鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明主要涉及一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记及其专用引物。具体涉及老芒麦和披碱草种子基因组DNA的分子标记引物试剂盒及其检测方法。一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记，其主要特点包括有：老芒麦和披碱草的PCR检测体系相同，其中包括2×Eco?Taq?PCR?SuperMix，引物Elymus-F（5′-3′）：AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC，引物Elymus-R（5′-3′）：TGAAATGGCTATCGCTTGACCG，ddH2O和模板DNA。本发明的优点是该技术具有成本低、准确度高、稳定性好、重复性强和简单快捷等特点，尤其是受测群体较大时，此种方法具有更显著的经济效应，为我国的优良牧草的安全生产提供重要保障。
【专利说明】鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明主要涉及一种鉴定老芒麦种子真伪的分子标记及其专用引物。具体涉及老芒麦和披碱草种子基因组DNA的分子标记引物试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]老芒麦(E.Sibiricus)和披碱草(Elymus dahuricus)广泛分布于我国的东北、西北、华北和青藏高原等地区，是草甸草原和草甸群落中的重要成分，能形成优势种和建植群(陈默君，2002)。随着我国草地畜牧业的迅速发展，退耕还林(还草)等项目的实施，老芒麦和披碱草种质资源的需求量也随之增多。
[0003]老芒麦和披碱草皆为披碱草属物种。披碱草是中等的饲料，在披碱草草丛中，叶占的比例较少，茎杆所占比例大，而质地粗硬，影响了饲料品质，披碱草的亩产干草可高达375-650公斤。老芒麦的叶量丰富，适口性好，粗蛋白含量高，消化率达80%以上，适时刈割既可调制成干草，也可青饲和放牧，为牛、马、羊等家畜所喜食，老芒麦的亩产干草在200-400公斤。综上所述，披碱草是高产的饲料品种，老芒麦是高质饲料品种，这使得两种牧草在畜牧生产领域需严格区别开来，因而准确迅速区分开披碱草和老芒麦，保证高纯度的种子，对于确保我国老芒麦和披碱草种子的质量具有十分重要的意义。
[0004]传统的分类方法主要依据老芒麦和披碱草的外部形态特征差异进行划分，存在许多不完善之处。经研究分析，老芒麦和披碱草在长期适应进化过程中，两个种不同的生态型在形态性状上具有较多的性状交叉，所以这两种牧草的种子、幼苗和叶片在外观上极为相似，一旦两种牧草种子混在 在一起，从形态学上将极难区分。这不仅对牧草科学研究造成严重干扰，而且对老芒麦和披碱草的种植和生产造成巨大的影响。
[0005]21世纪是生命科学的世纪，生物学已经进入微观分子水平，分子标记已开始应用于作物遗传资源及育种研究。目前分子标记的方法主要有限制性片断长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA (RAPD)、扩增片断长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)、染色体原位杂交(ISH)(李造哲，2000)。虽然国内有文献已报道利用不同来源微卫星引物对9种披碱草属植物进行遗传分析(严学兵，2008)，但是利用分子标记鉴定披碱草属植物的方法却未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的一是避免现有检测技术的缺陷，提出一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的专用引物。
[0007]本发明的目的二是提供一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的试剂盒。
[0008]本发明的目的三是提供一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的方法。
[0009]以便快速、高效和准确的鉴定老芒麦和披碱草种子。此方法省时高效，操作简便，在实验室条件下较短时间内能够很好完成。研究中，随机从美国国家种质库抽取的5份老芒麦、10份披碱草种质，并和从中国西北地区选取的10份老芒麦种质都可适用，具有很强的推广价值，有助于种子检验人员快速有效区分老芒麦和披碱草种子。在我国牧草产业化推广中，该技术具有广阔的应用前景，为我国的畜牧业粮食安全提供重要保障，从而保证我国畜牧业向增加农民收入，提高国民经济的方向发展。
[0010]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的专用引物，其主要特点是包括有:
[0011]老芒麦和披碱草专用引物:Elymus-F(5' -3' ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC ；
[0012]Elymus-R (5' -3/ ):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG。
[0013]一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的试剂盒，其主要特点包括有:
[0014]第一组:老芒麦PCR检测体系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix,引物 Elymus-F (5 ' -3 , ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC,引物 Elymus-R (5 ' _3 '):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG 和 ddH20 ；
