具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法

具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
【专利摘要】本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状、尤其用于增加植物产量和/或早期萌发势的方法。更具体地，本发明涉及用于增强产量相关性状的方法，其包括优先增加编码HAL3多肽的核酸在植物苗中的表达。本发明还涉及具有编码HAL3多肽的核酸在苗中的优先增加的表达的植物，其中所述植物相对于对照植物具有增加的产量和/或早期萌发势。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于相对于对照植物增强产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及用于增加植物产量的方法，其包括减少编码内源性MADS15多肽的核酸在植物中表达。本发明还涉及具有编码内源性MADS15多肽的核酸的减少表达的植物，其中所述植物相对于合适对照植物具有增加的产量。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。本发明涉及用于通过MADS15蛋白质在植物中的增加表达而增强植物中产量相关性状的方法。一种此类方法包括导入并增加MADS15核酸或其变体的表达。本发明还涉及具有编码如此MADS15蛋白质的核酸受调节表达的植物，其中所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于相对于对照植物增强产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及用于增加植物产量的方法，包括增加编码PLT转录因子多肽的核酸在植物中表达。本发明还涉及具有编码PLT转录因子多肽的核酸的增加表达的植物，其中所述植物相对于合适对照植物具有增加的产量。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济上重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及用于通过调节编码基本/螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子的核酸在植物中的表达而增强植物中产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码bHLH转录因子的核酸的受调节表达的植物，其中所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及用于通过增加编码鳞部启动子结合蛋白样15(SPL15)转录因子多肽的核酸在植物中表达而增加植物中产量的方法。本发明还涉及具有编码SPL15转录因子多肽的核酸的增加表达的植物，其中所述植物相对于合适的对照植物具有增加的产量。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。
【专利说明】具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
[0001]本申请是中国专利申请200780011307.X的分案申请，原申请的申请日是2007年3月30日，发明名称是“具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法”。
[0002]本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节编码GRP(生长相关蛋白)的核酸在植物中表达而改进多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码GRP的核酸的受调节表达的植物，其中所述植物相对于对应野生型植物或其它对照植物具有改良的生长特征。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。
[0003]持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
[0004]具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。
[0005]种子产量是特别重要的性状，因为众多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用众多类型代谢物的来源。种子含有胚(新`苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间及幼苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
[0006]对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。
[0007]又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50%(Wang等、Planta(2003)218:l-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民是极大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
[0008]作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。
[0009]取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。
[0010]增加植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号途径。
