使树突细胞成熟的组合物以及用其制备抗原特异性树突细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种使树突细胞成熟的组合物，包括：作为成熟促进因子的白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、前列腺素E2(PGE2)、溶链菌制剂(OK432)和/或聚肌胞。本发明的使树突细胞成熟的组合物可具有不仅改进树突细胞诱导免疫应答的能力，而且可以降低树突细胞的抗原非特异性的免疫应答，并且提高树突细胞的抗原特异性的免疫应答，从而使免疫疗法的效果最大化。
【专利说明】使树突细胞成熟的组合物W及用其制备抗原特异性树突细 胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使树突细胞成熟的组合物，W及一种使用该组合物制备抗原特异 性的树突细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 树突细胞值C)是抗原提呈细胞（APC)，具有在免疫系统的细胞中提呈抗原的最大 潜力。树突细胞刺激还没有暴露至抗原的T细胞（被称为幼稚T细胞），从而诱导免疫反 应。因此，树突细胞是独特的免疫细胞，它与其它的APC不同，能够有效诱导初次免疫应答 并且活化记忆T细胞。已知，树突细胞在它的表面表达高浓度的共刺激分子，W及血IC分子 (1/11)，而且树突细胞释放T细胞活化所需的细胞因子（IFN-a、IL-12、IL-18)。该是为什 么树突细胞能够诱导潜在的免疫应答的原因。通过释放与Thl免疫相关的细胞因子（诸如 IFN-a、IL-12等），I型树突细胞能够诱导抗原特异性的Thl细胞的增殖W及细胞毒性T 淋己细胞（CTL)的活化，因此I型树突细胞在免疫疗法中具有有益的应用。
[0003] 为了在癌症的免疫疗法中利用树突细胞，必需使用体外使单核细胞分化成树突细 胞，并使未成熟的树突细胞成熟为在诱导T细胞免疫时有用的成熟树突细胞的技术。在本 领域中，从体内的单核细胞制备未成熟的树突细胞的技术W及成熟的工序还没有标准化。 具体地，通过如下工序实现从单核细胞分化得到的未成熟树突细胞的成熟；使未成熟树突 细胞能够迁移到淋己结中，未成熟树突细胞在淋己结中将抗原片段提呈给幼稚T细胞，W 诱导Thl免疫应答。与未成熟的树突细胞相比，完全成熟的树突细胞在它的表面上表达MHC I和II分子W及高浓度的T细胞共刺激分子（即CD80和CD86)。此外，成熟的树突细胞分 泌很多细胞因子，该些细胞因子直接参与诱导T细胞免疫应答。在经历了成熟引起的此种 改变之后，树突细胞大大增加了诱导T细胞免疫应答的潜能。
[0004] 已知，MCM(单核细胞条件培养基）可用于树突细胞的成熟。通过体外培养单核细 胞制备的MCM用作成熟因子的来源。但是，MCM途径并不能确保从一个成熟工序至另一成熟 工序都有一致的条件，因为，单核细胞响应于外部信号所释放的促炎细胞因子的数量在不 同人之间有很大不同。此外，另一缺点是需要大量的外周血单核细胞来制备MCM。作为MCM 途径的替代，开发了选自MCM组分中的重要的细胞因子（IL-1目、比-6、TNF-a、PGEs)组成 的细胞因子鸡尾酒。细胞因子鸡尾酒能够稳定生产具有相对较高功能的树突细胞，且解决 了MCM的问题。但是，仅有细胞因子鸡尾酒不能提供充分成熟的树突细胞。
[0005] 韩国专利申请未经审查的公开第10-2011-0035633号公开了，通过使用Thl细胞 核树突细胞在体外生成细胞毒性T细胞。但是，因为该种方法利用的是还没有完全成熟的 树突细胞，因此难W预期由此方法能够得到足够的免疫治疗效果。
[0006] 因此，非常需要更有效的树突细胞的成熟技术，通过该成熟技术能够诱导针对癌 症的潜在的抗原特异性免疫，从而产生对癌症的最好的免疫治疗效果。
【发明内容】
[0007] 因此，本发明的一个目的是提供使树突细胞成熟的组合物，该组合物增强树突细 胞诱导免疫应答的能力，降低树突细胞的抗原非特异性的免疫应答，并且提高树突细胞的 抗原特异性的免疫应答，从而发挥最好的免疫治疗效果。
[0008] 本发明的另一目的是提供抗原特异性的树突细胞，该抗原特异性的树突细胞通过 使用所述使树突细胞成熟的组合物来制备。
[0009] 本发明的又一目的是提供制备抗原特异性的树突细胞的方法。
