及其组 合组成的组。
[0050]由所述至少一种异源核酸序列编码的"编程因子"是指能将给定细胞分化至所 需分化状态的因子。其实例包括，但不仅限于，神经生长因子（NGF)、纤维母细胞生长因子 (FGF)、白细胞介素-6 (比-6)、骨形成蛋白炬MP)、神经源素3 (Ngn3)、膜腺十二指肠同源框 1 (Pdxl)、田安（Ma化），及其组合。
[0051] 本发明中所用的治疗性蛋白质包含在遗传疾病中（通常是由于突变）机能失调的 生物活化型蛋白质，如严重联合免疫缺陷中的腺巧脱氨酶（ADA),慢性肉芽肿病（chronic granuloma1:usdisorder)中的p91-PH0X,血友病B中的因子IX，血友病A中的因子VIII， 囊胞性纤维症中的囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR)，镶状细胞性贫血中的目-球蛋白 化BB)，杜氏肌营养不良症中的抗肌萎缩蛋白，莱施-奈恩综合征（Lesch-Nyhansyn化ome) 中的次黄嘿岭-鸟嘿岭磯酸核糖转移酶（HGPRT)，苯丙丽酸尿中苯丙氨酸轻化酶（PAH)，高 雪氏病（Gaucher'Sdisease)中的葡糖巧醜銷氨醇酶（GBA和GBA2)，马凡综合征（Marfan syn化ome)中的原纤蛋白-I(FBNl)，和亨廷顿氏舞蹈症化untington'Sdisease)中的亨廷 顿蛋白化TT)，及其组合。
[0052] 本发明的方法也可通过递送一种或多种治疗性基因而用于多因子遗传疾病的治 疗。例如，用于治疗高胆固醇血症的治疗性基因包括载脂蛋白B(apoB)，低密度脂蛋白受 体（LDLR)，低密度脂蛋白受体衔接蛋白I(LDLRAPI)，前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)， W及它们的组合。此外，用于治疗帕金森氏病的治疗性基因包括a-突触核蛋白（SNCA)， 帕金（P服脚，富含亮氨酸的重复激酶2 (LR服2)，PTEN诱导的推断的激酶1 (PINKl)，帕金森 蛋白7(0尸1)，和41?酶型1342(41?1342)。此外，用于治疗癌症的治疗性基因包括肿瘤自 杀基因，抗血管生成因子，和自体肿瘤抗原，包括酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)和癌胚抗原 (CEA)O
[0053] 合适的治疗性蛋白，尤其是适合用在癌症免疫疗法中的治疗性蛋白，可进一步包 括免疫刺激因子，如生长因子包括粒细胞-巨瞻细胞集落刺激因子（GM-CS巧和上皮生长因 子巧GF)，和细胞因子包括白介素IL-2、IL-4、IL-5、比-12和IL-17,也包括免疫抑制蛋白 质例如干扰素。
[0054] 复制缺陷的RNA病毒载体中包含的异源核酸序列可来源于人类或其它哺乳动物， 取决于应用和所述核酸序列将要被传递进入的祀细胞。所述核酸序列和所编码的氨基酸序 列不必然是野生型序列只要所述异源基因产物具有与野生型基因产物相当的功能活性。所 述核酸序列可包含核巧酸交换、插入或缺失。所述异源基因产物可被表达为融合蛋白，例如 额外包含标签，优选VP16标签。
[0055] 如果需要所述异源核酸序列的高表达，那么优选将所述序列插入到所述病毒负链 RNA基因组的3'区，优选直接在病毒N基因之前。原因在于如副粘病毒的负链RNA病毒在 它们负链基因组的3'末端最为有效地转录转录单元。更下游的基因的转录水平逐渐下降， 该一现象被称为极化效应（polarityeffect)。该允许通过将其插入在所述病毒基因组的 不同位点来调节异源转基因的表达水平。因此，编码具有细胞毒性或致癌潜能的异源基因 产物（例如，C-Myc)的核酸序列可被插入到所述病毒负链基因组的5'区。方便地，异源核 酸序列可作为转录盒（transcriptionalcassettes)插入。可将多个异源核酸序列作为单 独的转录盒插入到病毒基因组中。转录盒通常包含与转录起始序列、转录终止子、和优选地 翻译信号可操作地连接的的编码异源基因产物的核酸序列。
[0056] 可操作地连接异源核酸序列与mRNA稳定元件也是可能的。例如，±拨鼠肝炎病毒 转录后调控元件（WPR巧可被插入到转基因的3'UTR区域W稳定它的mRNA和延长它的表 达。
