植物内生蒙塔腔菌及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种盐生根系内生蒙塔腔菌（Montagnulaceae?sp.）菌株及其用途，属于生物【技术领域】。具体而言，本发明公开了一种真菌菌株，该菌株为蒙塔腔菌（Montagnulaceae?sp.）（菌株编号：JP-ROOT-44），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日：2014年1月13号，保藏号：CGMCC?No.8756。该菌株能用于促进植物的生长和/或提高其耐盐性能。
【专利说明】植物内生蒙塔腔菌及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种盐生根系内生蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)菌株及其用途,属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]植物内生真菌(Endophytic fungi)是一类可定植在根、莖、叶、花、种子等各种组织器官，但并不引起宿主明显的病症的真菌类群。内生真菌诸多生物学特性都区别于菌根真菌、根瘤固氮菌和弗兰克氏菌。根系内生真菌是植物根系微生物类群的重要组成部分，在某些环境中(如盐胁迫、干旱等)根系内生真菌可能比菌根真菌或其他微生物扮演着更加重要的生物学功能。自2007年美国领衔实施植物微生物组计划(Plant Microbiome Project)以来，科学家一致认为:一个植株不是单个生命体，而是“植物-共生菌”的超级生物体。共生菌对宿主植物的一系列性状(生长、适逆和发育等)起到了关键调控作用；特定植物环境中有益微生物种群的遗传多样性能够扩展宿主的生态适应性，从而协同植物形成更强的适逆能力。
[0003]我国盐碱地面积约有14亿多亩，广泛分布于西北内陆和滨海地区；多数盐溃土还与荒漠干旱区相邻或镶嵌。这种极端环境不仅制约了农业对土地资源的利用，而且造成植被不断退化。生理育种和分子改良技术在创制新的耐旱耐盐林木种质资源方面发挥了重要作用。然而由于植物抗逆性状由多个数量性状基因(QTL)控制，导致传统的育种方式进展缓慢；抗逆型转基因苗木也难以适应复杂胁迫环境，在生产实践中尚不能推广应用。
[0004]Rodriguez等(2 009)认为有两类内生真菌参与调控植物的非生物胁迫反应:
[0005]I) Class 2 内生菌:
[0006]主要特征:全局性侵染模式；宿主范围较广；垂直或水平传播。华盛顿大学Rodriguez教授研究团队从生长在地热土壤的植物(Dichanthelium Ianuginosum)中分离到一种内生管突弯孢霉(Curvularia protuberata),该菌可以定殖在根、莖和叶片组织；接种试验表明植物-内生真菌的共生关系使得彼此可以生长在高达65°C的环境中。该成果发表在Science杂志(Redman et al.，2002)。随后，该研究小组从沿海植物-滨麦(Leymusmollis)中分离到一株内生黄色镰刀菌(Fusarium culmorum),该菌株能提高多种植物的耐盐性能(Rodriguez and Redman, 2008)。利用这种“共生基因感化”(symbiogenic,symbio=symbiosis ；genic=gene influence)策略，使这些特殊生境下的内生真菌可以帮助植物适应由于气候变化可能导致的干旱、盐度增加和气温升高等恶劣环境，对提高农作物的产量(如水稻等)意义重大(Redman et al., 2011;Woodward et al.，2012)。由Rodriguez教授创建的Symbiogenics公司已经对Class 2内生菌进行商业化投产(www.adaptivesymbiotictechno1gies.com)。美国农业部(USDA)Lucero 博士利用显微技术、培养和高通量测序等方法发现在两种旱生小灌木的叶片和根部都发现有大量内生菌存在，而且在植物细胞表面会形成类似微生物膜(microbial biofilm)的结构；组织培养证实这些内生菌依然可以与宿主愈伤组织紧密结合(Lucero et al.，2011)。这种内生菌-愈伤组织复合体还可以和多种非宿主植物建立共生关系，并提高其生长活力和抗逆性(Barrow etal.，2008; Lucero et al.，2008)。这种内生真菌生物技术可能与传统的抗逆育种和转基因培育技术并驾齐驱(Barrow et al.，2008),应用前景十分广阔。目前国内已有的林木微生物肥料还局限于菌根真菌、固氮菌等营养型接种剂，而专用于协同植物抗逆的微生物资源和菌剂研发还鲜见报道，缺乏系统研究，与国际同类研究相比差距较大。