[0010] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种使树突细胞成熟的组合物，该组合物 包括；作为成熟因子的选自白细胞介素-1目（IL-1目）、白细胞介素-6 (比-6)、肿瘤坏死因 子-a(TNF-a)、干扰素Y(IFN-Y)、前列腺素E2(PGE2)、溶链菌制剂（Picibanil) (0K432) 和聚肌胞（PolyIC)中的至少一种。
[0011] 根据本发明的另一方面，本发明提供了抗原特异性的树突细胞，该抗原特异性的 树突细胞通过使用上述组合物制备。
[0012] 根据本发明的又一方面，本发明提供了制备抗原特异性的树突细胞的方法，该方 法包括：使用抗原使未成熟的树突细胞致敏；W及，使用选自W下成熟因子中的至少一种 成熟因子来处理经过致敏的树突细胞；白细胞介素-1目（IL-1目）、白细胞介素-6 (比-6)、 肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、干扰素Y(IFN-Y)、前列腺素E2 (PGE2)、溶链菌制剂（0K432) 和聚肌胞。
[0013] 除了提高树突细胞诱导免疫应答的能力之外，本发明的成熟组合物的组成还能够 提高抗原特异性的T细胞免疫应答，同时降低非特异性的免疫应答，从而带来最好的免疫 治疗效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是同时使用抗原（Ag)和所有的成熟因子（CM)处理炬），或在时间滞后处仅使 用成熟因子溶链菌制剂（0K432)处理（A)，来制备成熟的树突细胞的示意图。
[00巧]图2是示出了在实施例1-1 (MAGE-1/0K+)和对比例1-1 (MAGE-1/0K-)中，在树突 细胞的成熟过程中释放到树突细胞的培养液中的IL-12和IL-IO的水平的柱形图。在柱形 图中，cvDC和sDC分别表示在实施例1-1和对比例1-1中制备的树突细胞。
[001引图3是示出了当从外周血细胞中分离的T细胞与实施例I-I(MAGE-I)或对比例 1-1的树突细胞共培养时，通过MIT测定测量的T细胞的增殖的柱形图。在该柱形图中，cvDC和sDC分别表示在实施例1-1和对比例1-1中制备的树突细胞。
[0017]图4是示出了当从外周血细胞中分离的T细胞与实施例I-I(MAGE-I)或对比例 1-1的树突细胞共培养时，通过化ISA测量的在培养上清液中的IFN-Y的水平的柱形图。 在该柱形图中，cvDC和sDC分别表示在实施例1-1和对比例1-1中制备的树突细胞。
[001引图5是示出了在H轮测量中释放到培养基中的IFN-Y的水平的曲线图，其中在每 次测量的过程中，W细胞间预先设定的混合比率，使用实施例1-2(AFP/0K+)、对比例2扣n/ OK+)、对比例3-2(AFP/0K-)和对比例4化n/OK-)的树突细胞刺激自身的T细胞。
[001引 图6是显示了通过IFN-YELISPOT分析测量的，由实施例1-3佑PC-3/0K+)和对比 例2化n/OK+)、对比例3-3佑PC-3/0K-)及对比例4化n/OK-)的树突细胞诱导的CTL的抗原 特异性的柱形图。
[0020] 图7是示出了当通过实施例1-2 (AFP/0K+)、对比例2 (Un/OK+)、对比例3-2 (AFP/ 0K-)和对比例4扣n/OK-)的树突细胞活化的CTL与祀细胞反应时，释放到培养基中的 IFN-Y的水平的柱形图。
[0021] 图8是示出了实施例1-2 (AFP/0K+)和对比例3-2 (AFP/0K-)的树突细胞在它们的 成熟过程中释放到培养基中的IL-12和IL-IO的水平的柱形图。
[0022] 图9是示出了当从外周血细胞中纯化的T细胞与实施例1-3佑PC-3/0K+)和对比 例3-3佑PC-3/0K-)的树突细胞共培养时，通过MT测定测量的T细胞增殖的柱形图。
[0023] 图10是示出了当从外周血细胞中纯化的T细胞与实施例1-2 (AFP/0K+)或对比例 3-2(AFP/0K-)的树突细胞共培养时，通过化ISA测量的在培养基中的IFN-Y的水平的柱形 图。
[0024] 图11是示出了在实施例1-3佑PC-3/0K+)和对比例3-3佑PC-3/0K-)的树突细胞 所引起的CTL扩增的每一阶段中的细胞增殖的曲线图。
[00巧]图12是示出了在使用实施例1-3佑PC-3/0K+)和对比例3-3佑PC-3/0K-)的树突 细胞诱导CTL期间，通过化ISA测量的在培养基中IFN-Y的水平的曲线图。