[0015]第二组:披碱草PCR检测体系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix,引物 Elymus-F (5 ' -3 , ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC,引物 Elymus-R (5 ' _3 '):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG 和 ddH20。
[0016]一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的方法，其主要包括如下步骤:
[0017]A.收集种子，采用双层滤纸萌发法，20-300C，萌发5-10天至露白，提取萌发种子基因组DNA备用；
[0018]B.利用老芒麦和披碱草专用引物，对老芒麦种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为20μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMixlO μ 1，引物Elymus-F (5 ' -3 ' ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ I,引物 Elymus-R (5 ' _3 '):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ 1，ddH206 μ I 和老芒麦 DNA 模板(50ng/ μ I) 2 μ I ;扩增条件为:(1)94°C预变性 3min ;(2)94°C变性 30s ; (3)60°C退火 30s ; (4)72。。延伸 30s ； (5)2-4步骤循环38次；(6) 72°C延伸7min。
[0019]C.利用老芒麦和披碱草专用引物，对披碱草种子基因组DNA进行PCR检测；PCR检测体系的总体积为20 μ I，其中包括2 X EcoTaq PCR SuperMixlO μ I，引物Elymus-F (5 ' -3 ' ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ I,引物 Elymus-R (5 ' _3 '):TGAAATGGCTATCGCTTGACC G I μ 1，ddH206 μ I 和披碱草 DNA 模板(50ng/ μ I) 2 μ I ;扩增条件为:(1)94°C预变性 3min ;(2)94°C变性 30s ; (3)60°C退火 30s ; (4)72。。延伸 30s ； (5)2-4步骤循环38次；(6) 72°C延伸7min。
[0020]D.将老芒麦和披碱草PCR产物在同一张8%非变性丙烯酰胺胶片中电泳，电泳电压为180V，跑胶2.5h ；EB燃料染色5min，紫外灯下照相；
[0021]E.其电泳扩增条带大小都在200bp_300bp之间，扩增条带268bp为老芒麦；扩增条带255bp为披碱草。
[0022]本发明的有益效果是，可以快速有效地鉴定出老芒麦和披碱草种子。此方法具有成本低、准确度高、稳定性好、重复性强和简单快捷等特点，能够大批量进行老芒麦和披碱草种子的鉴定，为保障两种牧草种子纯度鉴定提供可行依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1.老芒麦和披碱草在形态学上的相似性；[0024]图中:(A和B)披碱草和老芒麦单粒种子、(C和D)披碱草和老芒麦种子、(E和F)披碱草和老芒麦幼苗及(G和H)披碱草和老芒麦叶片对照图，比例尺表示1cm。
[0025]图2.两种老芒麦和披碱草种子(见表1)间的PCR鉴定结果；
[0026]图中:老芒麦(E.sibiricus)的1_15编号表示老芒麦15个单株，披碱草(E.dahuricus)的 1-15 编号表示披碱草 15 个单株，“M”表示 DL500 的 DNA Marker, “H20”表示以ddH20为模板的负对照组。
[0027]图3.不同种质的老芒麦和披碱草种子间的PCR鉴定结果；
[0028]图中:老芒麦(E.sibiricus)的1_15编号表示老芒麦15个不同种质(见表2),披碱草(E.dahuricus)的1_10编号表示披碱草10个不同种质(见表3)，“M”表示DL500的DNA Marker, “ H2O ”表示以ddH20为模板的负对照组。
[0029]图4.老芒麦和披碱草混合种子的PCR鉴定结果。
[0030]图中:100:0、99:1、98:2、95:5、90:10、75:25、50:50、25:75、10:90、5:95、2:98、
1:99和0:100表示老芒麦和披碱草基因组DNA模板混合的比例，“M”表示DL500的DNAMarker, “H20”表示以ddH20为模板的负对照组。
【具体实施方式】
[0031]以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0032]实施例1:一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的专用引物，包括有:
[0033]老芒麦和披碱草专用引物:Elymus-F(5' -3/ ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC ；
[0034]Elymus-R (5' -3/ ):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG。