[0011]现已发现可以通过调节植物中的编码GRP(生长相关蛋白)的核酸在植物中表达而改进植物中的多种生长特征。GRP可以是如下蛋白之一:MADS盒转录因子(0sMADS15)、PLT转录因子、bHLH转录因子、SPL15转录因子和耐盐蛋白(HAL3)。
[0012]背景
[0013]耐盐蛋白
[0014]细胞中的众多酶过程需要辅酶A(CoA或CoASH)的参与。辅酶A(CoASH)本身是高度极性的分子，由与4-磷酸泛酸(4-phosphopantethenic acid)(维生素B5)连接并因此与巯基乙胺连接的腺苷3’，5’-二磷酸构成。游离SH基可以被酯化，这取决于CoA参与的过程。已经在细菌、动物和植物中阐明CoA合成的途径。在植物中，CoA前体4’ -磷酸泛酰半胱氨酸(PPC)至4’ -磷酸泛酰巯基乙胺的转化由黄素蛋白4’ -磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶(PPCDC 或 HAL3, Kupke 等 J.Biol.Chem.276，19190-19196，2001)催化。编码 HAL3 蛋白质的基因可以是一个小基因家族的部分:拟南芥(Arabidopsis)基因组包含2个同种型(AtHAL3a 和 AtHAL3b ；Esp`inoza-Ruiz 等 Plant J.20，529-539，1999)，在烟草中存在 3 种HAL3 基因(Yonamine 等 J.Exp.Bot.55，387-395，2004)，而在稻中 HAL3 是单拷贝基因。有人提出AtHAL3和其它HAL3蛋白质作为三聚体发挥作用，每个单体具有结合的黄素单核苷酸(FMN) (Albert等Structure8, 961-969，2000)。推测FMN辅因子在产生4’ -磷酸泛酰巯基乙胺的氧化还原反应中发挥作用。
[0015]然而HAL3蛋白质的分子功能没有得到充分阐述。HAL3蛋白质显示与涉及耐盐性的酵母SIS2蛋白质(Ferrando等，Mol.Cell.Biol.15,5470-5481)的同源性。异位表达HAL3的植物或植物细胞显示改进的盐、渗透压或锂胁迫耐受性(Espinoza-Ruiz等，1999 ；Yonamine等，2004)。报道称BY2细胞中的烟草HAL3a过量表达导致胞内脯氨酸含量增加，这可能对耐盐表型有贡献(Yonamine等，2004)。此外,过量表达AtHAL3a的拟南芥植物比野生型植物表现更快的生长速率(Espinoza-Ruiz等，1999)。证实AtHAL3b蛋白质与细胞周期蛋白⑶KBl:1相互作用(W000/36124)，因而推测AtHAL3b对于赋予植物盐胁迫耐受性并对于盐胁迫条件下增加植物生长速率有用。现已惊奇地发现优先增加编码HAL3多肽的核酸在扩展组织中表达产生了相对于对照植物而具有增加的产量的植物，其中所述产量增加与对照植物相比至少是10%。
[0016]转录因子
[0017]转录因子通常定义为与顺式调节元件(例如增强子，TATA盒)结合并且与RNA聚合酶结合下能够激活和/或抑制转录的蛋白质。拟南芥基因组编码至少1533种转录调节物，这占其估计基因总数的~5.9%(Riechmann等，2000 (Science第290卷，2105-2109))。
[0018]MADS15
[0019]MADS盒基因构成参与酵母、植物和动物发育的多个方面的真核转录调节物的大基因家族。MADS盒基因编码负责与其靶基因调节区中特定盒的DNA结合作用的强烈保守的MADS结构域。该基因家族可以划分成两个主要系，I型和II型。II型基因又名MIKC型蛋白质，指它们拥有的以下4个功能性结构域(图5，(Jack, Plant Mol.Biol.46，515-520，2001)):
[0020]用于DNA结合的MADSj^ 60个氨基酸(高度保守)，位于蛋白质的氨基末端；
[0021]间插结构域I (保守性较低)，参与MADS 二聚体的选择性形成；
[0022]角蛋白结构域K(很保守)，负责二聚化；
[0023]羧基端区C (序列和长度可变)，参与转录激活或参与形成多聚转录因子复合体。
[0024]已经在拟南芥中鉴定超过100个MADS盒基因，并且已经将它们以系统发生方式归类成12种进化枝，每种进化枝具有与MADS共有序列的特定偏离(Thiessen等J Mol.Evol.43，484-516，1996).0sMADS15 属于 SQUA 进化枝(就 SQUAMOSA 而言，其来自金鱼草(Antirrhinum majus))。参考由Coen和Meyerowitz在1991年提出的ABC花器官身份特化模型(Nature353，31-7)而将SQUA进化枝的基因归类为A功能器官身份基因。除OsMADS15之外，稻0sMADS14、0sMADS18和0sMADS20也是SQUA进化枝的部分。
[0025]SQUA进化枝在双子叶植物被细分成2个亚组，即APl和FUL亚进化枝(在其中OsMADS15聚簇)。这些亚进化枝基本上在它们各自蛋白质的羧基端处的特定氨基酸基序上是趋异的(Litt和Irish, Geneticsl65, 821-833，2003)。除了存在特定的APl氨基酸基序之外，双子叶植物APl进化枝相关性 蛋白质通常在其羧基端包含法尼基化基序(这个基序是CAAX，其中C是半胱氨酸，A通常是脂族氨基酸并且X是甲硫氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸或丙氨酸)。在单子叶植物中，SQUA进化枝蛋白质被细分成两个主要的组，其可以基于该蛋白质最后15个氨基酸范围内的保守羧基端基序区分:LPPWMLS (例如0sMADS15、SEQID NO: 117)和LPPWMLR(例如0sMADS18)。与SQUA进化枝的双子叶植物序列相反，SQUA进化枝的单子叶植物序列在其羧基端没有法尼基化基序。