[0026] 图13是示出了通过实施例1-3佑PC-3/0K+)和实施例2-3佑PC-3/0K+)的树突细 胞活化的，通过IFN-Y化ISPOT分析测量的CTL的抗原特异性的柱形图。如图IB中所示， CTL通过经抗原和除了溶链菌制剂之外的成熟因子处理之后0或4小时又经溶链菌制剂 (0K432)处理的树突细胞诱导。
[0027] 图14示出了实施例1-3佑PC-3/0K+)和实施例2-3佑PC-3/0K+)的CTL的抗原特 异性的细胞毒性的曲线图。
[002引图15是示出了通过实施例3-1至3-5的树突细胞诱导的T细胞增殖的柱形图。
[0029] 图16是示出了通过实施例3-1至3-5的树突细胞诱导的Thl免疫应答的柱形图。
[0030] 图17是示出了通过实施例3-1至3-5的树突细胞诱导的，通过IFN-YELISPOT分 析测量的CTL的抗原特异性的柱形图。
【具体实施方式】
[0031] 根据本发明的一个方面，本发明提出了一种使树突细胞成熟的组合物，该组合物 包括含溶链菌制剂（0K432)成熟因子。本发明具体是发明人通过发现W下过程来完成的： 经过成熟因子溶链菌制剂（0K432)和抗原W-定时间间隔进行的处理而成熟的树突细胞 诱导免疫应答的能力明显提高。另外，通过本发明的树突细胞，降低了抗原非特异性的免疫 应答，同时提高了抗原特异性的免疫应答，从而使免疫疗法的效果最大化。
[0032] 在本发明中使用的成熟因子可W是选自白细胞介素-1目（IL-1目）、白细胞介 素-6 (比-6)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a )、干扰素Y (IFN-Y )、前列腺素E2 (PGE2)、溶链菌 制剂（0K432)和聚肌胞中的至少一种，优选是溶链菌制剂（0K432)。
[0033] 溶链菌制剂（0K432)是抗肿瘤的药物，用于增加细胞免疫力，并且是由经青霉素 预处理的冻干的溶血性链球菌制得的。在本领域中，只要是指溶链菌制剂（0K432)的任 何药剂都可W在本发明中使用，没有任何特别的限制。虽然最初开发溶链菌制剂（0K432) 是用于治疗消化系统癌症、甲状腺癌和肺癌，但在本发明中，溶链菌制剂（0K432)用作 树突细胞成熟因子，W大大增强树突细胞诱导免疫应答的能力。而且，选自白细胞介 素-1目（比-1目）、白细胞介素-6 (比-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、干扰素Y(IFN-Y)、 前列腺素E2 (PGE2)和聚肌胞中的任何物质都可用在本发明中，而没有任何限制。
[0034] 在不依赖于诸如RPMI(洛斯维帕克纪念研究所）1640、无血清的X-VIV015等培养 基的情况下，本发明的树突细胞显示出优异的诱导免疫应答的潜力。
[0035] 根据本发明的成熟组合物不仅能增强树突细胞诱导免疫应答的能力，而且还能提 高抗原特异性的免疫应答，同时降低非特异性的免疫应答。
[0036] 根据本发明的另一方面，本发明提出了使用上述成熟组合物制备的树突细胞，该 树突细胞能够诱导抗原特异性的免疫应答。
[0037] 根据本发明的又一方面，本发明提出了制备能够诱导抗原特异性的免疫应答的树 突细胞的方法，该方法包括：使用抗原使未成熟的树突细胞致敏；W及，使用成熟因子处理 经过致敏的树突细胞。
[0038] 使用抗原的致敏和使用成熟因子的处理可W同时进行或顺序进行。例如，细胞可 W同时与抗原和成熟因子一起赔育。可选择的，可W在使用抗原进行致敏之后1至30小时， 再使用成熟因子处理该细胞。该是优选的方法。
[0039] 尤其当利用溶链菌制剂和不同的成熟因子时，更优选W-定时间间隔来使用该溶 链菌制剂和不同的成熟因子。也就是说，可W使用选自白细胞介素-1目（IL-1目）、白细胞介 素-6(比-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、干扰素Y(IFN-Y)、前列腺素E2(PGE2)和聚肌 胞中的至少一种处理细胞，然后细胞再与溶链菌制剂（0K432) -起赔育。优选的，在使用抗 原进行致敏的同时或之后1小时之内，使用除了溶链菌制剂之外的成熟因子的组合进行处 理。对于溶链菌制剂，优选在使用抗原的进行致敏之后1小时，并且更优选的，在经抗原的 致敏和经其它成熟因子的处理之后且在收获树突细胞之前1至4小时，进行溶链菌制剂的 施用。
[0040] 在使用除了溶链菌制剂之外的成熟因子处理之后的预定时间时使用溶链菌制剂 进行处理，该样能够使树突细胞降低非特异性的免疫应答，并且显示出最大的抗原特异性 的免疫应答。
