一种高立体选择性酯水解酶、编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有高度R-异构体立体选择性的酯水解酶及其编码基因，以及含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。所述酯水解酶氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，编码基因如SEQ?ID?No.1所示。本发明酯水解酶具有较高的催化活力和立体选择性，可以用于制备光学纯的手性化合物，特别是左乙拉西坦中间体α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯。
【专利说明】一种高立体选择性酯水解酶、编码基因及其应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高立体选择性酯水解酶及其编码基因，以及含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。
(二)【背景技术】
[0002]酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一类在手性合成中有着重要用途的生物催化剂。这些酶能识别很宽的底物，目前> 40%的生物不对物合成反应可有酯水解酶催化完成，这些反应具有条件温和、反映的区域选择性和立体选择性高等特点。在酶动力学拆分外消旋酯、胺和转化前手性醇等方面等到广泛的应用。另外，它们还可用于选择性酯化、转酯化和聚合反应中。
[0003]由于对手性药物和中间体需求的增长，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人们的重视和工业化应用。生物法合成手性化合物的关键问题在于寻找具有高度立体选择性催化功能的生物催化剂。由于酯水解酶具有广泛的用途，筛选新的酯水解酶正成为酶工程的研究热点。虽然酯水解酶在微生物界分布很广，但它们的立体选择性催化功能不一样。在同一生物体内往往存在多种酯水解酶，由于它们之间立体选择性存在差异性，利用为生物细胞或它们的粗酶制品进行酶法合成手性化合物时往往会降低产物的光学纯度(Geun-Joong Kim, Journal of Molecular Catalysis B:Enzymaticl7, 2002:29-38)。解决这一问题可以通过工程的调控手段来减少副反应的发生，也可以通过分离纯化得到单一的酶制剂来进行催化反应，但这些过程往往较复杂和高的成本，再生产中不易被采用。如果通过基因工程的手段，直接 克隆和表达所需要的酶的基因，就能够很方便达到以上的目的。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一种筛选获得的具有较高R-异构体立体选择性的酯水解酶，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。
[0005]本发明采用的技术方案是:
[0006]一种具有R-异构体立体选择性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]本发明人通过筛选大量的微生物，发现巨大芽孢杆菌能产生一种具有高度R-异构体立体选择性的酯水解酶，本发明酯水解酶来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WZZ001，保藏编号CCTCC M2012403,已在CN102994429A中披露。发明人通过PCR扩增得到芽孢杆菌WZZ001的一种具有R-异构体立体选择性的酯酶基因BCEST，测定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ ID N0.1所示，其中编码序列(⑶S)从DNA第I个碱基起至第1458终止，ATG为转录起始密码子，TAA为转录终止密码；并得到相应的氨基酸序列，如列表中SEQID N0.2 所示。
[0008]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0009]本发明还涉及所述酯水解酶的编码基因。具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0010]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0.1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
[0011]本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的
重组基因工程菌。
[0012]所述重组载体是用常规方法将本发明的酯水解酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pLEX(Novagen, Inc., Madison, ffis.), PQE(Qiagen)，pREP,PSE420和pLEX(Invitrogen)，但不是仅限于这些载体。较佳的是将PCR扩增到的BCEST基因产物通过TA克隆和表达载体pEASY-El连接，形成BCEST基因的表达载体(质粒)pEASY-E1-BCEST。表达载体pEASY-E1-BCEST转化Transl-Tl感受态细胞，扩增质粒。
[0013]所述基因工程菌是将包含本发明酯水解酶基因核苷酸序列的表达载体转化到宿主微生物，例如感受态大肠杆菌——大肠埃希氏菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中得到的基因工程菌株，如将上述质`粒pEASY-E 1-BCEST转化其中得到含有pEASY-E 1-BCEST的大肠埃希氏菌 E.coli BL21 (DE3)/pEASY-E1-BCEST。
