人参促生细菌fy4-2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了从大量人参内生细菌中筛选到一株具有产生长素、固氮、解磷、解钾和产铁载体特性，并对宿主人参生长具有促进功能的细菌菌株FY4-2。经鉴定为阿氏肠杆菌（Enterobacterasburiae）。它产IAA能力强，可达到13.5μg/mL，无氮条件下长势良好，具有固氮潜能，定量测定其解磷含量，可达到130.6μg/mL，解钾可达到4.33μg/mL，有产生铁载体的能力，其活性达92%。能促进人参种子发芽生长，芽长增加81.97%；对人参根生长具有明显的促进作用，鲜重增加40.5%，干重增加43.97%；该菌株的发现为人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。
【专利说明】人参促生细菌FY4-2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属微生物领域，确切地说是人参促生细菌FY4-2及其应用。
【背景技术】
[0002]近二十年来，伴随化肥和农药的大量使用，在满足作物高产防病的同时，所带来的土壤恶化、环境污染等问题也越来越严重。此外，随着石油能源的日趋匮乏，以石油为原料的化肥和农药生产成本日益提高，进而导致农业成本逐渐上升，效益日益下降。这些问题都对人类的生产生活构成了极大的威胁。发展新型肥料，应用生物防治是现代农业和未来农业的必然趋势。近年来，微生物菌肥具有对人畜安全、不污染环境等优点已受到人们的重视，开展了一些相关研究和应用。而发展微生物菌肥的前提是获得具有高效生物活性功能的有益微生物，例如具有促进植物生长的微生物，简称植物促生菌。植物促生菌促进植物生长的机理不尽相同，其可合成某些对作物生长发育有直接作用的物质和(或)改变土壤中某些无效元素的形态，使之有效化而利于作物吸收，作用途径包括分泌有机酸溶解磷并使之有效化；自生固氮；通过嗜铁素增加植物铁营养；产生植物激素，调节植物乙烯等。植物促生菌还具有抑制或减轻某些植物病害对作物生长发育和产量的不良影响，其间接作用途径包括产生抗生素抑制植物病原微生物；清除植物根围可供病原菌利用的铁；诱导植物系统获得抗性；合成抗真菌代谢物；与病原微生物争夺根围生存空间等。
[0003]人参是 我国最为重要的中药材之一，被称为“百草之王”。2012年，人参(人工种植)被国家卫生部批准为新资源食品，消费量和市场需求量极具增加。人参种植对土壤和环境条件要求较高，在我国主要集中在吉林省长白山地区。吉林省人参产量占全国80%、世界70%，出口占世界60%，是吉林省主要出口创汇的农产品。在有限的土地资源条件下，提高人参产量和品质是满足市场需求的基础，保护种植区生态环境是人参产业可持续发展的必要条件，减少化肥农药不合理使用所造成的品质下降、农药残留超标等问题是人参产品顺利出口的重要保障。因此，分离筛选获得具有促进植物生长的微生物并研制成菌肥加以应用对于发展人参产业具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了减少化肥的使用，而提供一种对人参生长具有促进功能的人参内生菌株，人参促生细菌FY4-2。
[0005]阿氏肠杆菌株FY4-2，保藏编号为CCTCC NO:M2013630。
[0006]阿氏肠杆菌株FY4-2，它来源于人参体内，为人参内生菌。
[0007]阿氏肠杆菌株FY4-2在促进人参发芽及生长方面的应用。
[0008]一种生物菌肥，它是阿氏肠杆菌株FY4-2菌体的无菌水悬浮液；
所述的菌体的无菌水悬浮液浓度为IO8-1O9 Cfu/mL。
[0009]本发明提供了从大量人参内生细菌中筛选到一株具有产生长素、固氮、解磷、解钾和产铁载体特性，并对宿主人参生长具有促进功能的细菌菌株FY4-2。经鉴定为阿氏肠杆菌{Enterobacter asburiae、。它产IAA能力强,可达到13.5Pg/mL,无氮条件下长势良好,具有固氮潜能，定量测定其解磷含量，可达到130.6 Pg/mL，解钾可达到4.33 Pg/mL，有产生铁载体的能力，其活性达92%。能促进人参种子发芽生长，芽长增加81.97% ;对人参根生长具有明显的促进作用，鲜重增加40.5%，干重增加43.97% ;该菌株的发现为人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1FY4-2菌株产生IAA图；
图2FY4-2菌株促生功能分析图；其中，1:固氮潜能，2:解磷特性，3:解钾特性，4:产体载体能力；
图3FY4-2菌株在NA培养基上的菌落形态；
图4FY4-2菌株电镜下观察的菌体形态；
图5FY4-2菌株的分子鉴定聚类图谱；
图6FY4-2菌株对人参种子发芽的促生作用图；
图7FY4-2菌株对人参种子发芽的促生作用结果；
图8FY4-2菌株对人参根的促生作用图；
图9FY4-2菌株对人参根鲜重的促生作用结果；
图10FY4-2菌株对人参根干重的促生作用结果。
【具体实施方式】
