一种重组大肠杆菌Pfu DNA聚合酶的微波辅助提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组大肠杆菌Pfu?DNA聚合酶的微波辅助提取方法，包括向重组表达Pfu?DNA聚合酶的大肠杆菌菌体细胞团中加入缓冲液和助提剂，使菌体细胞分散均匀；将所得混合液置于功率为200～1000W的微波场中进行提取，提取期间使混合液温度保持在70～95℃的温度范围。本发明所述方法可在同一装置内、一步完成细胞破壁及热变性的过程，与传统方法比较，减少了操作时间及提取步骤，减少了操作设备投资，而且微波辐射加热能效较高，节能环保，反应过程可控，易于放大。
【专利说明】—种重组大肠杆菌Pfu DNA聚合酶的微波辅助提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从重组工程菌中提取重组耐热聚合酶的方法，具体地，涉及了一种从重组大肠杆菌微波辅助提取重组耐热Pfu DNA聚合酶的方法。
【背景技术】
[0002]DNA聚合酶(DNA polymerase)，是细胞DNA复制的重要酶，主要应用在聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)中。DNA聚合酶主要分为六个类型:A、B、C、D、X、Y,通常所用的属于B型聚合酶。Pfu DNA聚合酶是从Pyrococcus furiosis中提取的耐高温DNA聚合酶，是保真性最好的聚合酶之一。[0003]最初使用的Pfu DNA聚合酶直接从菌体中分离纯化，但难以得到大量的酶，后来的研究者将其基因重组到其它宿主细胞中得以表达，再经提取纯化即可满足应用要求。根据现有文献所述，Pfu DNA聚合酶的提取一般需要两个步骤，第一个步骤为破壁，将得到的重组菌体用超声、溶菌酶等方法或者两种方法结合来破碎细胞壁，此步骤需要冰浴低温，防止酶变性失活。第二个步骤为热变性，将破碎后的细胞或将破碎后的细胞离心取上清液置于75-800C的水浴中20-30min，利用聚合酶的耐热性，去除其余大部分不耐热杂质蛋白，减小后续纯化分离的杂质干扰,这也是其它重组耐热DNA聚合酶的常用的提取方法。Dabrowski等人(Dabrowski et al., Cloning and Expression in Escherichia coli of theRecombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcuswoesei, Protein expression and purification, 1998，14 (I): 131 - 138)提取重组 PfuDNA聚合酶时，将所得菌体超声破碎，离心后上清液于75°C水浴30min，再次离心获取上清液即为粗提液。吴海洪等(吴海洪等乳糖诱导Pfu DNA聚合酶基因的表达及酶的纯化，科技通报，2008, 24(1):23-28)在菌体加入缓冲液、PMSF和溶菌酶，之后超声波破碎。离心后上清液75°C水浴20min再次离心可得粗酶液。Kim等人(Kim et al., Crystal structureof Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus, InternationalJournal of Biological Macromolecules, 2008，42 (4): 356-361.)在菌体中加入 Tris-HCl缓冲液，置于冰上超声，超声后立即75°C加热30min，在4°C离心即得粗酶液。从现有提取技术可看出，重组细胞破碎后需要再次转移到新的仪器中进行热变性，提取步骤较为繁琐，而且超声破碎处理量较小，规模化放大不易实现。
[0004]微波提取技术是近些年发展起来的一门新的提取技术，具有能耗低、操作时间短、溶剂耗量少、选择性高、目标组分得率高等优点。微波提取是利用微波场将电能转化为热能，导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热能，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化后产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞。进一步加热，导致细胞内部和细胞壁的水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞或裂纹的存在使得胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内物质。利用微波这种较优越的破壁性能，主要从动植物细胞中提取多糖、脂类、酮类、色素、蛋白或一些其它特殊成份。近来也有研究利用微波从微生物细胞中提取一些成份，Yang等人(Yang et al., Microwave-assisted aciddigestion protocol for the determination of methionine and selenomethionine inselenium-enriched yeast by species specific isotope dilution GC-MS, AnalyticalMethods, 2013，5(2):525-529.)