[0026]推测0sMADS15与其它蛋白质复合发挥作用以控制器官形成。然而，迄今没有鉴定到具有可见表型的突变体；除在W001/14559(EP1209232，US6，995，302)中提供的数据之外，没有提供涉及0sMADS15的异位表达或下调表达的实验数据。在本公开中，以有义方向表达OsMADS15的转基因荞麦(Fagopyrum esculentum)植物显示增加的分枝,而表达反义构建体的转基因植物具有减少的生长和受抑制的分枝。用有义构建体转化的大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana)在根周围存在叶发育,这被视为分枝增加的指标。作者声称就花发育和这些花的结构而言没有观察到变化。0sMADS15在拟南芥中的直向同源物是无APETALAI (API)。APl的异位表达导致开花时间减少，并且APl突变体显示延迟的开花并具有异常花。
[0027]PLT
[0028]AP2(apetala2)/ERF(乙烯应答性应答元件结合因子)家族包含了具有至少一个高度保守性DNA结合结构域-AP2结构域的转录因子。AP2结构域最初在APETALA2 (AP2)(一种参与发育程序如分生组织身份调节和花器官特化的拟南芥蛋白质(Jofuku等，(1994)Plant Cell6，1211 - 1225))中描述。将AP2/ERF蛋白质基于它们是否含有一个(ERF亚家族)或2个(AP2亚家族)DNA结合结构域而划分成亚家族(图12)。已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中鉴定到超过 140 种 AP2/ERF 基因(Reichmann 等(2000)Science290:2105-2110)，其中高达 18 种 AP2/ERF 基因属于 AP2 亚家族(Kim 等(2006)MolBio Evol23(l):107-120)。
[0029]已经证实由Plethoral(PLTl)和Plethora2 (PLT2)基因(统称为PLT基因)编码的两种拟南芥AP2亚家族转录因子多肽对于干细胞特别在根分生组织中的特化及维持是必需的。在RT-PCR分析中，PLT转录物主要在根内检测到，表明PLT表达与根身份密切相关。在拟南芥胚内的异位性PLT表达诱导顶端域同源异型转换成根干细胞、根或下胚轴(Aida 等(2004)Cellll9:109-120)。
[0030]美国专利申请2004/0045049和国际专利申请W003/013227提供了编码拟南芥PLTl转录因子(在该申请中称作G1793)的核酸序列。与野生型对照相比，报道称G1793 (使用CaMV35S启动子)在拟南芥中的过量表达导致子叶形态改变、植物整体尺寸轻微减少和瘦花序(可能具有异常花)。G1793过量表达者比对照植物产生更多的种子油。提供了编码潜在的大豆(Glycine max)直向同源物、稻(Oryza sativa)直向同源物和玉蜀黍(Zeamays)直向同源物的核酸序列。
[0031]国际专利申请W003/002751提供了编码PLT多肽的大豆核酸序列，其与通过基因概括分析(由DNA微阵列)鉴定的玉米核酸序列具有序列相似性。
[0032]国际专利申请W005/075655提供与拟南芥PLT基因具有序列相似性的稻及玉蜀黍核酸序列。
[0033]bHLH
[0034]碱性/螺旋-环-螺`旋(bHLH)蛋白质是作为二聚体与特定DNA靶位点结合并且已经在非植物性真核生物中充分表征为多种生物学过程中重要调节成分的转录因子超家族。bHLH家族的区别性特征是由大约60个氨基酸构成的二分结构域。这种二分结构域由与共有的六核苷酸E盒相结合的DNA结合基本区域和与由可变环区隔开的两个α -螺旋构成。所述两个α-螺旋促进二聚化，允许不同家族成员间形成同二聚体和异二聚体。尽管bHLH结构域是进化保守的，然而除这个结构域之外，进化枝之间存在很少序列相似性。
[0035]Bailey 等，2003 (The Plant Cell,第 15 卷，2497-2501)报道在拟南芥中检测到的bHLH基因总数是162种，这使得bHLH基因成为拟南芥中最大的转录因子家族；报道称稻基因组含有 131 种 bHLH 基因(Buck 和 Atchley, 2003 (J.Mol.E 第 56 卷:742-750))。Heim等，2003 (Mol.Biol.E第20卷(5):735-747)从拟南芥中基于结构相似性鉴定了 bHLH基因的12个亚家族。
[0036]报道称已经表征的来自植物的bHLH蛋白质在花色素苷生物合成、植物光敏素信号作用、球蛋白表达、果实开裂、心皮及表皮发育中有作用(Buck和Atchley，2003)。
[0037]SPL
[0038]鳞部启动子结合蛋白样(SPL)转录因子多肽是共有长度约80个氨基酸残基的高度保守性DNA结合结构域(DBD)的结构多样的蛋白质(Klein等(1996)Mol GenGenet259:7-16 ；Cardon 等(1999) Gene237:91-104)。靶基因启动子内的 SPL 转录因子 DNA共有序列结合位点是5’ -TNCGTACAA-3’，其中N代表任意碱基。在SPL DBD内部存在10个保守的半胱氨酸(Cys)或组氨酸(His)残基(见图23)，其中8个残基是结合对于SPL特异性锌指三级结构形成所必需的2个锌离子的锌配位残基(Yamasaki等(2004) J MolBiol337:49-63)。SPL DBD内的第二个保守性特征是二分核定位信号。在DBD之外，在整个植物界内大多数编码SPL转录因子多肽的核酸序列中找到一个微RNA(miRNA)靶基序(miR156)(在编码区中或在 3’ UTR) (Rhoades 等(2002)Cellll0:513_520)。miRNA 通过引导编码SPL的mRNA降解或通过翻译抑制以转录后方式调控SPL基因表达。
[0039]Riechmann 等(Science290:2105-2109，2000)报道了拟南芥中的 16 种 SPL 转录因子多肽，它们自身之间的序列相似性很低(除了前述特征之外)，推导的SPL多肽的大小是131-927个氨基酸。不过，在这种植物的SPL家族中检测到共有更高序列同源性的SPL转录因子多肽对(Cardon等(1999))。
