一种牡丹sine类转录转座子序列的分离方法
【专利摘要】一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，先分离出牡丹SINE类反转录转座子的部分序列，根据其序列设计引物；以所设计引物进行PCR反应，得到生物素标记的探针；提取牡丹基因组后进行酶切，得到基因组酶切片段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后将酶切后的基因组片段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集；将生物素标记的探针与所得基因组片段杂交，筛选出目的片段；所得目的片段进行接头PCR，将反应产物进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。本发明提供的分离牡丹SINE类反转录转座子序列的方法，为开发基于牡丹SINE类反转录转座子的分子标记提供基础。
【专利说明】一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种转录转座子序列的分离方法，具体的说是一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法。
【背景技术】
[0002]牡丹是我国的传统名花，观赏栽培历史悠久，唐、明、清三朝牡丹皆为国花，身价之高，无与伦比，被尊为“花中之王”。时至今日，在我国冰天雪地的北方、风和日丽的江南，甚至在温暖炎热的南方，都能欣赏到牡丹，极具观赏价值。各地的牡丹展览、牡丹花会、牡丹书画、牡丹摄影等牡丹主题的活动带来很高的经济效益。对牡丹进行遗传多样性分析、构建核心种质、种植资源分类鉴定等方面得到广泛应用，并取得了显著成果，对加快牡丹育种、提闻育种效率具有重要意义。
[0003]反转录转座子是散布于基因组中的中度重复序列，由于它的的转座作用以及它与其LTR之间的同源重组导致的基因组的多样性，在真核生物基因组中反转录转座子是核DNA的主要组分(占核DNA量的50%，部分禾本科植物甚至达到80%)。非LTR类反转录转座子在植物基因组中广泛存在并扮演极其重要的角色，正越来越受到人们的关注。SINE类反转录转座子结构简单，短小且易于改造，具有很好的应用前景。其具有广泛存在、高拷贝数、高异质性，插入位点不可逆等特点，对基因组的大小、结构、功能和进化都具有重要的作用，近年来成为基因克隆、基因表达及其功能、生物多样性及系统发育进化研究的重要工具。由于以上特性，使植物的反转录转座子很容易作为一种分子标记，应用于遗传变异的研究中。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法，采用磁珠探针复合物的方法来分离SINE类反转录转座子序列，分离出的牡丹SINE类反转录转座子序列，为以后开发基于牡丹SINE类反转录转座子的分子标记提供基础。
[0005]本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法，其具体操作步骤为:
步骤一、牡丹SINE类反转录转座子的部分序列的分离:根据真核生物SINE类反转录转座子的保守序列Box A和Box B区域，以两个单引物分别进行PCR扩增，将两次PCR扩增出的产物，进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子的部分序列；
所用的两个单引物序列为:
引物 A 5’-TGGCCTAGTGG-3’ ；
引物 B 5’-GAGGAYTTG AACC-3’ ；
所述的用两个单引物进行PCR扩增的反应体系和反应程序分别为:
引物A的PCR反应体系为:在PCR 管中配制50 μ L的反应液II，其成分为:8 μ L的基因组DNA、6 μ L的含Mg2+的溶液、4 μ L的PCR缓冲液、2.5 μ L的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.4 μ L的Taq DNA聚合酶、2.5 μ L的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；A_PCR反应程序为:将配好的PCR反应液II放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性5 min ；94°C变性I min，43°C退火I min，72°C延伸2 min，进行34个循环；72°C终延伸8 min ；
引物B的PCR反应体系为:在PCR管中配制20 UL的反应液I，其成分为:8 yL的基因组DNA、5 μ L的含Mg2+的溶液、4 μ L的PCR缓冲液、2 μ L的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.4yL的Taq DNA聚合酶、2.5 μ L的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；B-PCR反应程序为:将配好的PCR反应液I放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性2 min ;94°C变性30 s，44°C退火45 s，72°C延伸I min，进行32个循环；72°C终延伸10 min。
