一种复合微生物发酵剂的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种复合微生物发酵剂的制备及应用，其特征是：从自然发酵酸菜的发酵液中分离出植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌和肠膜明串珠菌，以及德巴利汉逊酵母作为发酵剂生产菌种，各自单独生产发酵剂，并达到活菌数≥109个/ml，然后将不同菌种各自制成冷冻干燥粉末，按照植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母的质量比为2~3∶2~3∶1~2∶1~2∶1~2的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。该复合微生物发酵剂应用在发酵蔬菜制品上，能避免杂菌、有害菌的生长，可提高发酵蔬菜制品的质量；同时采用酵母菌和乳酸菌复合微生物发酵剂与单一菌种发酵剂相比能够产生更多的风味物质，使口味更加接近以传统自然发酵蔬菜制品；实现生产可控性和现代化生产。
【专利说明】一种复合微生物发酵剂的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品加工领域，涉及一种复合微生物发酵剂的制备方法及在发酵蔬菜 制品中的应用。
【背景技术】
[0002]自然发酵蔬菜制品是将新鲜的大白菜、白萝卜、黄瓜、芥菜等用盐水在容器中腌制 一段时间后形成的。由于微生物的发酵作用，产生了独特的风味和口感，至今仍深受广大北 方地区居民的喜爱。
[0003]虽然，目前自然发酵蔬菜制品仍占据着发酵蔬菜制品消费的主流，但是由于其发 酵生产周期长，产品质量不稳定，发酵菌种的活性和比例容易发生变化，产品的安全性无法 保证，因此迫切需要加强其现代化工业生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种复合微生物发酵剂的制备方法，其所得的复合发酵剂 不仅可以实现发酵蔬菜制品的工业化生产，保证产品质量，而且生产的发酵蔬菜制品产品 其风味和口感与利用自然发酵方法制得到发酵蔬菜制品相近。另一目的是提供该复合微生 物发酵剂的应用。
[0005]本发明提供的复合微生物发酵剂的制备方法如下：
首先从自然发酵酸菜的发酵液中分离出植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌和肠膜 明串珠菌，以及德巴利汉逊酵母作为发酵剂生产菌种，各自单独生产发酵剂，并达到活菌数 ≥ 109 个 /ml ；
然后将不同菌种各自制成冷冻干燥粉末；
按照植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母的质量比 为2?3 ： 2^3 ： r2 ： r2 ： f 2的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。
[0006]本发明提供的上述复合微生物发酵剂在制备发酵蔬菜制品中的应用，其具体步骤 如下：
将挑选的蔬菜用清水洗净，层层摆放于发酵容器中，至容器体积的90%处，然后加入冷 却至2(T25°C的灭菌水，至刚覆盖蔬菜顶部；按照接种量为蔬菜重量的0. 15%。^0. 5%。加入 复合微生物发酵剂，并添加终浓度为0. 4^0. 6%。的Ca2+ ;2(T25°C密闭发酵72?120h，即得到 发酵蔬菜成品。
[0007]所述蔬菜为新鲜、无病害和霉烂的大白菜、白萝卜、黄瓜、芥菜中的至少一种。
[0008]本发明的积极效果：
选取从自然发酵的蔬菜制品中分离出的菌种，通过菌种的复配和添加量两方面的控 制，使有益微生物成为发酵过程中的优势菌群，可避免杂菌、有害菌的生长，提高发酵蔬菜 制品的质量；采用酵母菌和乳酸菌复合微生物发酵剂与单一菌种发酵剂相比能够产生更多 的风味物质，使口味相近于传统自然发酵蔬菜制品；实现生产可控性和现代化生产。【具体实施方式】
[0009]实施例1:
1.1培养基的制备
植物乳杆菌和清酒乳杆菌的培养基为MRS培养基，具体成分为:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温80 lmL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL, pH值为6.2~6.6，121°C蒸汽灭菌15min。
乳酸乳球菌和肠膜明串珠菌的培养基M17培养基，具体成分为:胰蛋白胨5g、鱼蛋白胨5g、牛肉膏5g、酵母浸膏2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、甘油10.0g、乳糖3g、磷酸氢二钾5g、蒸溜水1000mL,另加1%的葡萄糖。用NaOH调节pH值至6.7~7.1，121°C蒸汽灭菌15min。 [0010]德巴利汉逊酵母的培养基为PDA培养基，具体成分为:马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL,用10% (体积比)的灭菌酒石酸水溶液调pH值至3.5，121°C蒸汽灭菌15min。
[0011]1.2发酵蔬菜中单菌种的分离和纯化
