鞘氨醇单胞菌株xp及其在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物菌种【技术领域】，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌株xp，其分类命名为Sphingomonas?sp.，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC?No：M?2011453。本发明还给出了该鞘氨醇单胞菌菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，降解效果好。
【专利说明】鞘氨醇单胞菌株XP及其在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用
[0001]【技术领域】
本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌株XP及其在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用。
【背景技术】
[0002]鞘氨醇单胞菌在环境中分布极广泛，而且对恶劣环境有很强的忍耐性(如极地、强辐射等极端环境中都曾发现了鞘氨醇单胞菌的存在)。鞘氨醇单胞菌的降解底物范围广，如对二噁英类、酚类、偶氮染料等芳香化合物以及异型生物质聚合体等的降解都有相关报道。由于鞘氨醇单胞菌对芳香化合物有极为广泛的代谢能力，并且该菌属某些菌种能够合成有价值的胞外生物高聚物，因此，近年来鞘氨醇单胞菌成为被关注和研究的热点。
[0003]烟草多酚是在烟株叶和茎两个主要部位合成的带有一个或多个羟基的芳香环化合物，其在烟草中的含量较高，约为干叶重量的0.5 — 2.5%。在烟草中发现的多酚类化合物包括单宁类(绿原酸的异构体、咖啡酸和奎尼酸)、香豆素类(莨菪亭和莨菪亭的糖苷衍生物)、黄酮类(芳香苷、黄酮、鼠李糖、黄酮醇)和花色素类(花色素-3-芸香糖苷、花葵素-3-芸香苷、堪非醇)四大类共约135种。其中绿原酸和芸香苷是烟草中最主要的多酚类物质，绿原酸占多酚类物质总量的75— 95%。多酚是烟叶中的重要香气前体物，多酚含量与烘烤后的烟叶颜色和卷烟香气密切相关。在吸烟过程中，多酚及其热解产物转移到烟气中，对烟气香味有直接影响。在合理的调制、陈化条件下，植物多酚类化合物经一系列反应降解生成多种物质，这些降解产物能赋予烟草制品优雅的香气，增加烟草制品的香气量，对改善烟草制品的品质有极其重要的作用。
[0004]烟草中的多酚化合物含量对烟草品质有着重大影响。在一定范围内，多酚化合物含量与烟叶品质呈正相关。这是因为在调制、`醇化和燃烧过程中，多酚类化合物可氧化分解生成一些能赋予烟草制品优雅清香气味和增加烟草制品香气量的化合物，因此它们对改善烟草制品的品质有着重要作用。然而，多酚类化合物含量超出一定范围时，烟叶不同程度带有多种品质缺陷，如:有青杂气和刺激性、香气质单调、香气量不足等，不能直接用来生产卷烟。更为重要的是，过量的多酚化合物对人体有毒性，会影响吸烟者的健康。因此，如何降低烟草中多酚类化合物的含量是烟草工业中的重要环节。现有研究表明微生物技术在降解烟草多酚化合物过程中发挥重要作用。因此，目前极需要开发出在低温低湿条件下能较好发挥多酚类化合物降解效果的微生物菌株。
[0005]
【发明内容】
本发明目的在于提供一种鞘氨醇单胞菌株xp，将其用于降解烟草制品中的多酚类化合物方面，降解效果好。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种鞘氨醇单胞菌株XP，其分类命名为sp.xp,该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为=CCTCC No:M 2011453，保藏日期:2011年12月9日，保藏单位地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号(武汉大学)。
[0007]所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用。
[0008]所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，具体为:将鞘氨醇单胞菌株XP用LB培养基复苏(30°C培养24h)，然后接种到含有绿原酸或烟草浸提液的无机盐培养基中，28 - 32°C培养2 — 24 h后离心收集菌体，无机盐培养基清洗I 一5次后，用无机盐培养基重悬菌体，调整至OD6tltl值为2.0 — 5.0，所得悬浮液即为种子培养液；将种子培养液在28 - 32°C、湿度55 - 65%条件下均匀喷洒于烟草制品上。
[0009]具体的，所述含有绿原酸或烟草浸提液的无机盐培养基中，绿原酸浓度为0.2 -
1.0g/L,烟草浸提液浓度为0.05-0.2 ml/L。绿原酸或烟草浸提液用以作为鞘氨醇单胞菌株xp生长的唯一碳源。本发明所述鞘氨醇单胞菌xp在绿原酸添加量为0.2 — 1.0g/L的无机盐培养基中培养时生长情况良好，更高浓度的绿原酸能抑制鞘氨醇单胞菌xp的生长。
[0010]所述烟草浸提液可经下述方法获得:取Ig烤烟叶片，粉碎后加入55 - 65% (体积百分比)乙醇于45 — 55°C水浴萃取30 — 60min (每10 min摇匀一次),萃取结束后过滤，滤液即为烟草浸提液。
[0011]较好的，所述无机盐培养基的配方为:每1000ml去离子水中含2.44g Na2HPO4,
1.52g ΚΗ2Ρ04、0.5g (NH4)2SO4^0.2g MgSO4.7Η20、0.05g CaCl2.2Η20和 IOml 微量金属盐溶液SL-4 ;其中，所述微量金属盐溶液SL-4组成为:1000ml去离子水中含有0.50g EDTA、0.20gFeSO4.7Η20和100ml微量金属盐溶液SL_6 ;所述微量金属盐溶液SL-6组成为:1000ml去离子水中含有 0.1Og ZnSO4.7Η20、0.03g MnCl2.4Η20、0.30g Η3Β03、0.20g CoCl2.6Η20、0.01gCuCl2.2Η20、0.02g NiCl2.6Η20 和 0.03g Na2MoO4.2H20。