[0057] 在本发明的语境中，所述复制缺陷的负链RNA病毒载体可包含不止一种编码异源 基因产物的核酸序列。可选地，可同时使用不止一种复制缺陷的负链RNA病毒载体，各载体 含至少一种编码异源基因产物的异源核酸序列。例如，复制缺陷的负链RNA病毒载体可包 含数个编码不同重编程因子的核酸序列。可选地，可同时使用多个含编码不同重编程因子 的不同核酸序列的复制缺陷的负链RNA病毒载体。
[0058] 可W溶液、息浮液、冻干态或任何可选形式提供所述复制缺陷的负链RNA病毒载 体。也可与抑调节剂、缓冲液、用于毒性调节的试剂如氯化轴或右旋糖、润湿剂、助剂等结 合提供。
[0059] 合适的病毒载体剂量取决于预期应用，患者的身体状况、体重、年龄和性别，施药 形式，和组合物。通常地，每剂的载体颗粒的数量从至少IxIO4至IxlO8间变化，优选从5x 1〇5至Ix1〇7,取决于应用。换句话说，用本发明的重组病毒载体感染优选W0.01至50的 感染复数（MOI)，更优选0. 5至30的感染复数进行实施，取决于应用。
[0060] 本发明的复制缺陷的负链RNA病毒载体可借助于病毒生产细胞和病毒扩增细胞 按照WO2006/084746Al中的描述制备，其所公开的内容通过引用并入本文。
[0061] 病毒生产细胞用于病毒颗粒的初始生产。所述病毒生产细胞优选为真核细胞，更 优选哺乳动物细胞。所述病毒生产细胞优选包含编码本发明中使用的复制缺陷的RNA病毒 载体的DNA分子，W及其基因产物允许本发明的重组病毒颗粒反式（intrans)组装的辅 助序列。所述辅助序列包含所述病毒N蛋白，病毒P蛋白，和/或病毒L蛋白，优选病毒N 蛋白和病毒P蛋白。所述辅助细胞可包含一种或多种额外的质粒载体，其W反式方式（in trans)提供所述病毒N蛋白，病毒P蛋白，和/或病毒L蛋白。优选地，所述辅助序列包含 病毒P基因和除此外的病毒N基因，因为出人意料地发现病毒颗粒的生产可W通过病毒N 和P基因的共表达而显著增加。
[0062] 优选地，所述辅助序列在病毒生产细胞中与允许通过依赖DNA的RNA聚合酶转录 的转录信号可操作地连接。优选地，所述转录信号为给定的病毒生产细胞的异源转录信号， 例如，瞻菌体启动子如T7或SP6启动子。在该种情况下，所述病毒生产细胞必须包含相应 的异源的依赖DNA的RNA聚合酶，例如T7或SP6RNA聚合酶，其介导辅助序列的转录。
[0063] 本发明中使用的编码复制缺陷的RNA病毒的DNA分子优选为不仅适合在载体扩增 细胞（即在原核载体扩增细胞如大肠杆菌中）中，也适合在真核辅助细胞中，尤其是在哺乳 类病毒生产细胞中增殖的载体（如质粒载体）。所述载体包含在所述细胞中增殖所必需的 遗传元件，如复制起点和/或选择标记序列。
[0064] 编码所述病毒基因组的DNA分子通常与上述与辅助序列相连的转录信号可操作 地连接。一般地，所述DNA分子在编码病毒基因组的DNA序列的3'末端还包含转录终止子 和核酶序列。所述核酶序列允许在病毒序列3'末端切开转录物。
[0065] 所述病毒扩增细胞用于扩增在病毒生产细胞中初始组装的病毒颗粒。从病毒生产 细胞中得到的所述重组复制缺陷的RNA病毒用于感染所述病毒扩增细胞。所述病毒扩增细 胞包含上述提供病毒N蛋白、病毒P蛋白和/或病毒L蛋白的辅助序列。优选地，使用稳定 表达辅助序列（所述辅助序列并入其基因组）的病毒扩增细胞。优选地，所述病毒扩增细 胞被基因改造W使其只表达所述病毒N蛋白和P蛋白，不表达所述病毒L蛋白，因为出人意 料地发现该共表达引起最高的病毒生产速率。
[0066] 优选地，所述病毒扩增细胞为哺乳动物细胞。特别地，所述病毒扩增细胞可为存放 在德国微生物和细胞培养物保藏中也（GermanCollectionofMicroorganismsandCell 化ltures)编号为DSMACC2702的肥9细胞。其它适合的病毒扩增细胞为源于Vero细胞（非 洲绿猴肾细胞系）的细胞或源于LLCMK2细胞（恒河猴肾细胞系）的细胞，该些细胞被上述 辅助序列（即所述病毒N、P和/或L基因）稳定地或瞬时地转染。
[0067] 根据本发明所述方法，多种不同的细胞可被所述复制缺陷的负链RNA病毒载体感 染W引入所述至少一种异源核酸序列。可被所述复制缺陷的负链RNA病毒载体感染的细胞 的例子包括，但不仅限于，人包皮成纤维细胞、人造血干细胞（CD34+细胞）、树突细胞、T细 胞、B细胞、巨瞻细胞、粘膜组织细胞、肝细胞、肺成纤维细胞和上皮细胞。
