丹顶鹤α干扰素、其编码基因和在抗病毒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丹顶鹤α干扰素、其编码基因和在抗病毒中的应用。本发明的一种丹顶鹤α干扰素（IFN-α），其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示或SEQ?ID?NO.5所示。本发明一方面公开了丹顶鹤IFN-α的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列，另一方面也验证了克隆得到的丹顶鹤IFN-α在抗病毒，特别是抗水泡性口炎病毒和抗H9N2禽流感病毒中的应用。本发明的提出为丹顶鹤干扰素对其他病毒性疾病的深入研究奠定了基础，同时也为丹顶鹤干扰素产品的问世提供了理论基础。
【专利说明】丹顶鹤α干扰素、其编码基因和在抗病毒中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种干扰素及其应用，特别涉及一种丹顶鹤α干扰素及在抗病毒中的应用，本发明属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]我国是世界上丹顶鹤栖息的主要国家，国家林业局已经把丹顶鹤作为唯一的国鸟候选鸟上报国务院，是国家一级保护动物。近年来，丹顶鹤禽流感、新城疫、疱疹、马立克病等危害丹顶鹤生存的传染病时常发生，造成严重的损失，因此对这些疾病的防疫与治疗是不可忽视的。
[0003]干扰素(interferon，IFN)是在特定诱生剂的作用下由细胞基因组控制产生的一(或多)种蛋白质，具有抗病毒繁殖及免疫调节等生物学功能。干扰素可分为I型、II型和III型。I型干扰素又称病毒干扰素或白细胞干扰素，包括IFN-α、β、ω、Κ、τ、δ、和ζ等，主要功能是抑制病毒增殖。II型干扰素又称免疫干扰素，只有IFN-Y —个成员，主要起免疫调节的作用。III型干扰素包括IFN-λ (IL-28/29)。
[0004]迄今为止，哺乳动物的IFN-α的研究(尤其是人和鼠的研究)已取得很多成果，但是禽类的IFN-α的研究起步较晚，只在鸡、鸭、鹅、鹦鹉、鹧鸪等物种中有些进展。尚未出现丹顶鹤IFN-a基因的核苷酸序列与它相对应的氨基酸序列的报道。由于还没有丹顶鹤干扰素的产品问世，大多是使用鸡干扰素来代替丹顶鹤干扰素。然而鸡和丹顶鹤之间存在种属差异，其干扰素对丹顶鹤的病毒性疾病的治疗效果并不是很好，因而研究丹顶鹤干扰素是有必要的。
【发明内容】
`[0005]本发明所要解决的技术问题之一是提供丹顶鹤a干扰素(IFN-a )基因的核苷酸和相应的氨基酸序列；
[0006]本发明所要解决的技术问题之二是通过将丹顶鹤α干扰素(IFN-a )基因在原核细胞中进行重组表达，从而验证该蛋白对病毒生长的抑制作用。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为:
[0008]克隆丹顶鹤IFN-a全序列的实施方案:
[0009]( I)丹顶鹤基因组DNA的提取；
[0010](2)利用两对简并引物 AIF-TYla 和 AIF_TY2b，POAU 和 AIF_TY2b 进行PCR扩增，将PCR产物连接到合适的克隆载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，测序获得丹顶鹤IFN- α基因的部分序列，其中引物AIF-TYla的核苷酸序列为:5’ -CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3，，引物POAU的核苷酸序列为:5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，其共同的下游简并引物AIF_TY2b的核苷酸序列为:5’_AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中 R=A/G，Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, B=C/G/T, N=A/C/G/T ；[0011](3)利用染色体步移技术，获取侧翼的未知序列；
[0012](4)通过对扩增序列的拼接获得丹顶鹤IFN-α的全序列。
[0013]丹顶鹤IFN-α基因功能验证的实施方案:
[0014](I)PCR扩增丹顶鹤IFN- α的成熟肽基因；
[0015](2)构建重组的原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导表达干扰素蛋白；
[0016](3)若为包涵体表达，将包涵体蛋白纯化，复性；
[0017](4)在细胞上测定复性后的IFN-α对病毒复制的抑制情况来验证该蛋白的功能。
[0018]在上述研究的基础上，本发明提出了一种丹顶鹤α干扰素(IFN-a )，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示(前肽，含有信号肽)或SEQ ID N0.5所示(成熟肽)。
[0019]进一步的，本发明还提出了编码所述的丹顶鹤α干扰素的核苷酸序列。
[0020]优选的，所述的核苷酸序列为丹顶鹤α干扰素的全基因序列或其编码区序列，其中，所述的丹顶鹤α干扰素的全基因序列如SEQ ID N0.1所示，所述的编码区序列如SEQID N0.2 或 SEQ ID N0.6 所示。
[0021]含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述的表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
[0022]更进一步的，本发明还提出了所述的丹顶鹤α干扰素在制备抗病毒药物中的应用。其中，优选的，所述的病毒为水泡性口炎病毒或禽流感H9N2病毒。
`[0023]再进一步的，本发明提出了一种抗水泡性口炎病毒的药物组合物，其特征在于有效成分为本发明的丹顶鹤α干扰素(IFN-a )。及
[0024]一种抗H9N2禽流感病毒的药物组合物，其特征在于有效成分为权利要求1所述的丹顶鹤Ct干扰素。
[0025]综上，本发明一方面公开了丹顶鹤IFN-α的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列，同时验证了该丹顶鹤IFN-α的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)和抗H9N2禽流感病毒的功能，为丹顶鹤干扰素对其他病毒性疾病的深入研究奠定了基础，为丹顶鹤干扰素产品的问世提供了可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为使用简并引物AIF-TYla和AIF_TY2b PCR扩增IFN-α部分基因的电泳结果图；
