一种富含纳豆激酶和Monaclin K的豆豉的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种富含纳豆激酶和Monaclin?K的豆豉的制备方法，具体如下：1）制备发芽黄豆，灭菌后得到发芽黄豆固体培养基；2）制备功能红曲种子；3）将红曲种子，无菌水，0.2%的无菌冰醋酸溶液混合后制成曲种浆接种于发芽黄豆固体培养基，发酵后加入葡萄糖；4）将纳豆芽孢杆菌接种于步骤3）中获得的基质发酵；5）通风干燥。本发明采用发芽黄豆为原料，发芽黄豆富积大量的γ-氨基丁酸，有利于缓解心脑血管疾病；利用红曲分泌红曲霉红素以及酯化酶，增强了产品的色、香味；红曲菌代谢产生的Monaclin?K以及纳豆菌产生的纳豆激酶，使该产品具有富含活性物质，有利于减缓解血栓疾病和心脑血管病的发病率。
【专利说明】—种富含纳豆激酶和Monacl in K的豆豉的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及发酵领域,具体涉及一种富含纳豆激酶和Monaclin K的功能型豆豉的制备方法。
【背景技术】
[0002]血栓性疾病可导致心肌梗塞、脑血栓中风、急性肺原性心脏病等相关性疾病，因其发病率高，复病率高，而且难以根治，已成为威胁人类健康的主要疾病。因此，近几年来就如何有效的治愈血栓性疾病，引起了医学界、科技界高度重视。1987年日本须见洋行博士发现纳豆中的强纤溶物质纳豆激酶(Nattokinase，NK)，并证明具有高效的溶栓作用。它不仅可通过口服直接溶解血栓，而且还能激活体内的纤溶酶原进而增加内源性纤溶酶的活性。相比临床上的溶栓药物(尿激酶(SK)、蚓激酶和组织型纤溶酶原激活剂)，纳豆激酶具有高效的溶纤活性、安全性好、生产成本低、无毒副作用、半衰期长、在胃肠的稳定性好等诸多优点。
[0003]莫纳可林K (Monaclin K)是红曲中的重要活性物质，是人体胆固醇生物合成的关键酶HMG.CoA还原酶的竞争性抑制剂，可有效降低人体内有害胆固醇低密度胆固醇的水平，是用于治疗心血管疾病的最重要的药物之一。Monacolin K也是目前世界医学界公认的降低人胆固醇的理想药物，具有高效、低毒的特点。Y-氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白质氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统重要抑制性神经递质，有降血压、促进脑机能、促进长期记忆和生长激素的分泌等功能。
[0004]随着我国人口老龄化的加剧，以及由肥胖带来的日益增多的高血压，高血脂，高胆固醇病人，开发同时具有降血栓，降血脂，降胆固醇的保健食品具有重要的意义。
[0005]通过这两种菌珠的混合发酵制备富含纳豆激酶和Monaclin K的新型豆豉产品，不但可以缓解血栓、降低血脂和降低胆固醇，而且色泽鲜美、具有特殊的风味。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种富含纳豆激酶和Monaclin K的豆豉的制备方法，方法简单，易行适于大规模生产，利用本发明的方法制备的豆豉，不但可以缓解血栓、降低血脂和降低胆固醇，而且色泽鲜美、具有特殊的风味。利用本发明所述方法制得的豆豉，纳豆激酶的含量为 3420— 3750IU/g，Monaclin K 的含量在 1.2-1.7mg/g。
[0007]一种富含纳豆激酶和Monaclin K的豆豉的制备方法，具体如下:
[0008](I)按照常规方法制备发芽黄豆，并灭菌，得到发芽黄豆固体培养基，其含水量为35% ?45% (w/w)；
[0009](2)将功能红曲经麦芽汁培养基活化后，接种于麦芽汁斜面培养基上，30°C培养6天，用0.2% (v/v)无菌冰醋酸溶液洗脱斜面孢子，功能红曲孢子悬液浓度> IO8个/mL，按体积质量比以10%接种在已灭菌的萌芽米中，置于30°C的恒温培养箱中，培养8?9d，在40?45°C下进行烘干，水分降到12%以下，不低于7%，获得功能红曲种子；[0010](3)将红曲种子,无菌水,0.2% (v/v)的无菌冰醋酸溶液按照6:1:3 (w:v:v)的比例进行混合，浸泡2h，然后磨浆，即为曲种浆。将曲种浆按照质量比为8-10%接种于发芽黄豆固体培养基，拌合均匀。采取变温发酵，前期30°C，恒温培养5-7d，后期转入23°C -26 °C恒温培养15-20d，发酵完成后按照葡萄糖与发芽黄豆固体培养基的质量比为2%加入葡萄糖，得到固体基质；