[0068] 将被感染的细胞可从任何宿主生物体得到或来自任何宿主生物体。所述细胞可直 接W样本的形式（如活检和血液样本）从相应的宿主生物体内获得。也可为已从宿主生物 体内获得并后续培养、生长、转化或暴露于选定处理的细胞。在一些实施方案中，所述细胞 包括在宿主生物体中。例如，它可存在于宿主生物体的血液或器官中。
[0069] 所述细胞所得到于或来自于的宿主生物体优选哺乳动物且特别优选人类。示例性 的哺乳动物选自，但不仅限于，由大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、野鼠、鸭嘴兽、狗、山羊、 马、猪、象、鸡、縣猴和黑猩猩组成的组。
[0070] 在一个优选的实施方案中，本发明的方法为将至少部分分化的细胞重编程至较低 分化的细胞或将有待编程的细胞编程至所需分化状态的体外方法，所述方法包括：
[0071] (a)提供来自供体的至少部分分化的细胞或有待编程的细胞，
[0072] 化）通过用包含所述至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染所述细 胞W将至少一种异源核酸序列引入至步骤（a)所提供的细胞中，和
[0073] (C)在能有效表达所述至少一种异源核酸序列的条件下培养所述受感染的细胞，
[0074] 其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒 转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，且其中所述异源核酸序列编码细胞重编程 或编程因子。
[0075] 如本文所用的术语"分化的"是指相对于多能干细胞具有受限的潜能（potency)。 术语"潜能"是指细胞的分化潜能，是细胞分化为不同细胞类型的潜能。因此，在本发明的 语境中，分化的细胞表示比多能干细胞更为分化的所有细胞，且包括仍然具有分化为多种， 但不是全部，细胞系的能力的细胞。特别是，分化的细胞包括体细胞。类似地，如本文所用 的术语"分化"是指细胞对一种特定形式或功能的适应。分化导致更加定型的细胞，即被认 为长久致力于特定功能的细胞，例如终末分化细胞。
[007引此外，术语"重编程"或"去分化"，如本文所化指特定细胞的已分化状态转化为较 低分化的状态。术语"重编程"和"去分化"可在本文交换使用且指形式或功能特异化的丧 失。去分化导致较低定型的细胞。因此，它指增加特定细胞的潜能程度且包括将终末分化 细胞转化为寡能（oligopotent)，优选专能（multipotent)，或更优选多能（pluripotent) 细胞。也包括将具有相对于多能细胞受限的潜能的细胞（如寡能或专能细胞）的分化状态 转化为较低分化的状态。在本发明的语境中，重编程或去分化是指将非多能干细胞的细胞 恢复至其原始状态或其分化通路中的任何中间状态。
[0077] 在本发明的语境中，"至少部分分化的细胞"，如本文所用，指构建多细胞生物的身 体的细胞，不包括配子、生殖细胞、配子体或多能干细胞。部分分化的细胞的例子包括，例 女口，体性干细胞（somaticstemcell)、谱系限制性干细胞、前体细胞和祖细胞。（更）分化 的细胞的例子包括体细胞，如终末分化的体细胞。优选地，所述至少部分分化的细胞为选自 成体干细胞、谱系限制性干细胞、前体细胞、祖细胞和终末分化的体细胞的哺乳动物细胞。
[007引术语"干细胞"，如本文所用，指可W无限增殖且具有自我更新和分化成多种特定 细胞类型的能力的多细胞生物的细胞。干细胞包括胚胎干细胞（即来源于囊胚的内层细胞 团的多能干细胞）和成体干细胞（a化Itstemcells)也被称为"体性干细胞"（即发现于担 当身体的修复系统、补充成体组织的多种组织的专能干细胞（multipotentstemcells))。 例子包括，但不仅限于，间充质干细胞、造血干细胞和神经干细胞。还包括所谓的癌症干细 胞。已发现多种类型的癌症包括该癌症干细胞，其W它们的自我更新能力和分化能力为特 征。癌症干细胞与产生它们的祖细胞类似，但表达通常在干细胞中表达的与自我更新相关 的程序。
[0079] 在本发明的含义范围内，"前体细胞"是指已发展到致力于分化为一种或多种最终 形式的阶段的干细胞。例如，前体细胞致力于形成特定类型的新的血细胞、谱系限制性干细 胞或成体干细胞。