[0040]已经证实迄今表征的SPL转录因子多肽(仅存在于植物中)在植物发育、尤其在花发育中发挥作用。报道称过量表达SPL3转录因子多肽的转基因植物开花更早(Cardon等(1997)Plant J12:367-377)。
[0041]在欧洲专利申请EP1033405中，提供了 SPL15转录因子多肽的核酸序列和推导的多肽序列。
[0042]在国际专利申请W003013227中，提供了核酸序列(和推导的多肽序列；内部参考号G2346)，其编码SPL15转录因子多肽的部分，然而距离SPL15转录因子的羧基末端38个氨基酸。组成型过量表达修饰的SPL15转录因子(或G2346)多肽的转基因拟南芥植物具有轻微扩大的子叶。在发育晚期，报道称这种植物没有显示与对照植物一致的差异。
[0043]发明简述
[0044]现已惊奇地发现优先增加编码HAL3多肽的核酸在扩张组织中表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的早期萌发势和增加的种子产量的植物，其中种子产量增加与对照植物相比至少是10%。
[0045]根据本发明的另一个实施方案，提供相对于对照植物增强产量相关性状、尤其增加植物早期萌发势和增加植物的种子产量的方法，其包括优先增加编码HAL3多肽的核酸在植物扩张组织中的表达。
[0046]现已惊奇地发现调节编码MADS15多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的产量的植物。
[0047]根据一个实施方案，提供相对于对照植物增加植物产量的方法，其包括增加编码MADS15多肽的核酸在植物中表达。增加的产量包含增加的营养性生物量，但不包含增加的
种子产量。
[0048]根据另一个实施方案，本发明提供相对于对照植物增加植物产量的方法，包括降低内源性MADS15多肽的水平和/或活性。增加的产量包含更高的种子产量，但不包含增加的营养性生物量。
[0049]现已惊奇地发现增加编码PLT转录因子多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的产量的植物。
[0050]根据又一个实施方案，提供相对于对照植物增加植物产量的方法，包括增加编码PLT转录因子多肽的核酸在植物中的表达。
[0051]现已惊奇地发现调节编码特定类别的bHLH转录因子的核酸在植物中的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。适于增强植物中产量相关性状的特定类的bHLH转录因子在下文详细描述。
[0052]根据又一个实施方案，本发明提供相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节编码特定类的bHLH转录因子的核酸在植物中的表达。
[0053]现已惊奇地发现增加编码SPL15转录因子多肽的核酸在植物中的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的产量的植物。
[0054]根据又一个实施方案，本发明提供相对于对照植物增加植物中产量的方法，包括增加编码SPL15转录因子多肽的核酸在植物中的表达。
[0055]定义
[0056]多肽/蛋白质
[0057]术语“ 多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式中的
氨基酸。
[0058]多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0059]术语〃多核苷酸〃、〃核酸序列〃、〃核苷酸序列〃、“核酸”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。
[0060]对照植物
[0061]选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。
[0062]同源物
[0063]蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸置换、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。
[0064]缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
[0065]插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的导入。插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG? _表位、IacZ, CMP (钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
[0066]置换指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋结构或折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸置换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸置换优选地是保守性氨基酸置换。保守性置换表是本领域众所周知的(见例如 Creighton (1984) Proteins.W.H.Freeman and Company 和下表 I)。
[0067]表1:保守性氨基酸置换的实例
[0068]
【权利要求】