用 4M 甲基磺酸在 200W、165°C、20min 的微波提取条件下从富硒酵母较好的提取了蛋氨酸和硒代蛋氨酸。Jin等人(Jin et al., Enzyme-assistedextraction of lipids directly from the culture of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides, Bioresource Technology, 2012, 111:378-382.) 用圆红冬孢酵母提取脂质时，使用微波预处理，条件为800W、60s、100°C，提取效果好。明红梅等(明红梅，方春玉等.MAE法在胞内红曲色素提取中的应用.食品研究与开发，2010, 31 (8): 171-173.)用微波辅助提取技术从红曲霉菌体内提取红曲色素，优化了提取条件，表明70s、70°C、乙醇溶剂浓度45%、液固比20:1和600W的条件下能有较好的提取效果。但是由于微波辐射时产生热量，使得大部分蛋白质变性失活，失去生理活性，所以很少用微波辐射来提取酶。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提出一种重组大肠杆菌Pfu DNA聚合酶的微波辅助提取方法。该方法可在同一装置内、一步完成细胞破壁及热变性的过程，与传统方法比较，减少了操作时间及提取步骤，减少了操作设备投资，而且微波辐射加热能效较高，节能环保，反应过程可控，易于放大。 [0006]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种重组大肠杆菌Pfu DNA聚合酶的微波辅助提取方法，包括:
[0008](I)向重组表达Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌菌体细胞团中加入缓冲液和助提剂，使菌体细胞分散均匀；
[0009](2)将步骤(1)所得混合液置于功率为200~1000W的微波场中进行提取，提取期间使混合液温度保持在70~95 °C的温度范围。
[0010]上述微波辅助提取方法中，重组Pfu DNA聚合酶的构建及表达培养过程参见文献(Dabrowski et al., Cloning and Expression in Escherichia coli of theRecombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcuswoesei, Protein expression and purification, 1998, 14(1): 131 - 138.)，本领域技术人员能够重组表达Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌均可用于本发明。培养结束后离心收集得到的湿菌体，即为本发明的提取对象，菌体含水量在75%~80%。
[0011]作为优选，步骤(1)中，按大肠杆菌菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1: (10~40)、优选为1: (15~30)、进一步优选为1:(18~25)加入所述缓冲液。
[0012]在【具体实施方式】中，大肠杆菌菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比可以为I:12,1:15,1:18,1:20,1:23、1:25、1:27、1:30、1:32、1:35、1:38、1:40。
[0013]在本发明中，术语“湿菌体”是指离心除去培养基后的菌体。
[0014]在【具体实施方式】中，所述菌体干重的确定方法为:
[0015](i)称取离心除去培养基后的菌体(即湿菌体)质量；
[0016](ii)将湿菌体置于80°C的烘箱干燥24h以上至恒重，称取干燥后的菌体质量；
[0017](iii)将干燥前、后菌体质量的变化除以步骤(i)所称湿菌体质量，即为湿菌体中水的百分含量，简称湿菌体的含水量；按此方法确定的湿菌体的含水量通常为75~80% ；
[0018]( iv)根据湿菌体的含水量，计算菌体的干重，即菌体干重=湿菌体X ( 100%-湿菌体的含水量)。
[0019]作为优选，步骤(1)所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。缓冲液的配比按本领域研究人员常用配比即可。
[0020]优选地，所述缓冲液的pH值为6.0~9.0，进一步优选为6.5~8.5，更进一步优选为7.0~8.0。
[0021]在【具体实施方式】中，所述缓冲液的pH值例如为6.2,6.4,6.5,6.6,6.8,7.0,7.1、
7.3、7.5、7.6、7.8、8.0、8.2、8.5、8.6、8.8。
[0022]优选地，所述缓冲液中的离子浓度为0.01~0.08mol ? L—1，优选为0.02~0.06mol ? L \ 进一步优选为 0.03 ~0.04mol ? L、[0023]在【具体实施方式】中，所述缓冲液中的离子浓度例如为0.02mol ? U\0.03mol ? L'0.04mol ? L \0.05mol ? L \0.06mol ? L \0.07mol ? L 1O