[0080] 在本发明的含义范围内，"祖细胞"是具有分化为特定细胞类型如成熟体细胞的能 力且具有有限的自我更新能力的单能或专能细胞。合适的祖细胞的例子包括，但不仅限于， 神经祖细胞、内皮祖细胞、红系祖细胞、也脏祖细胞，少突细胞祖细胞、视网膜祖细胞或造血 祖细胞。
[0081] 在本发明的含义范围内，"体细胞"是任何至少部分分化的细胞且不包括生殖细胞 或配子。本发明中所用的体细胞可为任何组织的细胞，所述组织包括皮肤、肾脏、脾脏、肾上 腺、肝脏、肺、卵巢、膜腺、子宫、胃、结肠、小肠、脾脏、膀脫、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组 织、骨骼、软骨、血管组织、也脏、眼睛或神经组织。合适的体细胞的例子包括，但不仅限于， 纤维母细胞、骨髓细胞、B淋己细胞、T淋己细胞、骨细胞，骨髓细胞、周皮细胞、树突细胞、角 质细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经 细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、也肌细胞、食管细胞、肌细胞（musclecell)(如平滑肌细胞 或骨骼肌细胞）、膜岛目细胞、生黑色素细胞、造血细胞、肌细胞（myocyte)、巨瞻细胞和单 核细胞。
[0082] 在本发明的含义范围内，"终末分化的体细胞"是指在分化路径的最后阶段的细 胞。终末分化细胞是指已经受逐步发展变化成为更专能的形式或功能的成熟细胞。分化的 细胞具有独特的特性，完成特定的功能，且比它们较低分化的对应细胞具有较小的分裂可 能性。
[0083] 根据本发明的方法重编程的至少部分分化的细胞不是特别受限于特定的生物体 且包括，但不仅限于，本文提到的上述生物体。细胞的类型也不特别受限且包括，但不仅限 于，上述细胞。优选地，将被重编程的细胞为终末分化的体细胞。
[0084] 在本发明的含义范围内，由本发明体外重编程方法产生的"较低分化的细胞"是指 相对于至少部分分化的原始细胞具有增强的潜能程度的细胞。优选地，将至少部分分化的 细胞重编程为较低分化的细胞的所述体外方法的特征在于，所述至少部分分化的细胞被重 编程为寡能、专能、多能细胞。
[0085]"多能细胞"指具有分化为H个胚层外胚层、中胚层和内胚层潜能的细胞。"多能" 指潜能程度低于全能（能够形成生物体所有细胞的细胞潜能）。
[0086]"专能细胞（multipotentcell)"指具有分化为多种但有限数量细胞谱系潜能的 细胞。指潜能程度低于多能。专能干细胞是通常仅分化为特定于它们原始组织和器官的细 胞类型的细胞。专能干细胞不仅涉及胎儿、新生儿和成人时期各种组织和器官的生长和发 育，也涉及维持成人组织稳态和组织损伤时诱导再生的功能。
[0087]"寡能细胞"是指具有分化为少数细胞类型潜能的细胞。"寡能"指的是细胞潜能 程度低于专能。
[0088] 优选地，由本发明重编程方法产生的较低分化的细胞为"诱导性多能干细胞 (iP巧"。在本发明的语境中，术语"诱导性多能干细胞"或术语"iPS细胞"是指通过特定 干细胞关联的重编程因子的异源表达而人工来源于至少部分分化的细胞（即，非多能细胞 (non-pluripotentcell),通常为体细胞）的一类多能干细胞。iPS细胞在多个方面，如干 细胞相关的基因表达模式、染色质甲基化模式、倍增时间、拟胚体的形成、崎胎瘤的形成、可 行的嵌合体的形成（vi油Iechimeraformation)、潜能和可分化性（differenti油ility), 相似于天然多能干细胞如胚胎干细胞。
[008引术语"多能干细胞"，如本文所化是指具有分化为S个胚层外胚层、中胚层和内胚 层潜能的干细胞。"多能干细胞"包括天然多能干细胞如胚胎干细胞巧巧和诱导性多能干 细胞（iPS)。胚胎干细胞来源于位于囊胚内的内层细胞团且具有分化为除胎盘细胞或子宫 其他支持细胞外的任何细胞类型的能力，且因此不能形成新的生命体。
[0090] 可通过来自两个或更多个生物体的混合细胞，在将相应干细胞或类干细胞的细 胞与胚胎的囊胚结合后，细胞形成嵌合体的能力评估多能性，细胞形成嵌合体后由所述 细胞混合物形成完全整合的生物体。评估多能性的另一种方法是将相应干细胞注射在 老鼠的可形成崎胎瘤的皮肤下。另一种评估方法是四倍体胚胎互补技术（tetraploid complementattion)，一种通过注射入不能进一步分化的4N胚胎测量对应细胞多能性的体 内测试方法。作为结果的正常的2N胚胎从导入的多能细胞继续发育。