[0035]实施例2:—种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的试剂盒，包括有:
[0036]第一组:老芒麦PCR检测体系，PCR检测体系的总体积为20μ1，其中包括
2X EcoTaq PCRSuperMixlO μ 1，引物 Elymus-FG' -3/ ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ I,弓 I 物 Elymus-R (5' -3/ ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I 和 ddH206 μ I;
[0037]第二组:披碱草PCR检测体系，PCR检测体系的总体积为20μ 1，其中包括
2X EcoTaq PCRSuperMixlO μ 1，引物 Elymus-FG' -3/ ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ I,弓 I 物 Elymus-R (5' -3/ ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I 和 ddH206 μ I。
[0038]实施例3:—种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的试剂盒，包括有:
[0039]第一组:老芒麦PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的两倍。
[0040]第二组:披碱草PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的两倍。
[0041]实施例4:一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的试剂盒，包括有:
[0042]第一组:老芒麦PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的五倍。
[0043]第二组:披碱草PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的五倍。
[0044]实施例5:—种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的试剂盒，包括有:
[0045]第一组:老芒麦PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的十倍。
[0046]第二组:披碱草PCR检测体系与实施例2相同，数量为实施例2的十倍。
[0047]实施例6:—种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的方法，包括如下步骤:
[0048]Α.收集种子，采用双层滤纸萌发法，25°C萌发5-10天至露白，提取萌发种子基因组DNA备用；
[0049]B.利用老芒麦和披碱草专用引物，对老芒麦种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为50μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix (上海生工，产品编号:SK2082)25 μ 1，引物 Elymus-F (5' -3/ ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC1 μ 1，引物 Elymus-R(5 ' -3 ' ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I，ddH2020 μ I 和老芒麦 DNA 模板(50ng/ μ I)
3μ I。扩增条件为:(1)941:预变性31^11;(2)941:变性308;(3)601:退火308 “4)72。。延伸30s ；(5) 2-4步骤循环38次；(6) 72°C延伸7min ；
[0050]C.利用老芒麦和披碱草专用引物，对披碱草种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为50μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix (上海生工，产品编号:SK2082)25 μ 1，引物 Elymus-F (5' -3/ ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC1 μ 1，引物 Elymus-R(5 ' -3 ' ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I，ddH2020 μ I 和披碱草 DNA 模板(50ng/ μ I)3 μ I。扩增条件为:(1)94°C预变性 3min ;(2)94°C变性 30s ;(3)60°C退火 30s “4)72。。延伸30s ；(5) 2-4步骤循环38次；(6) 72°C延伸7min ；
[0051]D.将老芒麦和披碱草PCR产物在同一张8%非变性丙烯酰胺胶片中电泳，电泳电压为180V，跑胶2.5h ；EB燃料染色5min，紫外灯下照相；
[0052]E.其电泳扩增条带大小都在200bp_300bp之间，扩增条带268bp为老芒麦；扩增条带255bp为披碱草。见图2.[0053]实施例7:鉴定两种老芒麦和披碱草种子间的分子标记的方法，包括如下步骤:
[0054]从15份老芒麦和10份披碱草种质中各抽取一种种质作为参试材料(见表1)。米用双层滤纸萌发法，25° C萌发5-10天至露白，提取这两个种质各15份单粒种子的基因组DNA，共3份。将其浓度稀释为50ng/l.! 1，用作模板，采用Elymus-F和Elymus-R引物进行PCR扩增。