[0012]本发明中，所述的烟草制品可以为新鲜采摘或经烘烤、晾晒、发酵的不同品种、产地的全株烟草(Nicotiana tabacum),或者以烟草为原料经切制、研磨、提取或再造制成的烟丝、烟末、烟块、烟片或烟膏等。
[0013]其中，所述烟草制品优选为烤烟叶片。
[0014]本发明所提供的菌株鞘氨醇单胞菌株xp (Sphingomonas sp.)在无机盐培养基中利用绿原酸或烟草浸提液为唯一碳源生长后，能够降解烤烟叶片中的多酚类化合物。在利用鞘氨醇单胞菌XP (Sphingomonas sp.)喷洒于烟草制品上,一周后烟草制品中的多酹类化合物含量降解率超过25%。目前所利用的醇化方法中，所需的醇化时间较长，往往会影响产品的周期。本发明与现有的醇化方法相比，具有快速降解的优点，这对于烤烟生产醇化过程中的实际应用更具优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是基于微生 物菌株xp 16S rRNA基因序列构建的系统发育树；
图2是鞘氨醇单胞菌菌株xp在含绿原酸的无机盐培养基中48h的生长情况；
图3是菌浓度为0D3.0时，鞘氨醇单胞菌菌株xp在含不同绿原酸的无机盐培养基中对绿原酸的降解情况。
【具体实施方式】
[0016](一)鞘氨醇单胞菌{Sphingomonassp.)菌株xp的筛选:由于绿原酸是烟草中最具代表性的多酚类物质，本申请以绿原酸作为底物，制作成琼脂平板。在30°C、24hr的条件下使用烟田土壤水溶液进行涂板培养，平板培养物经过4°C的低温处理24 - 72hr后，通过荧光倒置显微观察细菌对绿原酸的分解效果。由于绿原酸在紫外光(365nm)下显蓝色荧光，具有绿原酸分解能力的菌落周围的培养基比背景中的荧光变淡变弱。在绿原酸的蓝色荧光背景中，能直接分离不受杂菌污染的菌株。根据绿原酸酶的活性和透明圈直径的关系测定不同菌株产生的绿原酸酶活力。在pH值4.0 — 6.0的琼脂平板上进行筛选培养，即可得到耐酸性菌株xp。
[0017](二)鞘氨醇单胞菌{Sphingomonas sp.)菌株xp的鉴定:
筛选得到的菌株XP为革兰氏阴性菌，无孢子，以单侧生极性鞭毛运动，呈黄色。委托中国典型培养物保藏中心对其进行生理生化特性鉴定，结果见表1和表2，其16S rRNA基因序列比对结果见表3，构建的系统发育树数据见附图1。
【权利要求】
1.一种鞘氨醇单胞菌株XP，其分类命名为sp..xp,该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为=CCTCC No:M 2011453。
2.权利要求1所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用。
3.如权利要求2所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，将鞘氨醇单胞菌株XP用LB培养基复苏，然后接种到含有绿原酸或烟草浸提液的无机盐培养基中，28 - 32°C培养2 — 24 h后离心收集菌体，无机盐培养基清洗I 一 5次后，用无机盐培养基重悬菌体，调整至OD_值为2.0 — 5.0，所得悬浮液即为种子培养液；将种子培养液在28 - 32°C、湿度55 - 65%条件下均匀喷洒于烟草制品上。
4.如权利要求3所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述含有绿原酸或烟草浸提液的无机盐培养基中，绿原酸浓度为0.2 — 1.0g/L，烟草浸提液浓度为0.05 - 0.2 ml/L。
5.如权利要求4所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述烟草浸提液经下述方法获得:取Ig烤烟叶片，粉碎后加入55 - 65%乙醇10 - 30ml于45 — 55°C水浴萃取30 — 60min，萃取结束后过滤，滤液即为烟草浸提液。
6.如权利要求3所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述无机盐培养基的配方为:每1000ml去离子水中含2.44g Na2HPO4U.52gΚΗ2Ρ04、0.5g (NH4)2SO4^0.2g MgSO4.7Η20、0.05g CaCl2.2H20 和 IOml 微量金属盐溶液SL-4 ;其中，所述微量金属盐溶液SL-4组成为:1000ml去离子水中含有0.50g EDTA、0.20gFeSO4.7Η20和100ml微量金属盐溶液SL_6 ;所述微量金属盐溶液SL-6组成为:1000ml去离子水中含有 0.1Og ZnSO4.7Η20、0.03g MnCl2.4Η20、0.30g Η3Β03、0.20g CoCl2.6Η20、0.01gCuCl2.2Η20、0.02g NiCl2.6Η20 和 0.03g Na2MoO4.2H20。
7.如权利要求2至6任一所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特 征在于，所述烟草制品为新鲜采摘或经烘烤、晾晒、发酵的全株烟草，或者以烟草为原料经切制、研磨、提取或再造制成的烟丝、烟末、烟块、烟片或烟膏。
8.如权利要求7所述鞘氨醇单胞菌株xp在降解烟草制品中多酚类化合物方面的应用，其特征在于，所述烟草制品为烤烟叶片。
【文档编号】C12R1/01GK103756943SQ201410047536
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年2月11日 优先权日:2014年2月11日
【发明者】马宇平, 周浩, 戴建国, 苏东赢, 王墨染, 唐鸿志 申请人:河南中烟工业有限责任公司