1.用于在植物中相对于合适的对照植物而言增加产量或增强产量相关性状的方法，包括: (a)在植物中增加编码SPL15转录因子多肽的核酸的表达，和任选地选择具有增加的产量的植物；或 (b)调节、优选地增加编码MADS15蛋白质的核酸在植物中的表达；或 (c)优先降低内源性MADS15基因在所述植物中的表达；或 (d)调节植物中编码bHLH转录因子的核酸的表达，其中所述bHLH转录因子由SEQIDN0213、SEQ ID N0215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID N0225、SEQ ID NO:297、SEQID NO:299, SEQ ID NO: 301的任一种或前述任一种的直向同源物或旁系同源物代表；或 (e)增加编码PLT转录因子多肽的核酸在植物中的表达，和任选地选择具有增加的产量的植物；或 (f)用于相对于对照植物而言增加植物中非生物胁迫抗性的方法，优选地其中所述增加的非生物胁迫抗性是增加的营养摄取效率，包括增加编码PLT转录因子多肽的核酸在植物中的表达，和任选地选择具有增加的非生物胁迫抗性的植物；或 (g)优先增加编码HAL3多肽的核酸在植物苗中的表达，和任选地选择具有增加的产量的植物。
2.根据权利要求1(b)的 方法，其中所述MADS15蛋白质包含任何一种或多种以下基序:SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 ;或 其中权利要求1(c)中定义的所述MADS15蛋白质包含任何一种或多种以下基序:SEQID NO:114， SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:117。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述受调节的或增加的表达是通过导入遗传修饰，优选地在权利要求1中定义的核酸的基因座内导入遗传修饰来实现。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述受调节的或增加的表达或所述遗传修饰是通过T-DNA激活标签、TILLING、位点定向诱变、定向进化或同源重组中的任何一种或多种来实现。
5.根据权利要求1(c)的方法，其中所述降低的表达是通过RNA介导的基因表达下调来实现，优选地其中所述RNA介导的下调是通过共抑制或通过使用反义MADS15核酸序列来实现；或 其中所述降低的表达使用MADS15基因或其片段的反向重复序列实现，所述反向重复序列优选地能够形成发夹结构；或 其中所述降低的表达使用对MADS15核酸有特异性的核酶实现；或 其中所述降低的表达是通过插入诱变来实现。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述受调节的或增加的表达是通过在植物中导入和表达编码SPL15转录因子多肽的核酸来实现；或 其中所述受调节的或增加的表达是通过在植物中导入和表达编码MADS15蛋白质的核酸来实现，且其中所述MADS15蛋白质的氨基酸序列包含任何一种或多种以下基序:SEQ IDNO:48，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 ;或 其中所述受调节的或增加的表达是通过在植物、植物部分或植物细胞中导入和表达编码PLT转录因子多肽的核酸来实现；或其中所述受调节的或增加的表达是通过在植物中导入和表达编码bHLH转录因子的核酸来实现，其中所述 bHLH 转录因子由 SEQ ID NO 213、SEQ ID N0215、SEQ ID NO: 217、SEQID NO:219、SEQ ID N0225、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:301 的任一种或前述SEQ ID NO任一种的直向同源物或旁系同源物代表；或 其中所述受调节的或增加的表达是通过在植物中导入和表达编码HAL3多肽的核酸来实现。
7.根据权利要求6的方法，其中所述编码SPL15转录因子的核酸是在表N中给出的任何一种核酸SEQ ID NO或其部分，或是能够与在表N中给出的任何一种核酸SEQ ID NO杂交的序列；或 其中所述编码MADS15蛋白质的核酸是在表D中给出的任何一种核酸SEQ ID NO或其部分，或是能够与在表D中给出的任何一种核酸SEQ ID NO杂交的序列，优选地其中所述编码MADS15蛋白质的核酸是根据SEQ ID NO: 75或其部分，或是能够与SEQ ID NO: 75或其部分杂交的序列或是与SEQ ID NO:75具有至少90%，91%，92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的序列同一性的序列；或 其中所述编码PLT转录因子的核酸是在表1中给出的任何一种核酸SEQ ID NO或其部分或是能够与在表1中给出的任何一种核酸SEQ ID NO杂交的序列；或 其中所述核酸是根据SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214,SEQ ID NO:216,SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:226 和 SEQ ID NO:228, SEQID NO:296,SEQ ID NO:298,SEQ ID NO:300的任一种核酸序列的部分或等位变体或剪接变体或能够与根据 SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 218、SEQ IDNO:220,SEQ ID NO:222,S EQ ID NO:224,SEQ ID NO:226和SEQ ID NO:228,SEQ ID NO:296,SEQ ID NO:298,SEQ ID N0:300的任一种的核酸序列杂交的序列，其中所述部分、等位变体、剪接变体或杂交序列编码bHLH转录因子；或 其中所述编码HAL3蛋白质的核酸由在表A中给出的任何一种核酸SEQ ID NO或其部分，或能够与在表A中给出的任何一种核酸SEQ ID NO杂交的序列代表。