[0055]PCR检测体系的总体积为50μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix (上海生工，产品编号:SK2082)25y 1，引物 Elymus-F (5' -3' ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ 1，引物Elymus-R (5' -3' ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I，ddH2020 μ I 和 DNA 模板(50ng/ μ I)
3μ I。扩增条件为:(1)941:预变性31^11;(2)941:变性308;(3)601:退火308 “4)72。。延伸30s ；(5) 2-4步骤循环38次；(6) 72°C延伸7min。
[0056]将30份老芒麦和披碱草的PCR产物在同一张8%非变性丙烯酰胺胶片中电泳，电泳电压为180V，跑胶2.5h。然后EB燃料染色5min，紫外灯下照相。
[0057]其效果为:
[0058]图2显示老芒麦(W622137)和披碱草(PI655096)各15个单粒种子的基因组DNA为模板，其电泳扩增条带大小都在200bp-300bp之间，并且老芒麦(W622137)的电泳扩增片段大于披碱草(PI655096)的电泳扩增片段。
[0059]表1.老芒麦和披碱草种子参试种质的信息描述
[0060]
【权利要求】
1.一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的引物，其特征是包括有: 老芒麦和披碱草专用引物:Elymus-F (5' -3/ ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC ；
Elymus-R (5' -3/ ):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG。
2.一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的试剂盒，其特征包括有: 第一组:老芒麦PCR检测体系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix,引物Elymus-F (5 ' -3 ' ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC,引物 Elymus-R (5 'TGAAATGGCTATCGCTTGACCG 和 ddH20 ； 第二组:披碱草PCR检测体系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix,引物Elymus-F (5 ' -3 ' ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC,引物 Elymus-R (5 'TGAAATGGCTATCGCTTGACCG 和 ddH20。
3.一种鉴定老芒麦种子真伪的特异分子标记的方法，其特征是包括如下步骤: A.收集种子，采用双层滤纸萌发法，20-300C，萌发5-10天至露白，提取萌发种子基因组DNA备用； B.利用老芒麦和披碱草专用引物，对老芒麦种子基因组DNA进行PCR检测；PCR检测体系的总体积为 20μ 1，其中包括 2XEcoTaq PCR SuperMixlO μ 1，引物 Elymus-F(5' -3'):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGCI μ 1，引物 Elymus-1KS' -3/ ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ 1，ddH206 y I 和老芒麦DNA模板，50ng/y 1，2μ I ;扩增条件为:(1)94°C预变性 3min ; (2)94°C变性 30s ；(3) 60°C 退火 30s ；(4) 72°C 延伸 30s ；(5) 2-4 步骤循环 38 次；(6) 72°C 延伸7min ； C.利用老芒麦和披碱草专用引物，对披碱草种子基因组DNA进行PCR检测；PCR检测体系的总体积为 20μ 1，其中包括 2XEcoTaq PCR SuperMixlO μ 1，引物 Elymus-F(5' -3'):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ 1，引物 Elymus-1KS' -3/ ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ 1，ddH206 μ I和披碱草DNA模板，50ng/y 1，2μ I ;扩增条件为:(I) 94 °C预变性3min ; (2)94°C 变性 30s ；(3) 60°C 退火 30s ； (4) 72°C 延伸 30s ；(5) 2-4 步骤循环 38 次；(6) 72。。延伸 7min。 D.将老芒麦和披碱草PCR产物在同一张8%非变性丙烯酰胺胶片中电泳，电泳电压为180V，跑胶2.5h ；EB燃料染色5min，紫外灯下照相； E.其电泳扩增条带大小都在200bp-300bp之间，扩增条带268bp为老芒麦；扩增条带255bp为披碱草。
【文档编号】C12Q1/68GK103789423SQ201410022961
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】刘志鹏, 罗栋, 马利超, 王彦荣, 王宇 申请人:兰州大学