[0041] 成熟因子如上所述。
[0042] 树突细胞是抗原提呈细胞，在免疫系统的细胞中，它们具有提呈抗原的最大潜力。 因此，树突细胞具有通过抗原摄取和抗原加工提呈至MHCI/II分子的能力，其中，抗原的类 型并不特别限制为大的重组蛋白或肤、癌裂解物、核糖核酸、癌细胞的融合物，或调亡或坏 死的癌细胞。因此，树突细胞能够有益于不受具体类型限制的抗原。本发明中可用的抗原 的实例包括；但并不限于，AFP(a-胎甲球蛋白）、GPC-3 (磯脂醜基醇蛋白聚糖-3)、PSA(前 列腺特异性抗原）、MAGE-1 (黑素瘤相关的抗原1)、PSMA(前列腺特异性的膜抗原）、PAP(前 列腺酸性磯酸酶）和癌细胞系的裂解物，或癌组织。
[0043] 通过W下实施例可W更好地理解本发明，W下实施例用于例示本发明，但并不能 理解为限制本发明。
[0044] <实施例和对比例〉
[0045] 如下表1中所示，制备实施例和对比例的成熟的树突细胞。
[0046] 表1
[0047]
【权利要求】
1. 一种使树突细胞成熟的组合物，包括：作为成熟因子的选自白细胞介 素-1MIL-1 0 )、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、干扰素Y(IFN-Y)、 前列腺素E2(PGE2)、溶链菌制剂（0K432)和聚肌胞中的至少一种。
2. 根据权利要求1所述的组合物，包括溶链菌制剂（0K432)。
3. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物增强所述树突细胞诱导免疫应答 的能力。
4. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物降低所述树突细胞的抗原非特异 性的免疫应答。
5. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物提高所述树突细胞的抗原特异性 的免疫应答。
6. -种抗原特异性的树突细胞，所述抗原特异性的树突细胞通过使用权利要求1至5 中任一项所述的组合物制备。
7. -种制备抗原特异性的树突细胞的方法，包括： 使用抗原使未成熟的树突细胞致敏；以及 使用选自白细胞介素-1MIL-1 @ )、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因 子-a(TNF-a)、干扰素Y (IFN-Y)、前列腺素E2(PGE2)、溶链菌制剂（0K432)和聚肌胞中 的至少一种成熟因子处理经致敏的所述树突细胞。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，在致敏步骤之后1至30小时，使用所述成熟因子 处理所述细胞。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述成熟因子包括白细胞介素-IP(IL-1P)、白 细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、干扰素y(IFN-Y)、前列腺素E2 (PGE2)、 溶链菌制剂（OK432)和聚肌胞。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理的步骤包括使用选自白细胞介 素-1MIL-1 0 )、白细胞介素-6(IL_6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、干扰素y(IFN-Y)、 前列腺素E2(PGE2)和聚肌胞中至少一种处理所述细胞，然后使用溶链菌制剂（OK432)处理 所述细胞。
11. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述抗原是选自癌细胞系或癌组织的裂解 物、AFP(a-胎甲球蛋白）、GPC-3 (磷脂酰基醇蛋白聚糖-3)、PSA(前列腺特异性抗原）、 MAGE-1 (黑素瘤相关的抗原1)、PSMA(前列腺特异性的膜抗原）、PAP(前列腺酸性磷酸酶）， 及它们的重组蛋白中的至少一种。
【文档编号】C12N5/02GK104379730SQ201380029061
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】李润, 康惠媛, 韩承洙, 金永穆, 裵容洙, 安瑞姬 申请人:Jw可瑞基因株式会社