[0007]2)、Class 4内生菌。主要特征:局限在根系分布；宿主范围较广；水平传播。暗色有隔内生菌(DSEs, dark septate endophytes)是Class 4类群的主要代表。DSEs通常在宿主根部皮层细胞形成“微菌核”结构(miciOslerotia)(刘茂军等2009)微菌核”及其暗色菌丝含有的黑色素活性物质具有很强的耐受性，这对植物适应逆境可能是至关重要的(Zhang et al., 2008;Li et al., 2011;Zhan et al.，2011)。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是提供一种源于盐生植物(盐地碱蓬)根系内生真菌，该菌株能用于促进植物的生长并提高其耐盐性能。
[0009]为了解决上述技术问题，本发明一种真菌菌株:该菌株为蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)(菌株编号:JP-R00T-44),保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是:中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日:2014年I月13号，保藏号:CGMCC N0.8756。
[0010]作为本发明的真菌菌株的改进，该菌株JP-R00T-44属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota,座囊菌纲Dothideomycetes,格抱腔目Pleosporales,蒙塔腔菌科Montagnulaceae。
[0011]本发明还同时提供了上述真菌菌株的用途:能用于促进植物的生长和/或提高其耐盐性能。
·[0012]备注说明:促进植物的生长表现在促进植株增高、或促进植株生物量。
[0013]作为本发明的真菌菌株的用途的改进:所述植物为水稻或黄瓜。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0015]图1为菌株JP-R00T-44的培养特征图。A:在PDA培养基培养10天；B:在PDA培养基培养3周；C:在1.5%MEA培养3周。
[0016]图2为基于LSU基因构建的菌株JP-R00T-44的系统发育树。
[0017]图3为根系接种菌株JP-R00T-44后对水稻耐盐性的影响对比图。EF group:未接种水稻；EI group:接种菌株JP-R00T-44的水稻。
[0018]图4为盐胁迫下接种菌株JP-R00T-44后对水稻生物量的影响对比图；
[0019]图5为菌株JP-R00T-44菌丝在水稻根系部位的定植及侵染结构图。A:菌丝(H)在侵染水稻根系表面(RR) ；B:菌丝在根系皮层细胞形成的“类菌核”(S)结构。
[0020]图6为在非盐胁迫培养、氮源为甘氨酸(Gly)条件下菌株JP-R00T-44对水稻生长的影响图。
[0021]上图为处理与对照组水稻幼苗在共培养基上生长情况；[0022]下图为从上述培养基上取出处理与对照组水稻幼苗后的对比情况。
[0023]图7为在非盐胁迫、氮源为甘氨酸(Gly)条件下接种菌株JP_R00T_44对水稻生物量和株高的影响对比图。
[0024]图8为在非盐胁迫、氮源为硝酸钠(NaN03)、缬氨酸(Val)培养条件下接种菌株JP-R00T-44对黄瓜幼苗的生长影响。
[0025]图9为在非盐胁迫、氮源为硝酸钠(NaN03)、缬氨酸(Val)培养条件下接种菌株JP-R00T-44对黄瓜幼苗鲜重的影响。EF:对照组(不接菌)；E1:处理组(接菌)。
[0026]a-a表示在统计学意义上差异不显著；a_b表示在统计学意义上差异显著。
[0027]图10为不同温度、盐浓度和pH值条件下对菌株JP-R00T-44生长的影响。
【具体实施方式】
[0028]为对本发明进行更好的说明，结合附图举例如下:
[0029]实施例1、菌株JP-R00T-44的分离培养
[0030]1、菌株分离培养基:
[0031]I)、先制备 1.5%麦芽粉琼脂培养基(malt extract agar，MEA):15g麦芽粉(Oxoid公司)，琼脂粉20g，1000ml蒸馏水；高温灭菌(为常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121°C下灭菌 20min)。
[0032]2)、随后在 上述1.5%麦芽粉琼脂培养基中加入硫酸链霉素(sti^ptomycinsulfate)和盐酸四环素(tetracycline hydrochloride)使其终浓度分别为50mg/L和20mg/L，用于抑制细菌生长；得菌株分离培养基。
[0033]2、培养菌株的马铃薯葡萄糖固体培养基(potato dextrose agar, PDA):
[0034]马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，1000ml蒸馏水；高温灭菌(为常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121°C下灭菌20min)。
