一种牡丹基因组dna分子标记方法
【专利摘要】一种牡丹基因组DNA分子标记方法，提取牡丹基因组DNA进行酶切，将酶切产物和接头DNA连接；将连接产物与预扩增引物进行PCR扩增，得到预扩增产物；取所得到预扩增产物与用内切酶接头选择性扩增引物iPBS引物进行PCR扩增，得PCR选择性扩增产物；然后取PCR选择性扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染，观察、拍照，分析结果。本发明是建立在PCR与酶切基础上的分子标记技术，操作简单；成本低，适用性强；针对牡丹基因组研究技术而设计，开发了一种新的基于反转录转座子的分子标记体系，为牡丹的种质资源遗传变异和进化研究提供新的技术手段。
【专利说明】一种牡丹基因组DNA分子标记方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分子标记法，具体的说是一种牡丹基因组DNA分子标记方法。
【背景技术】
[0002]牡丹SuffruticosaAndr.)为苟药科(Paeoniaceae)苟药属
L.)牡丹组(Sect.Mouton DC.)落叶灌木，是重要的观赏绿化植物和资源植物，其花大形美、色艳香浓，为历代人们所称颂，是我国著名的传统名花，在中国已有2000余年的栽培应用历史。我国牡丹在长期的栽培驯化过程中，形成了以中原、西北、江南和西南等品种群为代表的，具有不同花瓣颜色、数目、花型和叶型的栽培品种1000多个，栽培区域遍及全国各地。牡丹组共有9个种，(洪德元和潘开玉，1999 ；Hong和Pan, 2007),分布于河南、甘肃、陕西、山西、安徽、湖北、四川、云南和西藏等9个省区。
[0003]其它作物上的研究表明反转录转座子与基因组的进化，性状的变异等密切相关。已有研究表明反转录转座子是植物基因组进化的主要动力，借助于反转录转座子可以准确获得种质间的进化关系。牡丹种质资源遗传多样性丰富，遗传变异大，但对于种质间的进化关系还未了解清楚。
[0004]分子标记技术可从DNA水平上检测生物体的遗传多样性，不受基因表达和环境条件的影响，其操作简单快速，易实现自动化，广泛应用于植物遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因定位、分子标记辅助育种等方面。目前应用较多的分子标记技术主要有RAPD、SSR、ISSR、AFLP, SRAP等。反转录转座子分子标记较传统的分子标记具有诸多优势，其检测的多态性信息含量明显高于传统分子标记。近年来，随着研究的逐渐深入，基于反转录转座子的分子标记方法也在增加，其中最常用的主要是SSAP、IRAP、REMAP、RBIP四种，已广泛用于植物种质资源及遗传育种 研究。基于反转录转座子的分子标记与常规分子标记技术比较，反转录转座子最大的优势在于它能覆盖全基因组，提供的信息更丰富，可作为高通量标记分析，具有很大的发展潜力。与RFLP、RAPD, SSR和AFLP等常规DNA标记检测多态性不同，基于反转录转座子的标记技术的多态性来源于其结构、组成、分布和逆转座的生物学过程。
[0005]反转录转座子分子标记是目前应用广泛的分子标记技术，已被应用于大麦、玉米、小麦、苹果、葡萄等多种植物。利用反转录转座子分子标记不仅可以有效地进行体细胞克隆变异的鉴定，还可以有效地进行遗传作图和农艺性状基因的标记，用于生物多样性和系统进化关系分析。其中，SSAP (Sequence-specific amplification polymorphism)是一种可以检测反转录转座子和与其邻近的酶切位点之间DNA片段扩增多态性的反转录转座子分子标记。其原理和操作流程类似于AFLP，只是在进行选择性扩增时除了一个能与接头同源配对的引物外，另一个引物根据反转录转座子的LTR (长末端重复序列)末端保守序列来设计。SSAP由限制性内切酶消化基因组DNA，然后连接接头，再分别进行预扩增和选择性扩增，通过同一位置片段的有无来判断其多态性。多态性来源于限制性位点及其两侧序列的变异，这点与AFLP相同，而LTR5’末端和反转录转座子插入位点的变异所产生的多态性是AFLP所没有的，因此SSAP标记方法不仅可以检测插入位点的多态性，又可识别反转录转座子内部变异，但其实施是建立在反转录转座子两端LTR序列分离的基础上。若想开展此类标记，必须先得到反转录转座子LTR序列，而目前分离LTR序列方法的效率还较低。
【发明内容】
[0006]本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其为牡丹的种质资源遗传变异和进化研究提供新的技术手段而且更加简单、高效，实用，大大简化了试验程序，大大的降低了应用难度。
[0007]本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:其具体操作步骤为:
步骤一、提取牡丹基因组DNA ；
步骤二、牡丹基因组DNA的酶切:用限制性内切酶Mse I和限制性内切酶EcoR I对上述步骤一所提取的基因组DNA进行酶切，得到基因组DNA酶切产物；