[0024]作为优选，步骤(1)所述助提剂为表面活性剂，例如为Triton X-100, Tween20、Tween80、SDS, Span、LAS、PEG、CPB或BAB ;进一步优选地，所述助提剂为非离子型表面活性剂，例如为 Triton X-100、Tween20 或 Tween80。
[0025]优选地，按g/mL计的质量体积百分比，所述助提剂的添加终浓度为0.2~1.5%，进一步优选为0.4~1.2%，更进一步优选为0.6~1.0%。
[0026]在【具体实施方式】中，按g/mL计的质量体积百分比，所述助提剂的添加终浓度例如为 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%。
[0027]作为优选，步骤(2)所述微波场的频率为2450MHz。
[0028]作为优选，，步骤(2)所述微波场的功率优选为300~800W，进一步优选为400~600W。
[0029]在【具体实施方式】中，步骤(2)所述微波场的功率例如为300W、400W、500W、600W、700W、800W、900W。
[0030]步骤(2)所述提取期间，通过开、关微波辐射使混合液温度保持在70~95°C、优选为75~90°C、进一步优选为80~85°C的温度范围。温度的选取以使其它杂质蛋白失活而不影响目标蛋白Pfu DNA聚合酶的活性为准。
[0031]在【具体实施方式】中，步骤(2)所述提取温度例如为73°C、75°C、78°C、80°C、82°C、85°C、88°C、90°C、92°C、94°C。
[0032]作为优选，步骤(2)所述提取时间为5~30min，进一步优选为10~25min，更进一步优选为15~20min。
[0033]在【具体实施方式】中，步骤(2)所述提取时间例如为7min、9min、10min、12min、13min、15min、16min、18min、20min、22min、24min、25min、27min、28mino
[0034]作为优选，步骤(2)所述提取期间，保持搅拌所述混合液。
[0035]所述搅拌可以为本领域技术人员已知的任何搅拌方式，优选为磁力搅拌。
[0036]优选地,所述搅拌转速为100~800rpm,进一步优选为200~600rpm,更进一步优选为300~400rpm ;在【具体实施方式】中，所述搅拌转速例如为200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm。[0037]优选地，上述微波辅助提取方法还包括将步骤(2)所得提取液进行离心、取上清的步骤；进一步优选地，所述离心为在O~4°C、优选4°C，以8000~15000rpm、优选10000~12000rpm离心10~30分钟；
[0038]在【具体实施方式】中，上述微波辅助提取方法具体包括如下步骤:
[0039](1)按大肠杆菌菌体干重与缓冲液的g/mL计的质量体积比为1: (10~40)、优选为1: (15~30)、进一步优选为1:(18~25)，向重组表达Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌菌体细胞团中加入缓冲液；再加入助提剂使其以g/ml计的质量体积百分浓度为0.2~1.5%、、优选为0.4~1.2%、进一步优选为0.6~1.0%，振荡使菌体细胞分散均匀；
[0040]所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液；所述缓冲液的pH值为6.0~9.0，优选为6.5~8.5，进一步优选为7.0~8.0 ;所述缓冲液中的离子浓度为0.01~0.08mol ?Ι/1，优选为0.02~0.06mol .l-1，进一步优选为0.03~0.04mol.L 1 ；
[0041]所述助提剂为表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选为TritonX-100、Tween20 或 Tween80 ；
[0042](2)在转速为100~800rpm、优选200~600rpm、进一步优选300~400rpm的搅拌下，将步骤(1)所得混合液置于频率为2450MHz，功率为200~1000W、优选为300~800W、进一步优选为400~600W的微波场中进行提取，提取期间通过开、关微波辐射使混合液温度保持在70~95°C的温度范围、优选在80~85°C的温度范围内，提取时间为5~30min、优选为10~25min、进一步优选为15~20min ；
[0043](3)将步骤(2)所得提取液冰浴冷却后，在O~4°C、优选4°C，以8000~15000rpm、优选10000~12000rpm离心10~30分钟，即得含有Pfu DNA聚合酶的上清液。
[0044]与现有技术相比，本发明具有以下特点:
[0045](I)本发明可采用同一装置完成破壁和热变性，能够减少操作步骤和时间，减少设备投入，降低成本，提高生产效率。
[0046](2)本发明采用微波辅助提取技术，微波破壁效果好，而且微波辐射加热比普通加热方式更高效节能。
[0047]( 3 )本发明中的微波提取装置易放大，易实现自动化控制，有利于规模化应用。【具体实施方式】
[0048]下面结合【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0049]实施例1