[0014]本发明还涉及所述基因在制备重组酯水解酶中的应用。具体的应用包括用上述本发明表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的酯水解酶。其中，该宿主细胞可以为原核、真核微生物或昆虫等。较佳的是大肠杆菌，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株:大肠埃希氏菌E.coli BL21 (DE3)/pEASY-E1-BCEST。此菌株可在常规的IPTG诱导下(在0D600=0.5~0.6左右时加入，至其浓度为0.1~lmmol/L均可)高效表达酯水解酶蛋白，即为本发明的重组酯水解酶。
[0015]本发明还涉及所述的酯水解酶在立体选择性催化拆分外消旋底物制备手性化合物中的应用。所述外消旋底物为下列之一乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯、BOC-丙氨酸甲酯、B0C-2-氨基丁酸甲酯、B0C-2-氨基戊酸甲酯。
[0016]本发明的重组酯水解酶可以用于制备光学纯的手性化合物(R构型酸和S构型酯)，特别是左乙拉西坦中间体(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯。
[0017]本发明的有益效果主要体现在:本发明酯水解酶具有较高的催化活力和立体选择性，可以用于制备光学纯的手性化合物，特别是左乙拉西坦中间体(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯。
(四)【专利附图】
【附图说明】[0018]图1为本发明酯水解酶基因BCEST的PCR扩增电泳图谱，其中，UBCEST的PCR扩增产物；2> DNA Marker ( λ -Hind III digest, TakaRa 公司)。
[0019]图2为本发明质粒pEASY-E 1-BCEST PCR验证电泳图谱，其中，1、重组质粒pEASY-E 1-BCEST PCR 产物；2、DNA Marker ( λ-Hind III digest, TakaRa 公司)。
[0020]图3为本发明基因工程菌株E.coli BL21 (DE3)/pEASY-El-BCEST表达产物的PAGE电泳图，其中，1、基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-El-BCEST诱导前产物；2、基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-E1-BCEST经IPTG诱导后产物；3、低分子量标准蛋白质(TakaRa 公司)。
[0021]图4为底物外消旋α -乙基-2-氧_1_吡咯烷乙酸甲酯气相检测图谱。
[0022]图5为本发明重组酯酶水解α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的气相检测图谱。
[0023]图6为表达质粒pEASY-E 1-BCEST构建示意图。
(五)【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0025]实施例中的材料与方法为:
[0026]所采用的分子克隆技术参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0027]TransStartTM Taq DNA Polymerase购于TransGen Biotech 公司。DNA marker、基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒、琼脂糖电泳试剂均购自TaKaRa，大连宝生物公司，使用方法参考商品说明书。
[0028]Transl-Tl感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)
[0029]大肠埃希氏菌BL21 (DE3) (TakaRa,大连宝生物公司)
[0030]N1-NTA Sefinose Kit (Bio Basic INC 公司)
[0031]实施例1:从蜡状芽孢杆菌克隆BCEST基因
[0032]根据Bacilluscereus ATCC10876基因组DNA序列(GenBank:ACLT01000051.1)设计简并引物I和引物2。
[0033]引物I 序列:TCTAAAATTGAAACACCTGTTATG
[0034]引物2 序列:TTATTTAATTTTCTTAAATGTAAGC
[0035]以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CCTCC M2012403基因组DNA为模板进行PCR扩增(利用Takala试剂盒)，PCR反应体系和反应条件如表1和2所示。步骤2到4重复29次。
[0036]表1:PCR扩增反应体系
【权利要求】
1.一种具有R-异构体立体选择性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.编码权利要求1所述酯水解酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
6.权利要求2或3所述基因在制备重组酯水解酶中的应用。
7.权利要求1所述的酯水解酶在立体选择性催化拆分外消旋底物制备手性化合物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述外消旋底物为下列之一:α -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯 、BOC-丙氨酸甲酯、B0C-2-氨基丁酸甲酯、B0C-2-氨基戊酸甲酯。
【文档编号】C12P7/62GK103820416SQ201410022841
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】汪钊, 郑建永, 应向贤, 章银军 申请人:浙江工业大学