[0091] 也可基于细胞显示的表型微观评估细胞的分化状态。显微拉曼光谱技术或FT-IR 光谱技术为在该方面合适的评估分化状态的技术。可选地，可通过测量细胞分化状态的标 记物（通常为细胞蛋白质）的数量来评估细胞分化状态。可使用多种技术如微阵列杂交或 抗体染色在mRNA和蛋白质水平上检测分化标记物。一般地，选择多个标记物的组合用于评 估细胞的分化状态是有利的。
[0092] 细胞分化状态的标记物蛋白的实例包括，但不仅限于，Nanog、Oct-3/4、Sox2、 Sall4、Tcll、I'bx3、Eras、Klf2、Klf4、Klf5、Baf250a、BC031441、&io3、Etv5、Gml739、Gtfai3、 Hes6、Jub、Mtf2、Myodl、Nmycl、Notch4、化5a2、化肖2、0tx2、Rab2b、I^bpsuh、Rest、Stat3、 化fl、Tcfap2c和Zfp553,或Nanog、0ct4、Sox2、Sall4、Tcll、I'bx3、Eras、Klf2、Klf4、KU5、 Baf250a、BC031441、化〇3、Etv5、Gml739、Gtf化3、Hes6、Jub、Mtf2、Myodl、Nmycl、Notch4、 化5a2、化肖2、0tx2、Rab2b、I^bpsuh、Rest、Stat3、化f1、Tcfap2c和Zfp553 中之一的启动子 的甲基化状态.
[0093] 根据本发明制备的iPS细胞通常表达碱性磯酸酶，一种类ES细胞的标记物。进一 步地，本发明的iPS细胞通常表达内源的Oct-3/4或Nanog,特别是Oct-3/4和化nog二者。 此外，它们优选表达TERT，且具有端粒酶活性。
[0094] 在本发明中，也可使用不同重编程因子的组合W诱导将被重编程细胞的细胞重编 程。可将编码重编程因子的数个基因插入到相同的复制缺陷的RNA病毒载体中。可选地， 编码不同重编程因子的不同核酸序列可各自插入到不同的复制缺陷的病毒载体中。本发明 中所用的复制缺陷的RNA病毒载体可与含编码感兴趣的异源蛋白质的一种或多种异源核 酸序列的一种或多种不同类型的载体组合使用。
[0095] 由本发明所用的复制缺陷的RNA病毒载体表达的重编程因子可与有助于细胞重 编程的化合物组合使用，所述化合物包括bFGF、SCF、MAP激酶抑制剂、DNA甲基化酶抑制剂 (如5-氮杂胞巧）、组蛋白脱己醜酶抑制剂（如辛二醜苯胺氧巧酸（SAHA)、曲古抑菌素A) 和丙戊酸。该些化合物的加入也可限制诱导细胞重编程所必需的重编程因子的数量。此 夕F，用复制缺陷的RNA病毒将重编程因子递送入体细胞可与体细胞的化学处理相结合W诱 导额外的内源重编程因子的内源表达。
[0096] 在本发明的体外编程方法中，将被重编程为所需分化状态的细胞为终末分化的体 细胞包括，但不仅限于，在上文中提到的细胞，如人包皮成纤维细胞、人造血干细胞（CD34+ 细胞）、树突细胞、T细胞、B细胞、巨瞻细胞、粘膜组织细胞、肝细胞、肺成纤维细胞和上皮细 胞。
[0097] 在本发明的语境中，可使用由体外重编程方法得到的细胞（通常为类干细胞）W 得到感兴趣的特定分化的细胞。此类细胞，如由本发明体外编程方法得到的细胞，例如可用 在再生医学中，其具有来自同一个体的细胞可用于提供选定细胞类型的细胞的优势。作为 一个说明性例子，人造血干细胞可用于需要骨髓移植的医学治疗。此类细胞也可用于形成 一种或多种细胞系。
[0098] 根据本发明得到的细胞有望适合用于治疗多种生理病况和疾病，例如神经退行性 疾病如多发性硬化、癌症如卵巢癌和白血病晚期和损害免疫系统的疾病如HIV感染（"艾滋 病")。可被治疗的生理病况的进一步的例子包括，但不仅限于，脊髓损伤、多发性硬化、肌肉 萎缩症、糖尿病、肝脏疾病（即高胆固醇血症）、也脏病、软骨置换、烧伤、足部溃瘍、胃肠疾 病、血管疾病、肾脏疾病、泌尿系统疾病W及与衰老相关的疾病和病况。
[0099] 在另一个优选的实施方案中，在细胞中表达异源核酸序列的方法为治疗遗传病的 体内方法，所述方法包括将包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体施于患者 W将所述至少一种异源核酸序列引入患者细胞，其中所述重组负链RNA病毒包含编码导致 病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，且其中所 述异源核酸序列编码能治疗所述遗传病的治疗性蛋白。