[0006]步骤二、生物素标记的探针的制备:根据步骤一中所得到的牡丹SINE类反转录转座子的部分序列设计5’端生物素标记的探针引物，以质粒DNA为模板进行PCR，得到生物素标记的探针；具体操作步骤如下:
(1)根据步骤一中所得到的牡丹SINE类反转录转座子的部分序列，设计引物，引物序列(其基因序列如基因序列表序列3和序列4)为:
PTSBOl 5’-TAGTGGTGTCTAAGGATTTTGTGAG-3’ ；
PTSB02 5’-AATCCTGTTCAGCATTCCCGTA-3’ ；
其中PTSBOl进行5’端生物素标记；
(2)以引物PTSBOl和PTSB02进行PCR反应所用PCR反应体系为50μ L的反应液，其成分为:8 μ L的质粒DNA为模板、4 μ L的含Mg2+的溶液、4 μ L的PCR缓冲液、2 μ L的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.4 μ L的Taq DNA聚合酶、1.5 μ L的引物PTSBOl和PTSB02的混合物，余量为灭菌双蒸水；所用PCR反应程序为:将反应液放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性2 min;94°C变性30 s，55°C退火45 s，72°C延伸I min，进行32个循环；72°C终延伸10 min ;制得PCR产物，即为生物素标记的探针，备用。
[0007]步骤三、基因组片段富集库的制备:提取牡丹基因组DNA，然后以限制性内切酶BspU?,!进行基因组酶切，得到基因组酶切片段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后通过T4连接酶将酶切后的基因组片段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集，得基因组片段，备用；具体操作步骤为:
(1)提取牡丹基因组DNA，然后酶切基因组DNA;对所述牡丹基因组DNA进行酶切的方法为，在PCR管中加入8 μ L基因组DNA、20U的限制性内切酶Bspl431、2 μ L的酶切缓冲液，用灭菌双蒸水补足20 μ L ;置于37°C下酶切2h，回收400-200bp片段，溶于50 μ L灭菌双蒸水中；
(2)加接头
形成接头的两条寡聚核苷酸链(其基因序列如基因序列表序列5和序列6)，分别为: Adaptor 15’ -GTAATACGACTCACTATAGGGCCGAGGT-3’
Adaptor 2 3’ -CCCGGCTCCACTAG-5’
两条寡聚核苷酸链在终浓度为10 μ mo I的灭菌双蒸水中执行如下程序实现两条链的聚合形成接头:95°C 3 min，65°C 2 min, 45°C 2 min，25°C 1min，反应结束后于4°C保存。
[0008]将回收的基因组片段和双连接头，经T4连接酶连接，所用的连接体系为100 μ L体系，其中加50 μ L回收的酶切基因组片段，10 μ L连接缓冲液，20 U的Τ4连接酶。于16°C连接过夜。产物经回收后溶于50 μ L灭菌双蒸水中备用；(3)基因组片段库的富集
单引物的PCR扩增进行基因组片段库的富集，所用引物(其基因序列如基因序列表序列7 )为:
Adapcr 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
所用PCR反应体系为20 yL，其成分为:1 μ L加接头的基因DNA、3 yL的Mg2+、2.5 μ L的PCR缓冲液、0.2 μ L的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.2 yL的Taq DNA聚合酶、0.5 μ L的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；
反应程序为:将配好的PCR反应液放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:72°C 5min -M0C 30 s，58°C 45s, 72°C 1.5 min，进行 26 个循环；72°C终延伸 10 min。制得 PCR产物，即为基因组片段，备用；
步骤四、目的片段的筛选、扩增与测序:将生物素标记的探针与步骤三中所得基因组片段杂交，通过MagneSphere磁珠筛选出目的片段；进行接头PCR，将反应产物，进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。具体操作方法为:
(1)在PCR管中，将250ng_500ng步骤三中回收得到的基因中片段与50-80 pmol步骤二中制得的生物素标记探针混合后，加入21 μ L 10 X SSC溶液和0.7μ L 10%SDS溶液，然后加水至100 μ L ;在95°C 3min变性，室温15min退火，形成生物素探针和基因组片段杂交产物；
