一种水稻基因OsRem1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及一种水稻OsRem1及其应用。水稻基因OsRem1，该基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示，其编码的水稻remorine蛋白，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明公开了水稻Remorin蛋白基因OsRem1及其所编码的蛋白质。水稻Remorin蛋白基因OsRem1为水稻中首次报道，基因芯片和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导，转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此有望可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。
【专利说明】一种水稻基因OsRemI及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种水稻OsReml及其应用。
【背景技术】
[0002]Remorin蛋白是植物特异性的一类蛋白，主要存在于细胞质膜且主要存在于月旨後上(Jarsch KI et al., 2011Jarsch KI, Ott T.Perspectives on RemorinProteins, Membrane Rafts, and Their Role During)。目前还没有具体的证据证明remorin蛋白的确切功能，拟南芥中单个remorin基因的抑制表达对植株的表型没有明显的影响，全部敲除remorin基因对植物是致死的，说明remorin蛋白在植物中有重要的功能(程彦伟等，2009程彦伟，韩建明，徐晓燕等.植物Remorin蛋白的研究进展.河南工业大学学报(自然科学版).2009，30 (4):88-92)。在拟南芥中remorin蛋白受伤害(Reymond P et al., 2000Reymond P, Weber H, Damond M, et al.Differentialgene expression in response to mechanical wounding and insect feeding inArabidopsis.Plant Cell, 2000，12:707-720.)、渗透、寒冷(Kreps JA et al., 2002KrepsJA, Wu Y, Chang HS, et al.Transcritome changes for arabidopsis in response tosalt, osmotic, and cold stress.Plant Physiology, 2002，130 (4): 2129-2141 )、干旱、ABA (Bray EA et al., 2002Bray EA.Abscisic acid regulation of gene expressionduring water-deficit stress in the era of the Arabidopsis genome.Plant CellEnviron, 2002，25:153-161)的诱导;在水稻中受盐(Malakshah SN et al.，2007MalakshahSN, Rezaei MH, Heidary M, et al.Proteomics reveals new salt responsive proteinsassociated with rice plasma membrane.Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2007，1(9):2144-2154)、ABA、油菜素内酯(Lin F et al., 2003Lin F, Xu S L，NiWM，etal.1dentification of ABA-responsive genes in rice shoots via cDNA microarray.Cell Res, 2003，13(1):59-68)的诱导表达。在苜蓿`中remorin蛋白的过量表达可以抑制烟草花叶病毒对苜猜的侵染(Reymond P et al., 1996Reymond P, Kunz B, PaulpletzerK, et al.Cloning of a cDNA encoding a plasma membrane associated, uronide bindingphosphor protein with physical properties similar to viral movement proteins.The Plant Cell Online, 1996，8 (12): 2265-2276)。但是，水稻中 remorin 蛋白的功能还没有相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于公开水稻Remorin蛋白基因OsReml。
[0004]本发明的另一目的是提供基因OsReml的抗病性基因工程应用。
[0005]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0006]水稻基因OsReml，该基因的cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本发明所述的水稻基因OsReml编码的水稻remorine蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0008]含有所述的水稻基因OsReml的表达载体。
[0009]所述的表达载体优选将所述的水稻基因OsReml插入双元表达载体pCAMBIA1300S的Sac I和BamH I酶切位点所得。
[0010]本发明所述的水稻基因OsReml的基因工程应用。
[0011]本发明所述的水稻Remorin蛋白基因OsReml在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。
[0012]利用所述的水稻Remorin蛋白基因OsReml在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种，通常先利用本发明OsReml基因作为目的基因构建植物表达载体，再将含该基因的重组表达载体转化目标植物，最后经PCR，Southern杂交、RT - PCR验证后进行水稻的抗病性评价，最终获得转基因阳性植物。
[0013]利用本发明OsReml基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括具有抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β -葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