[0100] 在进一步优选的实施方案中，在细胞中表达异源核酸序列的方法为治疗遗传病的 体外方法，所述方法包括：
[0101] (a)提供来自供体的细胞，
[0102] 化）通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染步骤（a)提 供的细胞W将至少一种异源核酸序列引入至所述细胞中，和
[0103] (C)在能有效表达所述至少一种异源核酸序列和/或允许细胞扩增的条件下培养 受感染的细胞，
[0104] 其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒 转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，且其中所述异源核酸序列编码能治疗所述 遗传病的治疗性蛋白质。
[0105] 将通过本发明体内方法和体外方法治疗的遗传病优选选自由重症联合免疫缺 陷、慢性肉芽肿性疾病、血友病A/B、囊胞性纤维症、镶状细胞性贫血、杜氏肌营养不良、莱 施-奈恩综合征、苯丙丽尿症、高雪氏病、马凡综合征、亨廷顿氏舞蹈症、高胆固醇血症、帕 金森氏病、迪乔治综合征、阿尔茨海默氏病和癌症组成的组。
[0106] 可在体内或体外实施基因治疗方法，该取决于被治疗的遗传病和被感染的细胞 类型。对于体内基因治疗方法，所述复制缺陷的负链RNA病毒载体可W气溶胶、溶液、 粉末等形式用通常的方式施用，如口服、局部地（topically)、经鼻地（nasally)、经肺 地（PUlmonally)等。体内基因治疗方法可W影响血细胞的遗传病为目标。在该种情况 下，可肠胃外施用所述复制缺陷的负链RNA病毒载体。如果肺细胞是祀细胞，可经肺地 (pulmonally)施用包含所述复制缺陷的负链RNA病毒载体的药物组合物。
[0107] 另一方面，本发明涉及通过本发明的体外方法（尤其是重编程或编程细胞的体外 方法和体外治疗遗传病的方法）制备的细胞或细胞群。
[010引所述细胞或细胞群可用作用于治疗多种疾病的药剂。如上所述，根据本发明的通 过体外重编程方法得到的重编程细胞可分化为所需的细胞类型然后用在给定疾病的治疗 中。特别地，由体外重编程方法产生的iPS细胞可用在再生治疗中和基础研究中。根据本 发明产生的病人特异的iPS细胞，例如，适合用于干细胞治疗。首先使用本发明的体外重编 程方法将来自患者的体细胞重编程至较低分化状态，根据本领域技术人员已知的程序（例 女口，通过用视黄酸、生长因子、细胞因子和激素处理）分化为所需的体细胞类型，然后施用 给患者。
[0109] 本发明的另一方面涉及包含本发明所述细胞或细胞群，或来源于由本发明体外重 编程方法制备的细胞或细胞群的再分化的细胞或再分化的细胞群的药物组合物。分化再分 化的细胞的方法是本领域已知的且也在上文被指出。
[0110] 本发明所述药物组合物可为溶液、息浮液或其他任何适合预期用途的形式。通常， 所述组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂，和/或赋形剂。也可包括用于调节 抑值的试剂、缓冲液、用于调节张力的试剂等。可通过常用方法施用所述组合物。将治疗 上有效剂量的病毒施于患者，该剂量取决于特定的应用（如再生治疗或基因治疗）、疾病的 类型、患者的体重、年龄、性别和健康状况、施药的方式和配方等。可根据需要单次或多次施 用。
[0111] 本发明药物组合物适用于人类和/或兽医医学应用。可用于再生治疗和基因治 疗。特别地，本发明所述的药物组合物可用于抗肿瘤治疗。
[0112] 通过下面例子将进一步说明本发明。

【具体实施方式】
[0113] 下文显示了本发明方法的使用使得使用重组负链RNA病毒载体W安全可靠的方 式进行有效的长期的转基因表达。与本发明相关的该些意料之外的有利的特征打开了该类 至今不被认为在医疗状况的治疗中有用的病毒载体的新的应用领域。 阳114]连施例1
[011引长期转基因表达
[0116] 用重组仙台病毒（SeV)感染Vero细胞，所述重组仙台病毒具有包含编码缺少N端氨基酸2-77的缩短了的P蛋白的突变P基因的病毒基因组和作为基因表达总标识物 (overallmarker)的绿色英光蛋白佑FP) (SeV-PA2-77/GFP)，感染复数（MOI)为1。在第 I、6、12和30天时在IOOx放大倍率下拍摄英光和光学显微照片（曝光时间为2s)。