(2)取0.6ml的MagneSphere磁珠用SSC溶液洗三次；洗过的磁珠在100 μ L的
0.5 X SSC溶液中重新悬浮，加入生物素探针和基因组片段杂交产物，在室温下放置30min ；用0.5 X SSC溶液洗脱掉悬浮液中没有结合到磁珠上的DNA片段；使用磁力架来筛选出与磁珠结合的生物标记探针与目的片段的混合物，将目的DNA混合物通过50 μ L灭菌双蒸水在94°C下5min洗脱出来，得到目的片段。
[0009](3)所得目的片段进行接头PCR，所用引物、PCR反应体系和反应程序与步骤三中基因组片段库的富集所用一样；将反应产物，进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。
[0010]有益效果是:
1、本发明为牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，采用磁珠探针复合物的方法来分离SINE类反转录转座子序列，通过两个单引物的PCR来分离出牡丹SINE类反转录转座子部分序列，较其他的反向PCR方法，减少了试验时间，省略了基因组酶切、自环化的步骤，通过两个PCR产物的序列分析增加了试验的准确性，并首次分离出牡丹反转录转座子LINE中RT序列；经过正交试验筛选出的B-PCR、A-PCR、接头`PCR等PCR反应体系能够提高产物的特异性，消除引物二聚体，与其他人在其他物种的SINE类反转录转座子分离的体系不同，本发明针对牡丹而设计，分离出了牡丹SINE类反转录转座子序列，产物的特异性高，没有引物二聚体。
[0011]2、本发明在分离牡丹SINE类反转录转座子过程中所设计生物素标记的探针引物序列，为分离牡丹SINE类反转录转座子过程中生物素标记探针的特定引物序列；本发明分离出的牡丹SINE类反转录转座子序列属首次分离，为以后开发基于牡丹SINE类反转录转座子的分子标记提供基础。所分离的序列具有很重要的利用价值。【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明引物B的PCR反应琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明引物A的PCR反应琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明引物B的PCR反应和引物A的PCR反应的所得牡丹SINE类反转录转座子的部分序列；
图4为基因组片段富集库制备过程中的电泳图；
图中标记:M为marker ; □为Box A和Box B结构
【权利要求】
1.一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于，具体操作步骤为: 步骤一、牡丹SINE类反转录转座子的部分序列的分离:根据真核生物SINE类反转录转座子的保守序列Box A和Box B区域，以两个单引物分别进行PCR扩增，将两次PCR扩增出的产物，进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子的部分序列； 所用的两个单引物序列为: 引物 A 5’-TGGCCTAGTGG-3’ ；
引物 B 5’-GAGGAYTTG AACC-3’ ； 步骤二、生物素标记的探针的制备:根据步骤一中所得到的牡丹SINE类反转录转座子的部分序列设计5’端生物素标记的探针引物，以质粒DNA为模板进行PCR，得到生物素标记的探针； 所设计的生物素标记的探针引物的序列为:
PTSBOl 5’-TAGTGGTGTCTAAGGATTTTGTGAG-3’ ；
PTSB02 5’-AATCCTGTTCAGCATTCCCGTA-3’ ； 其中PTSBOl进行5’端生物素标记； 步骤三、基因组片段富集库的制备:提取牡丹基因组DNA，然后以限制性内切酶BspU?,!进行基因组酶切，得到基因组酶切片段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后通过T4连接酶将酶切后的基因组片段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集，得基因组片段，备用； 形成双链的寡聚核苷酸接头的两条寡聚核苷酸链分别为: Adaptor I5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCCGAGGT-3’ ； Adaptor 23’-CCCGGCTCCACTAG-5’ ； 单引物的PCR扩增进行基因组片段库的富集，所用引物为:
Adapcr 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ ； 步骤四、目的片段的筛选、扩增与测序:将生物素标记的探针与步骤三中所得基因组片段杂交，通过MagneSphere磁珠筛选出目的片段；将筛选出的片段进行接头PCR，将反应产物进行克隆及阳性菌筛选以后，进行测序和序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。
