紫花苜蓿胚根直接用于pcr反应的制备方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明主要涉及一种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的方法。具体涉及紫花苜蓿胚根根尖经碱处理后，直接作为PCR模板进行SSR反应的方法。一种紫花苜蓿胚根作为PCR模板直接用于SSR反应的方法，其主要特点是包括有：紫花苜蓿胚根根尖经0.25M?NaOH水溶液100℃水浴条件下处理40s，之后加入400μl0.25M?HCl和200μl0.5M?Tris-HCl(pH8.0)，再次100℃沸水中孵育3min，处理过的根尖可直接作为PCR模板进行SSR反应。检测结果表明，该技术具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点，尤其是在受测群体较大时，此种方法更显得经济有效。
【专利说明】紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的制备方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及紫花苜蓿PCR反应的方法。具体涉及紫花苜蓿胚根用于PCR反应的制备方法。
【背景技术】
[0002]随着分子生物学技术的不断发展，产生了多种基于聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction, PCR)的分子标记技术,如简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)分析等(Vos等,2003 ；Akkaya等，1992 ；Charters等，1996)。目前,分子标记技术已广泛应用于种属特异性鉴定、目标基因的追踪、基因定位和遗传图谱绘制等方面。应用这些标记技术的第一步即须提取待测样品的基因组DNA，确定浓度后，取适量作为模板，进行相应的PCR扩增。常规制备待测样品基因组DNA的方法程序复杂且工作量大，在运用分子标记进行种内多态性分析时，往往需要检测大量的群体和单株，更显得费时费力且成本较高。因此，寻找一种快速、有效、简便地进行植物DNA扩增的新方法十分必要，虽然国外有文献报道已在拟南芥等植物中建立起快速、有效的微卫星分析体系(Virk等，1999)，但在主要牧草作物如紫花苜蓿中的快速、简便、有效的DNA分析体系却未见报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的 一是避免现有技术的不足，提出一种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的制备方法。
[0004]本发明的目的二是提供一种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的试剂盒。
[0005]以便快速、高效的对大量紫花苜蓿群体和单株进行SSR检测分析。此方法省时省力，操作简便，在较短时间内能够完成大量的工作。研究表明，此方法对于随机选取的15份紫花苜蓿单株样品都可适用。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的制备方法，其特征是包括如下步骤:
[0007]A.紫花苜蓿种子采用双层滤纸萌发法，在25°C萌发72h，切取l_3mm长胚根根尖备用；
[0008]B.将A步骤中切好的胚根根尖放入含400 μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，将此离心管插入100°c沸水中煮40s，取出并加入400 μ 10.25Μ HCl和200 μ 10.5Μ Tris-HClρΗ8.0，再次将该管放入100°C沸水中孵育3min，经过上述碱处理的紫花苜蓿胚根根尖直接作为PCR模板进行SSR反应。
[0009]一种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的试剂盒，其特征是包括有:
[0010]PCR总体积为20μ 1，经步骤A、B处理的紫花苜蓿胚根根尖l_3mm，2XPCRMasterlOy 1，正向引物 SSSR-Fl μ 1，反向引物 SSR-Rl μ 1，ddH208 μ I。
[0011]本发明的有益效果:此方法省时省力，操作简便，在较短时间内能够完成大量的工作。检测结果表明，本发明具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点，尤其是在受测群体较大时，此种方法更显得经济有效。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1紫花苜蓿胚根根尖。图中:紫花苜蓿胚根根尖长度约2mm ；
[0013]图2a显示以15份紫花苜蓿单株基因组DNA为模板的SSR反应成像效果图；
[0014]图2b显示15份紫花苜蓿以本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖为模板的SSR反应成像效果图；
[0015]图中:图2a和图2b引物均为正向引物SSRl-F和反向引物SSRl-R ;
[0016]图3a显示以15份紫花苜蓿单株基因组DNA为模板的SSR反应成像效果图；
[0017]图3b显示15份紫花苜蓿以本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖为模板的SSR反应成像效果图；
[0018]图中:图3a和图3b引物均为正向引物SSR2-F和反向引物SSR2-R，
[0019]图4a为明场条件下紫花苜蓿胚根根尖经EB染色成像效果；