8.根据权利要求6或7的方法，其中所述编码SPL15转录因子的核酸编码在表N中给出的任一核酸SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物；或 其中所述编码MADS15蛋白质的核酸编码在表D中给出的任一核酸SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物；或 其中所述编码PLT转录因子的核酸编码在表D中给出的任一核酸SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物；或 其中所述编码HAL3蛋白质的核酸编码在表A中给出的任一核酸SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物。
9.根据权利要求1(c)、2和5任一项的方法，其中所述内源性MADS15基因是植物中以其天然形式发现的MADS15基因或是随后导入植物的分离的MADS15核酸，优选地其中所述导入的MADS15核酸有效连接至组成型启动子，优选地有效连接至GOS2启动子；和/或优选地其中所述导入的MADS15核酸是来自植物来源或人工来源，优选地其中用与内源性MADS15基因同源的MADS15核酸转化植物，更优选地其中来自单子叶植物的MADS15核酸序列用于转化单子叶植物，还更优选地其中来自禾本科的MADS15序列用于转化至禾本科植物内，最优选地其中来自稻的MADS15核酸序列用于转化稻植物；和/或优选地其中所述来自稻的MADS15核酸序列包含SEQ ID NO: 109 (OsMADS15)的足够长度的基本上连续的核苷酸，或包含编码OsMADS15 (SEQ ID NO: 110)的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的足够长度基本上连续的核苷酸；和/或优选地其中0sMADS15的所述直向同源物或旁系同源物由 SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 155、SEQID NO: 157、SEQ ID NO: 159 和 SEQ ID NO: 161 代表；和 / 或优选地其中编码 OsMADS15 (SEQID NO: 110)的直向同源物或旁系同源物的核酸序列的所述基本上连续的核苷酸是来自由SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO: 156、SEQ ID NO: 158和SEQ ID NO: 160所代表的核酸序列的基本上连续的核苷酸。
10.根据权利要求1(a)、3、4和6至8任一项的方法，其中所述增加的产量是增加的种子产量，优选地其中所述增加的种子产量是下列一种或多种:a)增加的地上部分生物量；b)增加的每株植物花数；c)增加的种子产量；d)增加的(饱满)种子数；e)增加的千粒重(TKff);和f)增加的收获指数；或 根据权利要求1 (b)、3、4和6至8任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是根生物量；或 根据权利要求1 (c)、2、5和9任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包含增加的产量，优选地增加的种子产量和/或增加的生物量，优选地其中所述增加的种子产量选自以下一种或多种:a)增加的种子生物量(种子重量)；b)增加的每株植物花数；和c)增加的(饱满)种子数；或 根据权利要求1(e)或(f)、3、4和6至8任一项的方法，其中所述增加的产量是增加的种子产量，优选 地其中所述种子产量选自以下一种或多种:a)增加的种子生物量；b)增加的每株植物花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率；e)增加的收获指数；f)增加的千粒重(TKW) ；g)增加的种子面积；h)增加的种子长度；和i)增加的种子宽度；或 根据权利要求1 (d)、3、4和6至8任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状是早期萌发势；或 根据权利要求1 (g)、3、4和6至8任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包含增加的产量和/或早期萌发势，优选地其中所述增加的产量是增加的种子产量，进一步优选地其中所述增加的种子产量是以下一种或多种:a)增加的种子生物量；b)增加的收获指数；和c)增加的(饱满)种子数；和/或优选地其中所述种子产量的增加是相对于对照植物增加至少10%。
11.根据权利要求1至10任一项的方法，其中权利要求1(a)中定义的所述核酸有效连接至组成型启动子，优选地有效连接至HMGB (高速泳动族B)启动子或G0S2启动子，进一步优选地有效连接至稻HMGB启动子或稻G0S2启动子；或 其中权利要求1 (b)，(d)，(e)或(f)中定义的所述核酸有效连接至组成型启动子，优选地有效连接至G0S2启动子；或 其中权利要求1(g)中定义的编码HAL3蛋白质的所述核酸有效连接至苗特异性启动子，优选地有效连接至β扩展蛋白启动子。
12.根据权利要求1至11任一项的方法，其中所述编码SPL15转录因子多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，最优选来自拟南芥；或其中所述编码MADS15蛋白质的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻；或 其中所述编码PLT转录因子多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，还优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥；或 其中所述编码bHLH转录因子的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选来自稻；或 其中所述编码HAL3蛋白质的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，还优选来自十字花科植物，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。