2.如权利要求1所述的牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于:步骤一中所述的用两个单引物进行PCR扩增的反应体系和反应程序分别为: 引物A的PCR反应体系为:在PCR管中配制50 μ L的反应液II，其成分为:8 μ L的基因组DNA、6 μ L的含Mg2+的溶液、4 μ L的PCR缓冲液、2.5 μ L的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、.0.4 μ L的Taq DNA聚合酶、2.5 μ L的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；A_PCR反应程序为:将配好的PCR反应液II放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性5 min ；94°C变性I min，43°C退火I min，72°C延伸2 min，进行34个循环；72°C终延伸8 min ； 引物B的PCR反应体系为:在PCR管中配制20 UL的反应液I，其成分为:8 yL的基因组DNA、5 μ L的含Mg2+的溶液、4 μ L的PCR缓冲液、2 μ L的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、.0.4yL的Taq DNA聚合酶、2.5 μ L的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；B-PCR反应程序为:将配好的PCR反应液I放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性2 min ;94°C变性30 s，44°C退火45 s，72°C延伸I min，进行32个循环；72°C终延伸10 min。
3.如权利要求1所述的牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于:步骤二中，以引物PTSBOl和PTSB02进行PCR反应所用PCR反应体系为50 μ L的反应液，其成分为:8 μ L的质粒DNA为模板、4 μ L的含Mg2+的溶液、4 μ L的PCR缓冲液、2 μ L的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.4 μ L的Taq DNA聚合酶、1.5 μ L的引物PTSBOl和PTSB02的混合物，余量为灭菌双蒸水；所用PCR反应程序为:将反应液放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性2 min;94°C变性30 s，55°C退火45 s，72°C延伸I min，进行32个循环；72°C终延伸10 min ;制得PCR产物，即为生物素标记的探针，备用。
4.如权利要求1所述的牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于:步骤三中对所述牡丹基因组DNA进行酶切的方法为:在PCR管中加入8 μ L基因组DNA、20U的限制性内切酶Bspl431、2l.! L的酶切缓冲液，用灭菌双蒸水补足20 μ L ;置于37°C下酶切2h，回收400-200bp片段,溶于50 μ L灭菌双蒸水中。
5.如权利要求1所述的牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于:步骤四中所述的生物素标记的探针和基因组片段杂交步骤为，在PCR管中，将250ng -500ng步骤三中回收得到的基因中片段与50-80pmol步骤二中制得的生物素标记探针混合后，加入21 μ L 10 X SSC溶液和0.7 μ L 10%SDS溶液，然后加水至100 4 1^;在951: 3min变性，室温15min退火，形成生物素探针和基因组片段杂交产物。
6.如权利要求1所述的牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于:步骤四中所述的磁珠法筛选目的片段的方法为，取0.6ml的MagneSphere磁珠,然后用SSC溶液洗三次；洗过的磁珠用100 UL 0.5XSSC溶液重新悬浮后，加入生物素探针和基因组片段杂交产物，在室温下放置30min ;用0.5XSSC溶液洗脱掉悬浮液中没有结合到磁珠上的DNA片段；使用磁力架来筛选出与磁珠结合的生物标记探针与目的片段的混合物，将目的DNA混合物通过50 μ L灭菌双蒸水在`94°C下5min洗脱出来，得到目的片段。
【文档编号】C12N15/63GK103820467SQ201410055967
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】侯小改, 郭大龙, 宋程威, 郭丽丽, 刘素云, 段亚宾 申请人:河南科技大学