[0011](4)将培养至生长对数期的纳豆芽孢杆菌种子液以6-8% (v/w)的接种量接种于步骤(3)制得的固体基质进行混合发酵培养，33-37°C恒温培养24-48h，并加入3% (w/w)的盐，于4°C后熟24h，终止发酵；
[0012](5)通风干燥:40°C下通风干燥，水分含量在25%_30%，即得到了豆豉。
[0013]所述的纳豆芽孢杆菌种子液是将纳豆芽孢杆菌经LB平板活化后，接种LB液体培养基扩大培养8-12h即得，OD660值为0.8-1.2。
[0014]优选的，所述的纳豆芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(BaciIIus subtilis)BN-05,CCTCCNO:M2013530，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学；保藏日期:2013年11月3日。
[0015]优选的，发芽黄豆固体培养基的含水量为40%;
[0016]优选的，纳豆芽孢杆菌接种量为8% ；
[0017]优选的，接种纳豆芽孢杆菌后，培养的最佳温度是35°C ；
[0018]优选的，接种纳豆芽孢杆菌后，培养的最佳时间为24h。
[0019]优选的，麦芽汁培养基中麦芽汁的波美度为5.5-6.0 (25°C)。
[0020]优选的，发芽黄豆的芽长为l_2mm。
[0021]优选的，采用本发明所述的方法进行发芽黄豆的制备，具体步骤如下:
[0022]精选黄豆，去除无胚粒、未成熟颗粒及杂质，用自来水冲洗三遍，洗去表面的灰尘，然后用0.05% (w/v)NaC10溶液浸泡20_30min，再用纯净水冲洗3_5min去除表面的NaClO,浙干水分后，再加入蒸馏水在20-25°C下浸种，浸泡6?8h。浸泡完成后，浙干水分，将黄豆均匀地摊在底部有小孔的经过消毒的培养篮中，盖上已消毒的纱布，在纱布上面喷洒适量的纯净水，移入23°C的恒温培养箱中，每隔2h喷洒适量的纯净水以保持黄豆的湿度，每隔8h用纯净水冲洗黄豆以免被霉菌污染，整个发芽过程，湿度控制在80-95%，发芽时间为26-30h,芽长为l-2mm即可，把发芽黄豆置于高压锅中115°C蒸煮30min，冷却至20?30°C。以上所述菌株或原料，如未特别说明，从市场上购得的均能完成本发明。
[0023]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0024]1.采用发芽黄豆为原料，发芽黄豆富积大量的Y-氨基丁酸，有利于缓解心脑血管疾病；
[0025]2.利用红曲分泌红曲霉红素以及酯化酶，增强了产品的色、香味；
[0026]3.红曲菌代谢产生的Monaclin K以及纳豆菌产生的纳豆激酶，使该产品具有富含活性物质，有利于减缓解血栓疾病和心脑血管病的发病率。
[0027]4.该方法工艺操作简单，成本低廉。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限定本发明。所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。本发明所述实验方法或表述方式，如未特别说明，均为本领域技术人员公知的。
[0029]实施例1:
[0030]一种发芽黄豆的制备方法，具体如下:
[0031]精选黄豆，去除无胚粒、未成熟颗粒及杂质，用自来水冲洗三遍，洗去表面的灰尘，然后用0.05% (w/v)NaC10溶液浸泡30min，再用纯净水冲洗5min去除表面的NaCIO，浙干水分后，再加入蒸馏水在25°C下浸种，浸泡6h。浸泡完成后，浙干水分，将黄豆均匀地摊在底部有小孔的经过消毒的培养篮中，盖上已消毒的纱布，在纱布上面喷洒适量的纯净水，移A 230C的恒温培养箱中，每隔2h喷洒适量的纯净水以保持黄豆的湿度，每隔8h用纯净水冲洗黄豆以免被霉菌污染，整个发芽过程，湿度控制在80-95%，发芽时间为28h，芽长为l-2mm即可。把发芽黄豆置于高压锅中115°C蒸煮30min，冷却至20°C，既得发芽黄豆固体培养基，根据不同含水量的要求，浙水，称重。
[0032]实施例2:
[0033]一种富含纳豆激酶和Monaclin K的豆豉的制备方法，具体如下:
[0034](I)功能红曲纯种发酵培养:将功能红曲经麦芽汁培养基活化后,接种于麦芽汁斜面培养基上，30°C培养6天，用0.2% (v/v)无菌冰醋酸溶液洗脱斜面孢子，红曲孢子悬液浓度6X IO8个/mL，按体积质量比以10%接种在已灭菌的萌芽米中，置于30°C的恒温培养箱中，培养8d，在45°C下进行烘干，水分为10%。然后用干净塑料袋装好，放在阴凉出保存。
[0035]所述的麦芽汁培养基的配方为:波美度为6的麦芽汁,2.5%琼脂，pH自然。