13.通过根据权利要求1至12任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码SPL15转录因子的重组核酸；或 其中所述植物或其部分包含编码MADS15蛋白质的重组核酸；或 其中所述植物或其部分包含编码PLT转录因子多肽的核酸，所述核酸有效连接至组成型启动子；或 其中所述植物或其部分包含编码bHLH转录因子的核酸；或 其中所述植物或其部分包含编码HAL3多肽的重组核酸；或 通过根据权利要求1 (c)、2、5、9和10任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含重组的MADS15核酸。
14.分离的多肽，其包含: (i)由SEQID NO:297,SEQ ID NO:299和SEQ ID NO:301的任一种所代表的氨基酸序列； (ii)氨基酸序列，其(a)以递增优选顺序与由SEQID NO:297, SEQ ID NO:299和SEQID NO:301代表的任何一种氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，和(b)具有bHLH结构域； (iii)在以上(i)或(ii)中给出的任一氨基酸序列的衍生物。
15.分离的核酸分子，其包含: (i)由SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:298 和 SEQ ID NO:300 的任一种所代表的核酸; (ii)由SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:298 和 SEQ ID NO:300 的任一种所代表的核酸的互补序列； (iii)编码bHLH转录因子的核酸，所述bHLH转录因子(a)以递增优选的顺序与由SEQID NO:297, SEQ ID NO:299和SEQ ID NO:301的任何一种所代表的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一1注，并具有(b) bHLH结构域。
16.构建体，其包含: (a)编码SPL15转录因子多肽的核酸；或 (b)编码MADS15蛋白质的核酸，其中所述MADS15蛋白质的氨基酸序列包含任何一种或多种以下基序:SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51 ;或 (c)编码PLT转录因子多肽的核酸；或 (d)编码bHLH转录因子的核酸，所述bHLH转录因子由SEQID N0213、SEQ ID N0215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID N0225、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:299、SEQ IDNO: 301的任一种或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物代表；或 (e)编码HAL3多肽的核酸；或 (f)能够使内源性MADS15基因沉默的MADS15核酸；和 -能够驱动所述核酸序列表达的一种或多种调控序列，其中能够驱动编码HAL3多肽的核酸表达的所述一种或多种调控序列优先在植物的苗组织中驱动所述表达；和任选地 -转录终止序列。
17.根据权利要求16的构建体，其中能够驱动编码SPL15的核酸序列表达的所述一种或多种调控序列至少是组成型启动子，优选地是HMGB启动子或GOS2启动子；或 其中能够驱动(b)、(C)、(d)或(f)的核酸序列表达的所述一种或多种调控序列至少是组成型启动子，优选地是GOS2启动子；或 其中能够驱动(e)的核酸序列表达的所述一种或多种调控序列至少是苗特异性启动子，优选是β扩展蛋白启动子。
18.根据权利要求16(a)或17的构建体的用途，用于产生相对于对照植物具有增加的产量的植物；或 根据权利要求16(b)或17的构建体的用途，用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的根产量的植物；或 根据权利要求16(c)或17的构建体的用途，用于产生相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的种子产量和/或增加的非生物胁迫抗性的植物；或 根据权利要求16(d)或17的构建体的用途，用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增强的早期萌发势的植物；或 根据权利要求16(e)或17的构建体的用途，用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状，优选地用于增加产量和/或萌发势，优选地其中所述产量是增加的种子产量和/或其中所述萌发势是早期萌发势；或 根据权利要求16(f)或17的构建体的用途，用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的种子产量和/或生物量的植物。