[0020]图4b为紫外光条件下紫花苜蓿胚根根尖经EB染色成像效果。
[0021]图中:CK代表未经碱处理紫花苜蓿胚根根尖。
【具体实施方式】
[0022]以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0023]实施例1:一种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的制备方法，其特征是包括如下步骤:
[0024]A.紫花苜蓿种子采用双层滤纸萌发法，在25°C萌发72h，切取l_3mm长胚根根尖备用；
[0025]B.将A步骤中切好的胚根根尖放入含400 μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，将此离心管插入100°c沸水中煮40s，取出并加入400 μ 10.25Μ HCl和200 μ 10.5Μ Tris-HClρΗ8.0，再次将该管放入100°C沸水中孵育3min，经过上述碱处理的紫花苜蓿胚根根尖直接作为PCR模板进行SSR反应。
[0026]实施例2:—种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的试剂盒，其特征是包括有:
[0027]PCR总体积为20μ 1，经步骤A、B处理的紫花苜蓿胚根根尖l_3mm，2XPCRMasterlOy 1，正向引物 SSSR-Fl μ 1，反向引物 SSR-Rl μ 1，ddH208 μ I。
[0028]实施例3:—种紫花苜蓿(“美国金皇后”品种，储存于兰州大学草地农业科技学院种子库)胚根根尖作为PCR模板直接用于SSR反应的方法，其包括如下步骤:
[0029]A.紫花苜蓿种子采用双层滤纸萌发法，25°C萌发72h，切取约2mm长胚根根尖备用，见图1 ;
[0030]B.将A步骤中切好的胚根根尖放入含400 μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，将此离心管插入沸水中煮40s，取出并加入400 μ 10.25Μ HCl和200 μ 10.5Μ Tris_HCl(pH8.0)，再次将该管放入沸水中孵育3min，经过上述碱处理的紫花苜蓿胚根根尖直接作为PCR模板进行SSR反应。
[0031]C.PCR反应的体系， PCR总体积为20 μ 1，模板为步骤B碱处理的紫花苜蓿胚根根尖，2XPCR Master (上海生工产品编号:SK2082) 10 μ 1，正向引物SSSR-Fl μ 1，反向引物SSR-Rl μ l，ddH208y I。PCR 方法为:(1)95°C预变性 2min ；(2) 95°C变性 30s ;(3) 55°C退火 30s ； (4) 72°C延伸 30s ; (5) 2 ~4 步骤循环 38 次；(6) 72°C延伸 7min。
[0032]D.PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测效果，见图2和图3。
[0033]实验例1:15份紫花苜蓿以单株基因组DNA为模板的SSR反应与以本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖为模板的SSR反应效果对比:
[0034]使用正向引物SSRl-F和反向引物SSRl-R对15份紫花苜蓿单株进行SSR反应包括如下步骤:
[0035]正向引物SSRl-F 为:GTCGTAGTAAACGTAAACAAAGAA
[0036]反向引物SSRl-R 为:ACGGCAGGAACAGATCCTTGAA
[0037]此对引物为本发明较佳实施例引物，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0038](I).以15份紫花苜蓿(“美国金皇后”品种，储存于兰州大学草地农业科技学院种子库)单株基因组DNA为模板的SSR反应
[0039]提取15份紫花苜蓿单株的基因组DNA，将其浓度稀释为200ng/μ 1，用作模板，采用正向引物SSRl-F和反向引物SSRl-R进行SSR反应。
[0040]PCR体系为:2XPCR Master (上海生工产品编号:SK2082)10 μ 1，紫花苜蓿基因组DNA 模板 I μ 1，正向引物 SS`Rl-Fly 1，反向引物 SSRl-Rly I, ddH207 y I。PCR 方法为:(1)95°C 预变性 2min ;(2)95°C 变性 30s ; (3)55°C 退火 30s ; (4) 72°C 延伸 30s ；(5)2 ~4 步骤循环38次；(6) 72°C延伸7min。
[0041]PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其效果为:
[0042]图2a显示以15份紫花苜蓿单株基因组DNA为模板的电泳条带清晰明亮。
[0043](2).15份紫花苜蓿(“美国金皇后”品种，储存于兰州大学草地农业科技学院种子库)以本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖为模板的SSR反应效果
[0044]将15份紫花苜蓿种子采用双层滤纸萌发法，25°C萌发72h，切取约2mm长胚根根尖。
[0045]将切好的胚根根尖放入含400 μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，将此离心管插入沸水中煮40s，取出并加入400 μ 10.25Μ HCl和200 μ 10.5Μ Tris-HCl (ρΗ8.0)，再次将该管放入沸水中孵育3min，经过上述碱处理的紫花苜蓿胚根根尖直接作为PCR模板进行SSR反应。