[0117] 如图1所示，检测到的GFP水平只在不超过30天的时期适度下将，但在30天后仍 保持相当高。因此，本发明中使用的重组负链RNA病毒载体出人意料地允许转基因的长期 表达。该提供了多种新的应用领域，如间接体内疗法和体内基因治疗方法，将细胞重编程为 适合用在再生治疗中的较低分化状态的细胞，和将细胞编程为用于多种疾病治疗的特定分 化细胞状态的细胞。 阳m]连施例2
[0119] 异源mRNA表达的实时监控
[0120] 用其病毒基因组中包含的转录因子"0ct4"作为转基因的重组复制缺陷的仙台 病毒（SeV-PA2-77/0ct4)或其病毒基因组中包含的转录因子"Nanog"作为转基因的重 组复制缺陷的仙台病毒（SeV-PA2-77/Nanog)感染人包皮成纤维细胞（HFF)，MOI为3或 20。在第2、5、8和12天时，用Triazol(Invitrogen)提取细胞总RNA并实施实时RT-PCR。 用仅使mRNA扩增的oligo-(dT) 12-18引物实施CDNA合成步骤（"superscriptII"酶； Invitrogen)。
[0121] 根据本领域技术人员已知的程序实施所述实时RT-PCR。简单地说，使用qPCRSYBR Green-Mix(ABgene,Surrey,UK)。通过将各样品的循环阔值（Ct)值与相应标准曲线的Ct值 相比较计算cDNA的初始量。对于该计算，使用"Master巧clereprealplex"巧卵endorf) 软件。为标准化，将祀基因的表达水平与目肌动蛋白转录物水平比较。未转导的HFF细胞 作为负对照。
[012引实时PCR条件如下：在95C下预变性10min，40个循环的变性（95°C，15s)，退火 (相应的退火温度参见下表，60s)，引物延伸阶段（72C，60s)。通过凝胶电泳控制正确产品 长度的存在。使用下面的引物对：
[0123]

【权利要求】
1. 一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法，所述方法包括： 通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染细胞，将所述至少一 种异源核酸序列引入至所述细胞中， 其中所述重组负链RNA病毒载体包含编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录 能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和 其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白质。
2. 根据权利要求1所述方法，其中所述重组负链RNA病毒载体为副粘病毒包括仙台 病毒，副流感病毒，鸡新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒和人类呼吸道合胞体病 毒，或弹状病毒载体包括水疱性口炎病毒或狂犬病病毒。
3. 根据权利要求1或2所述方法，其中所述P蛋白的突变为仙台病毒P蛋白的氨基酸 序列2-77的一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换，或如果不是仙台病毒，则为与仙台病 毒P蛋白的氨基酸序列2-77同源的氨基酸序列的缺失、插入或替换。
4. 根据权利要求3所述方法，其中所述突变为 (a) 仙台病毒P蛋白的氨基酸2-77的缺失或，如果病毒不是仙台病毒，则为与仙台病毒 P蛋白的氨基酸2-77同源的氨基酸的缺失，或 (b) 仙台病毒P蛋白的氨基酸33-41的缺失或，如果病毒不是仙台病毒，则为与仙台病 毒P蛋白的氨基酸33-41同源的氨基酸的缺失。
5. 根据权利要求1-4任一项所述方法，其中所述细胞重编程因子选自由Nanog、 Oct-3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、ASCL1、MYT1L、TBX3b、SV40 大T、hTERT、miR-291、 miR-294、miR-295及其组合组成的组，和/或其中所述编程因子选自由神经生长因子 (NGF)、纤维母细胞生长因子（FGF)、白细胞介素-6(IL-6)、骨形成蛋白（BMP)、神经源素 3(Ngn3)、胰腺十二指肠同源框l(Pdxl)、田安（Mafa)及其组合组成的组。