以无菌操作采集自然发酵方法制备的酸菜制品的发酵液，进行梯度稀释至10_卜10_6，分别取0.5~ImL稀释的发酵液，涂布于MRS固体培养基、M17固体培养基和PDA固体培养基平板表面，在2(T25°C下培养48h ；
挑取PDA固体培养平板表面的酵母菌疑似单菌落，接种于PDA液体培养基中，2(T25°C下培养48h ；
挑取乳酸菌疑似单菌落，接种于MRS液体培养基中，2(T25°C下培养48h ；
然后进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的杆菌，接种于MRS液体培养基，将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的球菌，接种于M17液体培养基，2(T25°C下培养48h ;再分别将MRS液体培养基、M17液体培养基和PDA液体培养基中的菌种接种划线于MRS固体培养基、M17固体培养基和PDA固体培养基平板，2(T25°C下培养48h，确定是否为纯菌；
挑取单菌落，再分别接种于MRS、Ml7和PDA液体培养基，活化培养3代，最后接种于斜面培养基中，4°C保存，得到纯种的单菌种供试菌种。
[0012]上述自然发酵菜的制作方法如下:先将白菜在热水稍烫过后层层摆放在瓦缸中，每层撒少许盐，总盐量为蔬菜重量的1%~5%，放入缸中注满水，上面放重石挤压进行敞口或者封口腌制，在腌溃过程中，借助于天然附着在蔬菜表面的乳酸菌等微生物，在环境温度下进行发酵而成，时间一般为I个月。
[0013]1.3菌种的鉴定
将分离和纯化的乳酸菌和酵母菌分别通过16S rDNA V3区域和26S rDNA的D1/D2区域，进行序列测定和菌种鉴定，确定菌种的种属，从中选择植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母的菌株，进行下一步的筛选。
[0014]1.4酵母菌的筛选
初筛:将鉴定的德巴利汉逊酵母接菌到放有杜氏小管的YPD液体培养基中，2(T25°C下培养24h,每隔4h观察产气情况,筛选出产气量最多的菌株。YPD液体培养基的成分为:酵母膏10g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、蒸馏水lOOOmL，pH值为6.1~6.2，121°C蒸汽灭菌15min。
复筛:将初筛的菌株接菌到YPD液体培养基中，2(T25°C下培养24h，每隔4h测定其发酵液的可溶性固形物含量、PH值、酒精度和还原糖含量确定发酵特性最佳的菌株。
[0015]1.5乳酸菌的筛选
初筛:将鉴定的植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌和肠膜明串珠菌菌株分别接入到MRS和Ml7液体培养基中，2(T25°C下培养48h，每隔4h测定pH值和600nm下的OD值，筛选出产酸多和生长快的菌株。
[0016]复筛:将初筛的菌种接入到MRS和M17液体培养基中，2(T25°C下培养48h，每隔4h取一次发酵液样品，进行pH值、有机酸和还原糖的测定试验，筛选出发酵力强的菌株。
[0017]1.6冻干发酵剂的制备
将乳酸菌和酵母菌分别接入到5ml的MRS、M17和PDA液体培养基中，活化3代后，再以体积比为2%的接菌量将乳酸菌和酵母菌分别接入到300ml的MRS、M17和PDA液体培养基中，2(T25°C培养24h，作为母发酵剂。将母发酵剂按照上述方法利用发酵罐继续扩大培养，直至活菌数>IO9个/ml ；
在4°C，4000^5000 rpm转速下离心分离菌体，并用灭菌的0.75% (质量/体积)的生理盐水进行离心洗涤三次，最后 按照一定比例在菌体上添加冷冻保护剂，放入真空冷冻干燥机中，进行冻干，得到冻干菌粉，使其活菌数>109个/g。冷冻保护剂为灭菌的10% (质量/体积)脱脂乳粉，灭菌条件110°C下灭菌lOmin。
[0018]1.7发酵剂的复配
将植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母按照质量比为2: 2:1:1: 2的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。
[0019]1.8复合发酵剂在制备酸白菜中的应用，其具体步骤如下:
将挑选的新鲜、无病害和霉烂的白菜用清水洗净，层层摆放于发酵容器中，至容器体积的90%处，然后加入冷却至2(T25°C的灭菌水(100°C沸腾IOmin)至刚覆盖白菜顶部；按照接种量为白菜重量的0.15%。"0.5%。加入复合微生物发酵剂，并添加终浓度为0.4^0.6%。的Ca2+ ;2(T25°C密闭发酵72~120h，即得到发酵酸白菜成品。
[0020]实施例2:
按照实施例1中方法制备冻干发酵剂，复配如下:
将植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母按照质量比为2: 2:1:1:1的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。
[0021]复合发酵剂在制备酸白菜中的应用，其具体步骤如下:
将挑选的新鲜、无病害和霉烂的白菜用清水洗净，层层摆放于发酵容器中，至容器体积的90%处，然后加入冷却至2(T25°C的灭菌水(100°C沸腾30min)至刚覆盖白菜顶部；按照接种量为白菜重量的0.15%。"0.5%。加入复合微生物发酵剂，并添加终浓度为0.4^0.6%。的Ca2+ ;2(T25°C密闭发酵72~120h，即得到发酵酸白菜成品。
[0022]实施例3:
按照实施例1中方法制备冻干发酵剂，复配如下:
将植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母按照质量比为3: 3: 2: 2: 2的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。[0023]复合发酵剂在制备酸白菜中的应用，其具体步骤如下:
将挑选的新鲜、无病害和霉烂的白菜用清水洗净，层层摆放于发酵容器中，至容器体积的90%处，然后加入冷却至20~25°C的灭菌水(100°C沸腾IOmin)至刚覆盖白菜顶部；按照接种量为白菜重量的0.15%。"0.5%。加入复合微生物发酵剂，并添加终浓度为0.4~0.6%。的Ca2+ ;20~25°C密闭发酵72~120h，即得到发酵酸白菜成品。
[0024]实施例4:
按照实施例1中方法制备冻干发酵剂，复配如下:
将植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母按照质量比为2: 2:1:1: 2的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。
[0025]复合发酵剂在制备酸白萝卜中的应用，其具体步骤如下:
将挑选的新鲜、无病害和霉烂的白萝卜用清水洗净，层层摆放于发酵容器中，至容器体积的90%处，然后加入冷却至20~25°C的灭菌水(100°C沸腾IOmin)至刚覆盖白萝卜顶部；按照接种量为白萝卜重量的0.15%。、.5%。加入复合微生物发酵剂，并添加终浓度为
0.4~0.6%。的Ca2+ ;20~25°C密闭发酵72~120h，即得到发酵酸白萝卜成品。
[0026]实施例5:
按照实施例1中方法制备冻干发酵剂，复配如下:
将植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母按照质量比为2: 2:1:1: 2的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。
[0027]复合发酵剂在制备酸黄瓜中的应用，其具体步骤如下:
将挑选的新鲜、无病害和霉烂的黄瓜用清水洗净，层层摆放于发酵容器中，至容器体积的90%处，然后加入冷却至20~25°C的灭菌水(100°C沸腾IOmin)至刚覆盖黄瓜顶部；按照接种量为黄瓜重量的0.15%。~0.5%。加入复合微生物发酵剂，并添加终浓度为0.1~0.6%。的Ca2+ ;20~25°C密闭发酵72~120h，即得到发酵酸黄瓜成品。
[0028]实施例6:
按照实施例1中方法制备冻干发酵剂，复配如下:
将植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母按照质量比为2: 2:1:1: 2的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。
[0029]复合发酵剂在制备酸芥菜中的应用，其具体步骤如下:
将挑选的新鲜、无病害和霉烂的芥菜用清水洗净，层层摆放于发酵容器中，至容器体积的90%处，然后加入冷却至20~25°C的灭菌水(100°C沸腾IOmin)至刚覆盖芥菜顶部；按照接种量为芥菜重量的0.15%。~0.5%。加入复合微生物发酵剂，并添加终浓度为0.1~0.6%。的Ca2+ ;20~25°C密闭发酵72~120h，即得到发酵酸芥菜成品。
【权利要求】
1.一种复合微生物发酵剂的制备方法，其特征是步骤如下:从自然发酵菜的发酵液中分离出植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌和肠膜明串珠菌，以及德巴利汉逊酵母作为发酵剂生产菌种，各自单独生产发酵剂，并达到活菌数> IO9个/ml ;然后将不同菌种各自制成冷冻干燥粉末；按照植物乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌和德巴利汉逊酵母的质量比为疒3: 2^3: 1~2: 1~2:广2的比例，混合均匀，制备成复合微生物发酵剂。
2.如权利要求1所述的一种复合微生物发酵剂，其在制备发酵蔬菜制品中的应用，其特征是步骤如下:将挑选的蔬菜用清水洗净，层层摆放于发酵容器中，至容器体积的90%处，然后加入冷却至2(T25°C的灭菌水至刚覆盖蔬菜顶部；按照接种量为蔬菜重量的0.15%。^0.5%。加入复合微生物发酵剂，并添加终浓度为0.4^0.6%。的Ca2+ ;2(T25°C密闭发酵72~120h，即得到发酵蔬菜成品。
3.根据权利要求2所 述的复合微生物发酵剂在制备发酵蔬菜制品中的应用，其特征是:发酵蔬菜制品的 原料为新鲜、无病害和霉烂的大白菜、白萝卜、黄瓜和芥菜的至少一种。
【文档编号】C12N1/20GK103849585SQ201410050864
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】乌日娜, 伍俊瑞, 岳喜庆 申请人:沈阳农业大学