[0050]将重组Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌进行诱导、培养，获得重组表达Pfu DNA聚合酶的菌体细胞，然后采用如下步骤:
[0051](1)根据已确定的湿菌体的含水量(75%)计算干重，按菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1:10加入0.03mol.l-1磷酸盐缓冲液(pH5.0)，然后，按g/mL计的质量体积百分比为0.2%的添加比例加入20 μ g Tween20振荡均匀，直到底部没有菌块。
[0052](2)在混合液中加入磁性转子，放入微波反应器中开始搅拌，转速为500rpm。
[0053](3)选择微波功率700W，开始微波辐射，提取温度设定在80~95°C，当温度达到80°C时,开始计时，继续福射，当温度达到95°C时停止福射，当温度降到80°C时,继续福射，直到温度再次升到设定范围上限时停止微波辐射，此过程维持5min。
[0054](4)反应结束后，停止搅拌，将混合液置于冰浴冷却，4°C、1000Orpm离心15min取上清液即为粗酶液。
[0055]实施例2
[0056]将重组Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌进行诱导、培养，获得重组表达Pfu DNA聚合酶的菌体细胞，然后采用如下步骤:
[0057](1)根据已确定的湿菌体的含水量(80%)计算干重，按菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为I:40加入0.05mol ? L-1 Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，然后，按g/mL计的质量体积百分比为1.2%的添加比例加入480 u L SDS振荡均匀，直到底部没有菌块。
[0058](2)在混合液中加入磁性转子,放入微波反应器中开始搅拌,转速为lOOrpm。
[0059](3)选择微波功率200W，开始微波辐射，提取温度设定在70~90°C，当温度达到70°C时，开始计时，继续辐射，当温度达到90°C时停止辐射，当温度降到70°C时，继续辐射，直到温度再次升到设定范围上限时停止微波辐射，此过程维持30min。
[0060](4)反应结束后，停止搅拌，将混合液置于冰浴冷却，4°C、1000Orpm离心15min取上清液即为粗酶液。
[0061]实施例3
[0062]将重组Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌进行诱导、培养，获得重组表达Pfu DNA聚合酶的菌体细胞，然后采用如下步骤:
[0063](1)根据已确定的湿菌体的含水量(78%)计算干重，按菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为I:20加入0.02mol ? L-1Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，然后，按g/mL计的质量体积百分比为1.0%的添加比例加入200 ii L Triton X-100振荡均匀，直到底部没有菌块。
[0064](2)在混合液中加入磁性转子,放入微波反应器中开始搅拌,转速为300rpm。
[0065](3)选择微波功率500W，开始微波辐射，提取温度设定在75~90°C，当温度达到75°C时，开始计时，继续辐射，当温度达到90°C时停止辐射，当温度降到75°C时，继续辐射，直到温度再次升到设定范围上限时停止微波辐射，此过程维持25min。
[0066](4)反应结束后，停止搅拌，将混合液置于冰浴冷却，4°C、12000rpm离心15min取上清液即为粗酶液。
[0067]实施例4
[0068]将重组Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌进行诱导、培养，获得重组表达Pfu DNA聚合酶的菌体细胞，然后采用如下步骤:
[0069](1)根据已确定的湿菌体的含水量(75%)计算干重，按菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1:30加入0.01mol ? L-1柠檬酸盐缓冲液(pH7.0)，然后，按g/mL计的质量体积百分比为0.8%的添加比例加入240 u L BAB振荡均匀，直到底部没有菌块。
[0070](2)在混合液中加入磁性转子,放入微波反应器中开始搅拌,转速为400rpm。
[0071](3)选择微波功率600W，开始微波辐射，提取温度设定在80~95°C，当温度达到80°C时,开始计时，继续福射，当温度达到95°C时停止福射，当温度降到80°C时,继续福射，直到温度再次升到设定范围上限时停止微波辐射，此过程维持15min。
[0072](4)反应结束后，停止搅拌，将混合液置于冰浴冷却，4°C、15000rpm离心12min取上清液即为粗酶液。
[0073]实施例5
[0074]将重组Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌进行诱导、培养，获得重组表达Pfu DNA聚合酶的菌体细胞，然后采用如下步骤:
[0075](I)根据已确定的湿菌体的含水量(76%)计算干重，按菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1:25加入0.08mol ? L—1醋酸盐缓冲液(pH6.0)，然后，按g/mL计的质量体积百分比为1.5%的添加比例加入375 u L Tween80振荡均匀，直到底部没有菌块。
[0076](2)在混合液中加入磁性转子,放入微波反应器中开始搅拌,转速为800rpm。
[0077](3)选择微波功率1000W，开始微波辐射，提取温度设定在90~95°C，当温度达到90°C时，开始计时，继续福射，当温度达到95°C时停止福射，当温度降到90°C时,继续福射，直到温度再次升到设定范围上限时停止微波辐射，此过程维持5min。
[0078](4)反应结束后，停止搅拌，将混合液置于冰浴冷却，4°C、8000rpm离心30min取上清液即为粗酶液。
[0079]取上清液即为粗酶液。
[0080]实施例6
[0081]将重组Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌进行诱导、培养，获得重组表达Pfu DNA聚合酶的菌体细胞，然后采用如下步骤:`[0082](I)根据已确定的湿菌体的含水量(77%)计算干重，按菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1:35加入0.04mol ? L—1磷酸盐缓冲液(pH7.3)，然后，按g/mL计的质量体积百分比为0.4%的添加比例加入140 u L Span振荡均匀，直到底部没有菌块。
[0083](2)在混合液中加入磁性转子，放入微波反应器中开始搅拌，转速为200rpm。
[0084](3)选择微波功率300W，开始微波辐射，提取温度设定在75~85°C，当温度达到75°C时，开始计时，继续辐射，当温度达到85°C时停止辐射，当温度降到75°C时，继续辐射，直到温度再次升到设定范围上限时停止微波辐射，此过程维持24min。
[0085](4)反应结束后，停止搅拌，将混合液置于冰浴冷却，4°C、15000rpm离心IOmin取上清液即为粗酶液。
[0086]取上清液即为粗酶液。
[0087]实施例7
[0088]将重组Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌进行诱导、培养，获得重组表达Pfu DNA聚合酶的菌体细胞，然后采用如下步骤:
[0089](I)根据已确定的湿菌体的含水量(79%)计算干重，按菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1:18加入0.07mol ? L-1柠檬酸盐缓冲液(pH8.2)，然后，按g/mL计的质量体积百分比为0.5%的添加比例加入90 ii L PEG振荡均匀，直到底部没有菌块。
[0090](2)在混合液中加入磁性转子,放入微波反应器中开始搅拌,转速为700rpm。
[0091](3)选择微波功率400W，开始微波辐射，提取温度设定在78~88°C，当温度达到78°C时，开始计时，继续辐射，当温度达到88°C时停止辐射，当温度降到78°C时，继续辐射，直到温度再次升到设定范围上限时停止微波辐射，此过程维持18min。
[0092](4)反应结束后，停止搅拌，将混合液置于冰浴冷却，4°C、12000rpm离心20min取上清液即为粗酶液。[0093]取上清液即为粗酶液。
[0094]实施例8
[0095]将重组Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌进行诱导、培养，获得重组表达Pfu DNA聚合酶的菌体细胞，然后采用如下步骤:
[0096](I)根据已确定的湿菌体的含水量(76%)计算干重，按菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1:32加入0.06mol.L-1醋酸盐缓冲液(pH7.6)，然后，按g/mL计的质量体积百分比为0.9%的添加比例加入288 μ L CPB振荡均匀，直到底部没有菌块。
[0097](2)在混合液中加入磁性转子,放入微波反应器中开始搅拌,转速为600rpm。
[0098](3)选择微波功率800W，开始微波辐射，提取温度设定在82~92°C，当温度达到82°C时，开始计时，继续辐射，当温度达到92°C时停止辐射，当温度降到82°C时，继续辐射，直到温度再次升到设定范围上限时停止微波辐射，此过程维持13min。
[0099](4)反应结束后，停止搅拌，将混合液置于冰浴冷却，4°C、1000Orpm离心20min取上清液即为粗酶液。
[0100] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例的技术条件才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种重组大肠杆菌PfU DNA聚合酶的微波辅助提取方法，其特征在于，包括: (1)向重组表达PfuDNA聚合酶的大肠杆菌菌体细胞团中加入缓冲液和助提剂，使菌体细胞分散均匀； (2)将步骤(1)所得混合液置于功率为200~1000W的微波场中进行提取，提取期间使混合液温度保持在70~95 °C的温度范围。