[0035]3、PDB 培养基:
[0036]马铃薯200g，葡萄糖20g，1000ml蒸馏水；高温灭菌(为常规的高温灭菌，一般为在
1.1个大气压，121°C下灭菌20min)。
[0037]4、在本实验中，按下列条件分离培养，即可获得本发明所描述的蒙塔腔菌:
[0038]从山东东营沿海采集在滩涂生长的盐地碱蓬(Suaeda salsa)，将根系用自来水冲洗干净，去除土壤颗粒及杂物。首先在75%酒精(V/V)浸泡40秒，再在1% (质量％)次氯酸钠(NaClO)溶液中消毒10分钟，随后置入95% (V/V)酒精漂洗30秒，最后用无菌水清洗3次以上。用无菌剪刀将根系切成0.5cm长的根段，置入菌株分离培养基，25°C黑暗培养。培养至第5天，从组织切口边缘处长出内生真菌菌丝，用接种针小心将其挑出后转接到新鲜PDA培养基上纯化培养并记录菌株编号。
[0039]所述纯化培养为:用接种针切取菌落边缘少许菌丝转移至新鲜PDA培养基，重复上述操作3-4次；符合菌落颜色、形态匀一的作为下述实施例2所用的菌株。
[0040]所得的菌株进行了保藏:该菌株为蒙塔腔菌(Montagnulaceae sp.)(菌株编号:JP-R00T-44)，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是:中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路I号院3号。保藏日:2014年I月13号，保藏号:CGMCC N0.8756。[0041]实施例2、菌株JP-R00T-44的分子生物学鉴定
[0042]I)、基因组DNA提取
[0043]将菌株接种在JP-R00T-44在PDA平板上25°C黑暗培养一周。用接种针挑取少量菌丝块于1.5ml无菌离心管中，放入直径Imm和5mm的钢珠各5粒，在液氮中浸泡I分钟，随后在JXFSTPRP冷冻研磨机(上海净信科技有限公司)上充分研磨样品。使用DN41-真菌基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)进行提取基因组DNA。加入400 μ I API和4μ1 RNaseA(10mg/ml)，漩涡振荡。随后在65°C水浴孵育20分钟，充分裂解样本。加入130 μ I ΑΡ2，充分混匀，在冰浴上放置5分钟。HOOOrpm离心8分钟，小心吸取上清液到一个新的1.5ml无菌离心管中，加入1.5倍体积的AP3/E，用枪头进行吹打混匀得到混合液，先加650 μ I混合液加入一个吸附柱AC中(吸附柱放在收集管中)，13000rpm离心40秒，倒掉收集管中的废液，重复上述步骤直至加完所有混合液。在吸附柱中加入600 μ I漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃废液。将吸附柱AC重新放回收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去残留的漂洗液。取出吸附柱AC放入新的1.5ml无菌离心管中，在吸附膜的中间部位加入100 μ I洗脱缓冲液ΕΒ，室温放置5分钟，12000rpm离心I分钟，即获得DNA样品，在_20°C保存备用。
[0044]2)、PCR 扩增
[0045]对菌株JP-R00T-44的核糖体28S大亚基(LSU)、核糖体转录间隔区(ITS)、RNA聚合酶次大亚基基因(RPB2)和翻译延长因子1-α (tefl-α )等用于真菌系统发育和分子鉴定的基因序列进行测定。菌株JP-R00T-44的ITS\LSU\R0PB2\TEF基因的PCR扩增引物及反应体系见表1和表2。四个基因的PCR扩增反应条件为:94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，55°C退火40秒，72°C延伸50秒(LSU\RPB2\TEF基因的延伸时间为90秒)，35次循环；最后72°C延伸10分钟。
[0046]表1、PCR扩增弓丨物·名称及序列
[0047]
【权利要求】
1.真菌菌株，其特征是:该菌株为蒙塔腔菌(Montagnulaceaesp.)(菌株编号:JP-R00T-44)，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日:2014年I月13号，保藏号:CGMCC N0.8756。
2.根据权利要求1所述的真菌菌株的用途，其特征是:用于促进植物的生长和/或提高其耐盐性能。
3.根据权利要求2所述的真菌菌株的用`途，其特征`是:所述植物为水稻或黄瓜。
【文档编号】C12R1/645GK103849571SQ201410045895
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年2月10日 优先权日:2014年2月10日
【发明者】袁志林, 孙海菁 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所