[0046]PCR体系为:2XPCR Master (上海生工产品编号:SK2082)10 μ 1，碱处理过的紫花苜蓿胚根根尖作为模板，正向引物SSRl-Fl μ 1，反向引物SSRl-Rl μ 1，ddH208 y L.PCR方法为:(1)95°C预变性 2min ;(2)95°C变性 30s ;(3)55°C退火 30s ;(4)72°C延伸 30s ；(5)2~4步骤循环38次；(6) 72°C延伸7min。
[0047]PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其效果为:
[0048]图2b显示以15份碱处理过的紫花苜蓿胚根根尖作为模板的电泳条带清晰明亮，与图2a中电泳条带效果一致。
[0049]实验例2:15份紫花苜蓿以单株基因组DNA为模板的SSR反应与以本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖为模板的SSR反应效果对比:[0050]使用正向引物SSR2-F和反向引物SSR2-R对15份紫花苜蓿单株进行SSR反应包括如下步骤:
[0051 ]正向引物 SSR2-F 为:CCAAACTCAGAACCCTAACCCAA
[0052]反向引物SSR2-R 为:GAACTTGTCAAGACCCATGAAGA
[0053]此对引物为本发明较佳实施例引物，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0054](I).以15份紫花苜蓿(“美国金皇后”品种，储存于兰州大学草地农业科技学院种子库)单株基因组DNA为模板的SSR反应:
[0055]提取15份紫花苜蓿单株的基因组DNA，将其浓度稀释为200ng/μ 1，用作模板，采用正向引物SSR2-F和反向引物SSR2-R进行SSR反应。
[0056]PCR体系为:2XPCR Master (上海生工产品编号:SK2082)10 μ 1，紫花苜蓿基因组DNA模板I μ 1，正向引物引物SSR2-Fly 1，反向引物SSR2-Rly l，ddH207 y I。PCR方法同实验例I。
[0057]PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其效果为:
[0058]图3a显示以15份紫花苜蓿单株基因组DNA为模板的电泳条带清晰明亮。
[0059](2).以15份本发明制备的紫花苜蓿(“美国金皇后”品种，储存于兰州大学草地农业科技学院种子库)胚根根尖为模板的SSR反应效果
[0060]将15份紫花苜蓿种子采用双层滤纸萌发法，25°C萌发72h，切取约2mm长胚根根尖。
[0061]紫花苜蓿胚根根尖处理方法同实验例I。
[0062]PCR体系为:2XPCR Master (上海生工产品编号:SK2082)10 μ 1，碱处理过的紫花苜蓿胚根根尖作为模板，正向引物SSR2-Fly 1，反向引物SSR2-Rly 1，(ΜΗ208 μ I。PCR方法同(I)。
[0063]PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其效果为:
[0064]图3b显示以15份碱处理过的紫花苜蓿胚根根尖作为模板的电泳条带清晰明亮，与图3a中电泳条带效果一致。
[0065]实验例3:本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖的荧光观察，包括如下步骤:
[0066]将经过本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖和未经碱处理的对照根尖分别放入
0.05mg/ml的溴乙锭(EB)溶液中，反应30s后，用吸水纸吸去多余的液体，在紫外灯下进行观察并拍照。
[0067]图4a显示，在明场条件下经过本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖和未经碱处理的对照根尖均能成像。
[0068]图4b显示，在紫外光照射条件下经经过本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖可以成像，而未经碱处理的根尖不能成像。表明经本发明制备的紫花苜蓿胚根根尖细胞内的DNA已经析出并与EB结合，在紫外光的照射下发射荧光，进而成像。而未经碱处理的紫花苜蓿胚根根尖，没有DNA析出，不能与EB结合，经紫外光照射不能产生荧光，遂不能成像。
[0069]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的制备方法，其特征是包括如下步骤: A.紫花苜蓿种子采用双层滤纸萌发法，在25°C萌发72h，切取1-3_长胚根根尖备用； B.将A步骤中切好的胚根根尖放入含400μ 10.25Μ NaOH的Eppendorf管中，将此离心管插入1001:沸水中煮408，取出并加入40(^10.25皿 HCl 和 200 μ 10.5Μ Tris-HCl ρΗ8.0,再次将该管放入100°C沸水中孵育3min，经过上述碱处理的紫花苜蓿胚根根尖直接作为PCR模板进行SSR反应。
2.一种紫花苜蓿胚根直接用于PCR反应的试剂盒，其特征是包括有: PCR总体积为20 μ 1，经步骤A、B处理的紫花苜蓿胚根根尖l-3mm，2XPCRMasterlOy 1，正向引物 SSSR-Fl μ 1，反向引物 SSR-Rl μ 1，ddH208 μ I。
【文档编号】C12Q1/68GK103773869SQ201410023097
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】刘志鹏, 马利超, 罗栋, 王彦荣, 陈天龙 申请人:兰州大学