2.根据权利要求1所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤(1)中，按大肠杆菌菌体干重与缓冲液的g/mL计的重量体积比为1:(10~40)、优选为1: (15~30)、进一步优选为1: (18~25)加入所述缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤(1)所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液； 优选地，所述缓冲液的pH值为6.0~9.0，进一步优选为6.5~8.5，更进一步优选为7.0 ~8.0 ; 优选地，所述缓冲液中的离子浓度为0.01~0.08mol ? L'进一步优选为0.02~0.06mol ? L'更进一步优选为 0.03 ~0.04mol ? L4。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤(1)所述助提剂为表面活性剂，优选为 Triton X-100、Tween20、Tween80、SDS, Span、LAS、PEG、CPB 或BAB ； 优选地，所述助提剂为非离子型表面活性剂，进一步优选为Triton X-100、Tween20或Tween80 ； 优选地，按g/mL计的质量体积百分比，所述助提剂的添加终浓度为0.2~1.5%，进一步优选为0.4~1.2%，更进一步优选为0.6~1.0%。
5.根据权利要求1-4任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤(2)所述微波场的频率为2450MHz ； 优选地，所述微波场的功率为300~800W，进一步优选为400~600W。
6.根据权利要求1-5任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤(2)所述提取期间，通过开、关微波辐射使混合液温度保持在70~95°C、优选为75~90°C、进一步优选为80~85 °C的温度范围。
7.根据权利要求1-6任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤(2)所述提取时间为5~30min，优选为10~25min，进一步优选为15~20min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，步骤(2)所述提取期间，保持搅拌所述混合液； 优选地，所述搅拌为磁力搅拌； 优选地，所述搅拌转速为100~800rpm,进一步优选为200~600rpm,更进一步优选为300 ~400rpm。
9.根据权利要求1-8任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，还包括将步骤(2)所得提取液进行离心、取上清的步骤； 优选地,所述离心为在0~4°C、优选4°C，以8000~15000rpm、优选10000~12000rpm的转速离心10~30分钟。?
10.根据权利要求1-9任一项所述的微波辅助提取方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)按大肠杆菌菌体干重与缓冲液的g/mL计的质量体积比为1:(10~40)、优选为1:(15~30)、进一步优选为1:(18~25)，向重组表达Pfu DNA聚合酶的大肠杆菌菌体细胞团中加入缓冲液；再加入助提剂使其以g/mL计的质量体积百分浓度为0.2~1.5%、优选为.0.4~1.2%、进一步优选为0.6~1.0%，振荡使菌体细胞分散均匀； 所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液；所述缓冲液的PH值为6.0~9.0，优选为6.5~8.5，进一步优选为7.0~8.0 ;所述缓冲液中的离子浓度为0.01~0.08mol ?Ι/1，优选为0.02~0.06mol ?Ι/1，进一步优选为0.03~.0.04mol.L 1 ； 所述助提剂为表面活性剂，优选为非离子型表面活性剂，进一步优选为Triton X-100、Tween20 或 Tween80 ； (2)在转速为100~800rpm、优选200~600rpm、进一步优选300~400rpm的搅拌下，将步骤(1)所得混合液置于频率为2450MHz、功率为200~1000W、优选为300~800W、进一步优选为400~600W的微波场中进行提取，提取期间通过开、关微波辐射使混合液温度保持在70~95°C的温度范围、优选在80~85°C的温度范围内，提取时间为5~30min、优选为10~25min、进一步优选为15~20min ； (3)将步骤(2)所得提取液冰浴冷却后，在O~4°C、优选4°C，以8000~15000rpm、优选10000~12000rpm的转速离心10~30分钟，即得含有Pfu DNA聚合酶的上清液。
【文档编号】C12N9/12GK103740671SQ201410001371
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】刘春朝, 胡建华, 王 锋 申请人:中国科学院过程工程研究所