19.用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物的方法，所述方法包括: a)导入并在植物细胞中表达编码SPL15转录因子多肽的核酸；或 b)导入并在植物中表达编码MADS15蛋白质的核酸，其中所述MADS15蛋白质的氨基酸序列包含任何一种或多种以下基序:SEQ ID N0:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ IDNO:51 ;或 c)用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增加的产量和/或增加的非生物胁迫抗性，其中所述方法包括导入并在植物细胞中表达编码PLT转录因子多肽的核酸；或 d)导入并在植物中表达编码bHLH转录因子的核酸，其中所述bHLH转录因子由SEQIDN0213、SEQ ID N0215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID N0225、SEQ ID NO:297、SEQID NO: 299,SEQ ID NO: 301的任一种或前述SEQ ID NO任一种的直向同源物或旁系同源物代表；或 e)导入并优先增加编码HAL3多肽的核酸在植物的苗组织中的表达；或 f)导入并在植物中表达能够使内源性MADS15基因沉默的MADS15核酸；和在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
20.用根据权利要求16或17的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞；或 相对于对照植物具有增加的产量的转基因植物，所述增加的产量因编码SPL15转录因子的核酸的增加的表达而产生；或 相对于对照植物具有增加的产量的转基因植物，所述增加的产量因编码MADS15蛋白质的核酸的增加的表达而产生，其中所述MADS15蛋白质的氨基酸序列包含任何一种或多种以下基序:SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO: 50,SEQ ID NO: 51，或来自所述转基因植物的转基因植物细胞；或 相对于对照植物具有增加的产量和/或增加的非生物胁迫抗性的转基因植物或来自所述转基因植物的植物细胞，所述增加的产量和/或增加的非生物胁迫抗性由编码PLT转录因子多肽的核酸的增加的表达产生；或 相对于对照植物具有增加的产量的转基因植物，或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述增加的产量由编码bHLH转录因子的核酸的增加的表达产生，其中所述bHLH转录因子由 SEQ ID N0213、SEQ ID N0215、SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID N0225、SEQID NO:297,SEQ ID NO:299,SEQ ID NO:301 的任一种或任一前述 SEQ ID NO 的直向同源物或旁系同源物代表；或 相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物，所述增强的产量相关性状由于优先增加HAL3多肽在苗中的表达而产生；或 相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述增强的产量相关性状因编码MADS15蛋白质的核酸的降低的表达而引起，其中所述MADS15蛋白质的氨基酸序列包含任何一种或多种以下基序:SEQ ID NO: 114,SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117。
21.根据权利要求13或20的转基因植物，或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
22.根据权利要求13、20或21任一项的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是种子或根和/或来自所述植物和/或来自植物的所述可收获部分的产物。
23.编码SPL15转录因子多肽的核酸的用途，用于相对于对照植物而言在植物中增加产量，优选地其中所述增加的产量是增加的种子产量；或 编码MADS15蛋白质的核酸在植物中增强产量相关性状的用途，优选地其中所述增强的产量相关性状是相对于对照植物增加的根生物量，其中所述MADS15蛋白质的氨基酸序列包含任何一种或多种以下基序:SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50, SEQ IDNO:51 ;或 编码PLT转录因子多肽的核酸的用途，或PLT转录因子多肽的用途，用于相对于对照植物增加非生物胁迫抗性和/或用于提高植物产量、尤其种子产量；或 编码bHLH转录因子的核酸增强植物中产量相关性状的用途，其中所述bHLH转录因子由 SEQ ID N0213、SEQ ID N0215、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:219、SEQ ID N0225、SEQ IDNO:297, SEQ ID NO:299, SEQ ID NO:301的任一种或任一前述SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物代表，优 选地其中所述增强的产量相关性状是早期萌发势；或编码HAL3多肽的核酸用于增强植物中产量相关性状的用途，其中所述核酸有效连接至苗特异性启动子，优选地其中所述产量相关性状包含种子产量和/或早期萌发势；或MADS15核酸用于增强植物中产量相关性状的用途，其中所述核酸编码的所述MADS15蛋白质的氨基酸序列包含任何一种或多种以下基序:SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQID NO: 116、SEQ ID N`O: 117，优选地其中所述增强的产量相关性状包含增加的种子产量。
【文档编号】C12N15/29GK103773796SQ201410044170
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2007年3月30日 优先权日:2006年3月31日
【发明者】V·弗兰卡德, C·勒佐, A·I·桑兹莫林纳罗 申请人:巴斯福植物科学有限公司