[0027]I道:目的带；2道:阴性对照；
[0028]图2为使用简并引物POAU和AIF_TY2b PCR扩增IFN-α部分基因的电泳结果图；
[0029]I道:阴性对照；2道:目的带；
[0030]图3为IFN- α 5’和3’侧翼序列的扩增电泳结果图；
[0031]I道:3’端第一次扩增产物；2道:3’端第二次扩增产物；3道:3’端第三次扩增产物；4道:5’端第三次扩增产物；5道:5’端第二次扩增产物；6道:5’端第一次扩增产物；
[0032]图4为IFN- α成熟肽序列的扩增电泳结果图；
[0033]I道:目的带；2道:阴性对照；
[0034]图5为蛋白的SDS-PAGE结果；
[0035]I道:PET32a空载诱导后；2道:重组菌诱导前；3道:重组菌全菌体；4道:超声后沉淀；5道:超声后上清；
[0036]图6为重组IFN- α对VSV病毒的抑制试验的显微镜观察图；
[0037]A:病毒对照组；Β:实验组；C:阴性对照-细胞对照组；
[0038]图7为不同浓度的IFN- α对VSV的抑制情况的统计图；
[0039]横轴:IFN的不同浓度纵轴:IFN对VSV的抑制率；
[0040]图8为重组IFN- α对Η9Ν2病毒的抑制试验的显微镜观察图；
[0041]A:病毒对照组；Β:实验组；C:阴性对照-细胞对照组；
[0042]图9为不同浓度的IFN- α对Η9Ν2的抑制情况的统计图。
[0043]横轴:IFN的不同浓度纵轴:IFN对H9N2的抑制率。
【具体实施方式】
[0044]下面结合附图和具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0045]实施例1丹顶鹤IFN-α基因的部分序列的扩增
[0046]1、按照禽类血液基因组DNA的简单快速提取方法，从丹顶鹤的血液中提取基因组DNA ；`
[0047]2、以丹顶鹤基因组DNA为模板，简并引物AIF-TYla和AIF_TY2b为引物，PCR扩增IFN- α 基因，其中引物 AIF-TYla 的核苷酸序列为:5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’，弓丨物 AIF-TY2b 的核苷酸序列为:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中 R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T, S=C/G, B=C/G/T ;反应体系和反应条件如下所示:
[0048]PCR反应体系:
[0049]
基因组DNALOpL
IOx PCR Buffer5.0pL
dNTP ( 2.5mM )4%L
AIF- TYla ( ΙΟμΜ)4.0pL
AIF- TY2b ( ΙΟμΜ)2.5μι
rTaq ( 5U/^iL )0.5μι,
ddH20补足至50pL
[0050]反应条件:94°C预变性8min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C终延伸10min，4°C终止反应。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳的结果如图1所示。[0051 ] 回收目的片段，将胶回收产物连入PMD19-T载体，16°C连接5h后，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，37°C培养12h。
[0052]挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定(AIF-TYla和AIF_TY2b为引物)阳性后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序获得部分(167bp)丹顶鹤IFN-α基因。[0053]实施例2丹顶鹤IFN- α基因的部分序列的扩增
[0054]1、以丹顶鹤基因组DNA为模板，简并引物POAU和AIF_TY2b为引物，PCR扩增IFN- α基因，其中引物POAU的核苷酸序列为:5’ -CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，引物AIF-TY2b 的核苷酸序列为:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中 R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T, S=C/G, B=C/G/T, N=A/C/G/T ；
[0055]反应体系和反应条件如下所示:
[0056]PCR反应体系:
【权利要求】
1.丹顶鹤a干扰素(IFN-a)，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示或SEQID N0.5 所示。
2.编码权利要求1所述的丹顶鹤a干扰素的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列为丹顶鹤a干扰素的全基因序列或其编码区序列，其中，所述的丹顶鹤a干扰素的全基因序列如SEQ ID N0.1所示，所述的编码区序列如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.6所示。
4.一种表达载体,其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求1所述的丹顶鹤a干扰素在制备抗病毒药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的病毒为水泡性口炎病毒或H9N2禽流感病毒。
8.一种抗水泡性口炎病毒的药物组合物，其特征在于有效成分为权利要求1所述的丹顶鹤a干扰素。
9.一种抗H9N2禽流感病毒的药物组合物，其特征在于有效成分为权利要求1所述的丹顶鹤a干 扰素。
【文档编号】C12N15/21GK103804485SQ201410001296
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】邢明伟 申请人:东北林业大学