[0011]实施例一菌株FY4-2促生特性的测定
从来自于吉林省健康人参植株体内，采用平板稀释法筛选获得了人参内生细菌FY4-2。
[0012]1.产IAA能力的测定
将FY4-2接种到液体LB培养基中，30°C 160rpm培养12h。测定吸光值后将菌液在工作台操作下稀释到吸光值0.8左右。取0.2ml接种到含100mg/L色氨酸培养基中，培养48h后1000Orpm离心5min,取上清液2ml加入显色液4ml,暗处放置0.5h后在540nm下测定吸光值。共得到6株产IAA能力较高的菌株，其中FY4-2产IAA能力最高，可达到13.5μδ/mL (图1)。
[0013]2.固氮能力的测定
将FY4-2划线接种于Ashby固体培养基上，30°C恒温培养2d，观察菌株长势，结果发现菌株FY4-2在无氮条件下长势良好，具有固氮潜能(图2)。
[0014]3.人参内生解磷细菌的测定
采用PKO固体培养法，将分离于吉林省健康人参植株体内的内生细菌FY4-2接种在NA培养基上，培养12h后，打孔接种于PVK固体培养基，3d后观察解磷圈大小。然后将FY4-2菌株采用钥锑钪比色法进行解磷效果的检测，方法为将FY4-2菌株打菌碟接种于50mL LB液体培养基，160 r/min培养12h。取I mL接种于装有50 mL PVK液体培养基的150 mL三角瓶中，3 d后取培养液5mL，8000 r/min离心5min后取上清，钥锑钪比色法测量可溶性磷含量。结果显示，在PVK平板上，FY4-2菌株具有清晰可见的解磷圈(图2);定量测定其解磷含量，可达到130.6 Pg/mL。[0015]4.解钾能力的测定
初筛采用硅酸盐固体培养基，将在NA培养基上培养好的FY4-2菌块接种于硅酸盐固体培养基上，30°C培养3d后观察解钾圈大小。复筛采用火焰光度法，将FY4-2接种到液体LB培养基上，300C，160 rpm培养12h后测定吸光值。取2ml菌液接入50ml液体硅酸盐培养基中，30°C，160 rpm培养72h后，用火焰光度计定量测量解钾含量。结果显示，在硅酸盐平板上，FY4-2菌株具有明显的的解钾圈(图2);定量测定其解钾含量，可达到4.33 Pg/mL。
[0016]5.产铁载体能力的测定
采用刃天青法定性和定量测定FY4-2产铁载体能力。定性检测是将在NA培养基上培养好的FY4-2菌块接种到刃天青平板，28°C培养3天后观察蓝色培养基上橙黄色晕圈的出现和大小。定量检测是用钼金丝接种环取一环新鲜菌苔于MKB液体培养基内，28°C摇床培养(150 r/min) 48h后,取菌液10 ml,8000 rpm离心10 min,取上清3 ml到试管，再加入3ml刃天青检测液混匀，Ih后测量630nm下的吸光值(As)，以双蒸水为对照调零。另外，取3ml未接菌的MKB液体培养基与3ml刃天青检测液混匀后做同样处理，其吸光值为(Ar)。根据公式:铁载体活性单位％=[ (Ar — As) /Ar]X 100计算菌株产铁载体的量。结果FY4-2有产生铁载体的能力，其活性高达92% (图2)。
[0017]实施例二菌株FY4-2的鉴定
将FY4-2菌株划线接种在NA培养基上，28 °C培养12~24h后，观察记录单菌落形态。FY4-2在NA培养基上呈淡黄色不透明圆形小菌落，边缘整齐(图3)。
[0018]取在LB液体培养基中培养24h的FY4-2菌株菌液，离心用无菌水反复冲洗后，悬浮于适量无菌水中进行负染色制备样品，用镊子夹住带膜的铜网蘸取微量菌液，静置2min，从边缘用滤纸吸干剩余液；然后再用镊子夹住带菌的铜网浸入盛有双蒸水的烧杯内漂洗，再用滤纸吸干液体，接着用2%磷钨酸负染色5 min，干燥后用透射电镜观察发现菌体呈杆状，具有周生鞭毛(图4)。
[0019]参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基(表1)和方法测定FY4-2菌株的生理生化特性发现，菌株FY4-2为革兰氏染色阴性菌；接触酶、氧化酶、V-P反应为阳性；能利用柠檬酸、丙二酸，使硝酸盐还原；但不能使淀粉和油脂水解，可使明胶液化；石蕊牛奶试验产酸，对NaCl的耐受性为7% ;可以利用葡萄糖、甘露醇、半乳糖和果糖。
[0020]表1菌株FY4-2的生理生化特性
【权利要求】
1.阿氏肠杆菌株FY4-2，保藏编号为CCTCCNO:M2013630o
2.权利要求1所述的阿氏肠杆菌株FY4-2，它来源于人参体内，为人参内生菌。
3.权利要求1所述的阿氏肠杆菌株FY4-2在促进人参发芽及生长方面的应用。
4.一种生物菌肥，它是权利要求1所述的阿氏肠杆菌株FY4-2菌体的无菌水悬浮液； 根椐权利要求4所述的一种生物菌肥，其特征在于:所述的菌体的无菌水悬浮液浓度为108-1O9 cfu/mL。
【文档编号】C12R1/01GK103834591SQ201410055821
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】陈长卿, 李桐, 姜云, 田磊, 张冠军 申请人:吉林农业大学