6. 根据权利要求1-5任一项所述方法，其中所述治疗性蛋白选自由腺苷脱氨酶（ADA)、 P91-PH0X、因子IX、因子VIII、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR)、0 -球蛋白（HBB)、抗 肌萎缩蛋白、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT)、苯丙氨酸羟化酶（PAH)、葡糖苷酰 鞘氨醇酶（GBA和GBA2)、原纤蛋白-l(FBNl)、亨廷顿蛋白（HTT)、载脂蛋白B(apoB)、低密 度脂蛋白受体（LDLR)、低密度脂蛋白受体衔接蛋白l(LDLRAPl)、前蛋白转化酶枯草溶菌素 9(PCSK9)、a突触核蛋白（SNCA)、帕金（PRKN)、富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)、PTEN诱导的 推断的激酶l(PINKl)、帕金森蛋白7(DJ-1)、ATP酶型13A2(ATP13A2)、肿瘤自杀基因产物、 抗血管生成因子、自体肿瘤抗原包括酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)和癌胚抗原（CEA)、免疫 刺激因子、生长因子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)和上皮生长因子（EGF)、 细胞因子包括白介素IL-2、IL-4、IL-5、IL-12和IL-17、免疫抑制剂及其组合组成的组。
7. 根据权利要求1-6任一项所述方法，其是将至少部分分化的细胞重编程为较低分化 的细胞或将要被编程的细胞编程至所需分化状态的体外方法，所述方法包括： (a) 提供来自供体的至少部分分化的细胞或要被编程的细胞， (b) 通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染步骤（a)所提供 的细胞，将所述至少一种异源核酸序列引入至所述细胞中，和 (c) 在能有效表达所述至少一种异源核酸序列的条件下培养受感染的细胞， 其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子。
8. 根据权利要求7所述方法，其中所述至少部分分化的细胞为选自由终末分化的体细 胞、前体细胞、谱系限制性干细胞、成体干细胞和祖细胞组成的组的哺乳动物细胞。
9. 根据权利要求7或8所述方法，其中至少部分分化的细胞被重编程为寡能、专能或多 能细胞。
10. 根据权利要求7所述方法，其中要被编程的细胞为终末分化的体细胞。
11. 根据权利要求1-6任一项所述方法，其是治疗遗传病的体内方法，所述方法包括： 将包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体施用于患者以将所述至少一 种异源核酸序列引入至患者细胞中， 其中所述至少一种异源核酸序列编码能治疗所述遗传病的治疗性蛋白质。
12. 根据权利要求1-6任一项所述方法，其是治疗遗传病的体外方法，所述方法包括： (a) 提供来自供体的细胞， (b) 通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染步骤（a)提供的 细胞，以将至少一种异源核酸序列引入至所述细胞中，和 (c) 在能有效表达所述至少一种异源核酸序列和/或允许细胞扩增的条件下培养受感 染的细胞， 其中所述至少一种异源核酸序列编码能治疗所述遗传病的治疗性蛋白质。
13. 通过权利要求1-10和12任一项所述方法体外制备的细胞或细胞群。
14. 用作药剂的权利要求13的细胞或细胞群。
15. 包含根据权利要求13的细胞或细胞群或来源于由权利要求7-9任一项所述体外重 编程方法制备的细胞或细胞群的再分化的细胞或再分化的细胞群的药物组合物。
【文档编号】C12N5/071GK104379752SQ201380029031
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2012年5月30日
【发明者】玛丽安·维甘德 申请人:阿穆瓦克有限公司