[0014]水稻Remorin蛋白基因OsReml的基因工程应用，优选包括如下步骤:
[0015]I)总RNA的提取选用水稻抗稻瘟病菌品种“黑壳子粳”(太湖流域粳稻地方品种)，待水稻幼苗长至3 -4叶期，用稻瘟病菌孢子(5 X IO4Hir1)接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80°C冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；
[0016]2)水稻Remorin蛋白基因OsReml的克隆分析黑壳子粳接种稻痕病前后的蛋白质组学结果发现remorin蛋白受到稻瘟病菌接种的明显诱导(未发表的数据)。以拟南芥基因OsReml序列为探针序列，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到555bp水稻Remorin蛋白基因OsReml的全长序列，并设计两端引物Pl和P2:
[0017]Pl:5 - CAGATAGCTTCTTTGGCTGAGTT - 3 (SEQ ID N0.3),
[0018]P2:5 - AGAAGAGATTCAACCGAAGAGC - 3 (SEQ ID N0.4)
[0019]将步骤I)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链并以此为模板，以Pl和P2为引物，用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下:94°C预变性5分钟，94 °C变性45s，56 °C复性Imin，72°C延伸1.5min, 35个循环后，72°C延伸5min，最后Tag酶72°C保温IOmin末端加A后克隆至pGEM -T载体，委托上海英骏公司测序获得Remorin蛋白基因OsReml的cDNA序列 SEQ ID N0.1 ；
[0020]3)植物表达载体的构建根据水稻Remorin蛋白基因OsReml的cDNA序列SEQ IDN0.1，设计扩增出完 整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上均引入限制性内切酶位点Sac I和BamH I，P3和P4引物序列为:
[0021]P3:5 - AAGAGCTCATAGCTTCTTTGGCTG - 3 (SEQ ID N0.5),
[0022]P4:5 - AAGGATCCGCACACACATTTACA - 3 (SEQ ID N0.6)[0023]以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，以P3和P4为引物，经PCR扩增后，将OsReml的cDNA克隆至中间载体pGEM -T，利用引入的限制性内切酶位点Sac I和BamH I进一步将OsReml克隆到双元表达载体pCAMBIA1300S上，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；
[0024]4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体PCAMBIA1300S转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT -PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3 - 4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。
[0025]有益效果
[0026]1、本发明公开了水稻Remorin蛋白基因OsReml及其所编码的蛋白质。水稻Remorin蛋白基因OsReml为水稻中首次报道，基因芯片和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导，转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此有望可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。
[0027]2、本发明的OsReml基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。
[0028]3、对获 得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT - PCR验证后进行水稻的抗病性评价。将生长至3 -4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的平均病级数为3.8级，发病叶片平均病斑数目为8.1个，而对照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为20.4个(图1 )，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1、T2代转基因植株(#3，#7和#8)与未转基因对照(WT)相比抗性显著增强。
【具体实施方式】
[0030]实施例1
[0031]I)总RNA的提取选用水稻品种“黑壳子粳”(为太湖流域粳稻地方品种，为抗稻瘟病菌品种)，待水稻幼苗长至3 - 4叶期后，用稻瘟病菌孢子进行接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于_80°C冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的
1.5mL EP管(TRIzol Reagents,购自Invitrogen, USA),充分振荡后，抽提总RNA,电泳鉴定总RNA质量。
[0032]2)水稻Remorin蛋白基因OsReml的克隆分析黑壳子粳接种稻瘟病前后的蛋白质组学结果发现remorin蛋白受到稻瘟病菌接种的明显诱导(未发表的数据)。以拟南芥基因OsReml序列为探针序列，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到555bp水稻Remorin蛋白基因OsReml的全长序列，并设计两端引物Pl和P2:
[0033]Pl:5 - CAGATAGCTTCTTTGGCTGAGTT - 3 (SEQ ID N0.3)，
[0034]P2:5 - AGAAGAGATTCAACCGAAGAGC - 3 (SEQ ID N0.4),[0035]以步骤I)获得的总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，以Pl和P2为引物，用高保真Pfu酶(购自Roche)进行PCR扩增，PCR程序如下:94°C预变性5分钟，94°C变性45s，56°C复性lmin, 72°C延伸1.5min, 35个循环后，72°C延伸5min,最后Tag酶(购自天根公司，北京)72°C保温IOmin末端加A后克隆至pGEM - T载体(购自Promega),委托上海英骏公司测序获得水稻转录因子蛋白基因OsReml的cDNA序列。