[0036]所述的功能红曲为紫色红曲CICC5046 ；
[0037]将红曲种子，无菌水，0.2%的无菌冰醋酸溶液按6:l:3(w:v:v)的比例混合后，浸泡2h，然后磨浆，即为曲种浆。将曲种浆按8%的接种量添加于实施例1中制备的已灭菌的发芽黄豆固体培养基(含水量为35%)上，拌合均匀。采取变温发酵，前期30°C，恒温培养5d，后期转入26°C恒温培养15d，再按照葡萄糖与发芽黄豆固体培养基的质量比为2%加入葡萄糖；。
[0038](2)将生长至对数生长期的枯草芽孢杆菌种子液(CCTCC NO:M2013530)以6%的接种量(与发芽黄豆固体培养基的体积质量比)接种于红曲纯种发酵的黄豆上进行混合发酵培养，33°C恒温培养24h，并加入3%的细盐，于4°C后熟24h，终止发酵。
[0039](3)通风干燥:40°C下通风干燥，水分含量为28%，即得豆豉。
[0040]所述的枯草芽孢杆菌种子液是将纳豆芽孢杆菌经LB平板活化后，接种于50mL LB液体种子培养基中于35°C，180r/min的条件下培养10h，OD660值为1.2。
[0041]测得豆豉中纳豆激酶的含量为3479.74IU/g，Monaclin K的含量在1.28mg/g。
[0042]实施例3:
[0043]一种富含纳豆激酶和Monaclin K的豆豉的制备方法，具体如下:
[0044](I)红曲纯种发酵培养:步骤与实施例2相同。
[0045]将曲种浆按10%的接种量浆添加于实施例1中制备的已灭菌的发芽黄豆固体培养基(含水量为40%)中，拌合均匀。采取变温发酵，前期30°C，恒温培养5d，后期转入23°C恒温培养20d，再按照葡萄糖与发芽黄豆固体培养基的质量比为2%加入葡萄糖；
[0046](2)将生长至对数生长期的枯草芽孢杆菌种子液(CCTCC NO:M2013530, OD值为1.2)以8%的接种量(与发芽黄豆固体培养基的体积质量比)接种于红曲纯种发酵的黄豆上进行混合发酵培养，35°C恒温培养24h，并加入3%的细盐，于4°C后熟24h，终止发酵。
[0047](3)通风干燥:40°C下通风干燥，即得到了豆豉。
[0048]所述的枯草芽孢杆菌种子液是将纳豆芽孢杆菌经LB平板活化后，接种于50mL LB液体种子培养基中于35°C，180r/min的条件下培养10h，OD660值为1.2。
[0049]测得豆豉中纳豆激酶的含量为3742.45IU/g，Monaclin K的含量在1.66mg/g。
【权利要求】
1.一种富含纳豆激酶和Monaclin K的豆豉的制备方法，具体如下: (1)按照常规方法制备发芽黄豆，并灭菌，得到发芽黄豆固体培养基，其含水量为35%"45% ； (2)将功能红曲经麦芽汁培养基活化后，接种于麦芽汁斜面培养基上，30°C培养6天，用0.2 %体积比的无菌冰醋酸溶液洗脱斜面孢子，红曲孢子悬液浓度> IO8个/mL，按体积质量比以10%接种在已灭菌的萌芽米中，置于30°C的恒温培养箱中，培养8?9d，在40?45°C下进行烘干，水分降到12%以下，不低于7%，获得功能红曲种子； (3)将红曲种子,无菌水,0.2%的无菌冰醋酸溶液按照6:1:3,w:v:v的比例混合,浸泡2h，然后磨浆，将曲种浆按照质量比为8-10%接种于发芽黄豆固体培养基，拌合均匀； 采取变温发酵，前期30°C，恒温培养5-7d，后期转入23°C -26°C恒温培养15_20d，发酵完成后按照葡萄糖与发芽黄豆固体培养基的质量比为2%加入葡萄糖，得到固体基质； (4)将培养至生长对数期的纳豆芽孢杆菌种子液以6-8%的接种量接种于步骤(3)制得的固体基质进行混合发酵培养，33-37°C恒温培养24-48h，并加入3%的盐，于4°C后熟24h，终止发酵； (5)通风干燥:40°C下通风干燥，水分含量在25%-30%，即得到了豆豉。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的纳豆芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) BN-05, CCTCC NO:M2013530。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的麦芽汁培养基中的麦芽汁的波美度为5.5-6。
4.根据权利要求1所述的方法，发芽黄豆芽长为l_2mm。
【文档编号】A23L1/23GK103766781SQ201410009321
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】高冰, 高泽鑫, 王常苏 申请人:湖北工业大学