[0036]分析上述获得的水稻Remorin蛋白基因OsReml的cDNA序列SEQ ID N0.1及其编码蛋白 SEQ ID N0.2。
[0037]实施例2
[0038]用实施例1中设计的引物P1、P2进行半定量RT - PCR分析接种处理后水稻3 - 4叶期地上部幼苗的表达，结果表明，接种稻瘟病菌孢子4小时后OsReml的表达增强，经灰度扫描分析，其mRNA表达量为接种处理前的30倍，表明OsReml基因的表达与稻瘟病菌处理有关。
[0039]实验例3
[0040]根据实施例1得到的OsReml的cDNA全长序列(见SEQ ID N0.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上均引入限制性内切酶位点Sac I和BamH I，P3和P4引物序列为:
[0041]P3:5 - AAGAGCTCATAGCTTCTTTGGCTG - 3 (SEQ ID N0.5),
[0042]P4:5 - AAGGATCCGCACACACATTTACA - 3 (SEQ ID N0.6),`[0043]以实施例1中获得的扩增产物为模板，以P3和P4为引物，经PCR扩增后，将OsReml的cDNA克隆至中间载体pGEM - T，利用引入的限制性内切酶位点Sac I和BamH I进一步将OsReml克隆到双元表达载体pCAMBIA1300S上，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，再将其转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”(太湖流域粳稻地方品种)，转基因植株经PCR, Southern杂交以及RT - PCR验证为阳性。
[0044]将生长至3 -4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，按照Mackilland Bonman (1992Mackill D and Bonman J(1992)Inheritance of blast resistance innear -1sogenic lines of rice.Phytopathology82:746 -749)的方法进行病害级别鉴定，7天后调查植株的平均病级数为3.8级，发病叶片平均病斑数目为8.1个，而对照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为20.4个(图1 )，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。
[0045]综上所述，本发明人提供的OsReml基因是在水稻中分离的新基因，其功能与水稻抗病性相关，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。可利用本发明OsReml基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B -葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
【权利要求】
1.水稻基因OsReml，其特征在于该基因的cDNA序列如SEQID N0.1所示。
2.权利要求1所述的水稻基因OsReml编码的水稻remorine蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.含有权利要求1所述的水稻基因OsReml的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将所述的水稻基因OsReml插入双元表达载体pCAMBIA1300S的Sac I和BamH I酶切位点所得。
5.权利要求1所述的水稻基因OsReml的基因工程应用。
6.权利要求1所述的水稻基因OsReml在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于包括如下步骤: 1)总RNA的提取 选用水稻抗稻瘟病品种“黑壳子粳”，待水稻幼苗长至3 - 4叶期，用稻瘟病菌孢子5X IO4Hir1接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻；取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量； 2)水稻基因OsReml的克隆 以拟南芥基因OsReml序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到555bp水稻Remorin蛋白基因OsReml的全长序列，并设计两端引物Pl: SEQ ID N0.3和P2:SEQ ID N0.4;将步骤I)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，末端加A后克隆至pGEM - T载体，测序获得水稻基因OsReml的cDNA序列 SEQ ID N0.1 ； 3)植物表达载体的构建 根据水稻OsReml基因的cDNA序列SEQ ID N0.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制性内切酶位点Sac I和BamH I，P3和P4引物序列分别为:SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6 ； 以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsReml的cDNA克隆至中间载体pGEM -T，利用引入的限制性内切酶位点Sac I和BamH I进一步将OsReml克隆到双元表达载体PCAMBIA1300S，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确； 4)转基因植株的获得 将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1300S转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，转基因植株经PCR，Southern杂交以及RT - PCR验证为阳性。将生长至3 - 4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。
【文档编号】C12N15/82GK103805612SQ201410045840
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月8日 优先权日:2014年2月8日
【发明者】鲍永美, 张红生, 王建飞, 李猛, 张贺, 黄骥, 王州飞 申请人:南京农业大学