所述基因组DNA酶切的酶切体系为20 μ L，包括浓度为50ng/ μ L基因组DNA5-10 μ L，稀释10倍后的缓冲液4 2.0 μ L，稀释100倍后的牛血清蛋白OJyUMse I酶0.5 μ L，EcoR I酶0.5 μ L，余量为双蒸水。
[0008]步骤三、酶切产物和接头DNA连接:将所得基因组DNA酶切产物、Mse I接头引物、EcoR I接头引物、Τ4 DNA连接酶和稀释10倍后的连接缓冲液混合均匀后在温度为16°C的条件下保温30min，得到 连接产物；
所述的Mse I接头引物序列包括Mse I 5’端接头引物和Mse I 3’端接头引物，其碱基序列如序列表序列I和序列2 ;所述的EcoR I接头引物序列包括EcoR I 5’端接头引物和EcoR I 3’端接头引物，其碱基序列如序列表序列3和序列4 ；
所述连接的具体操作方法为，在微量PCR离心管中，加入基因组DNA酶切产物8 μ L，MseI接头引物2.5yL、EcoR I接头引物2.5 μ L、T4 DNA连接酶I μ L、稀释10倍后的连接缓冲液2.5 μ L，之后用双蒸水补齐至25 μ L ;用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下保温30min，得到连接产物。
[0009]步骤四、连接产物的预扩增:
(1)、取上述步骤三所得部分连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20 μ mo I/L的Mse I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到Mse I预扩增产物；
(2)、取上述步骤三所得剩余连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20 μ mo I/L的EcoR I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到EcoR I预扩增产物；
所述的Mse I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列5;所述EcoR I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列6 ；
所述连接产物的预扩增更具体的操作方法为在微量PCR离心管中，加入连接产物
2.5 μ L，稀释 10 倍后的缓冲液 2.5 μ L，含 Mg2+ 的溶液 1.875 μ L、dNTPs 0.5 μ L、Mse I 预扩增引物0.5 μ L、EcoR I预扩增引物0.5 μ L、Taq酶0.2 μ L，之后用双蒸水补齐至25 μ L，置于PCR仪中，进行PCR预扩增。[0010]步骤五、选择性扩增:取上述步骤四得到的Mse I预扩增产物和EcoR I预扩增产物，分别用双蒸水稀释20-40倍后，将其与用双蒸水稀释至20 μ mol/L的内切酶接头选择性扩增引物、用双蒸水稀释至20 μ mol/L的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀释10倍后的缓冲液和双蒸水混合均匀后，进行PCR扩增，得PCR选择性扩增产物；
所述内切酶接头选择性扩增引物为碱基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse I选择性扩增引物中的任意一条，或者碱基序列如序列表序列10和序列11的EcoR I选择性扩增引物中的任意一条；
所述的iPBS引物为喊基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一条；所述步骤五的操作方法为:在微量PCR离心管中，加入稀释到20 μ mol/L的内切酶接头选择性扩增引物5~10 μ 1，稀释到20 μ mol/L的iPBS引物5~10 μ 1，稀释10倍后的Buffer2.5μ 1，含 Mg2+的溶液，的 L 875 μ 1，dNTP 0.5 μ I,Mse I 预扩增产物 0.5 μ l、EcoRI预扩增产物0.5μ l，Taq酶0.2μ 1，余量用双蒸水补齐至25μ 1，置于PCR仪中，进行PCR选择性扩增。所述PCR选择性扩增，具体PCR程序为94°C 5min ；94°C 30s,68°C 30s _0.7°C循环，72°C Imin 12 个循环，再进行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 个循环；72°C 5min。
[0011]步骤六、首先制备6.5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR选择性扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染，观察、拍照，分析结果。
[0012]有益效果是:
1、本发明是建立在PCR与酶切基础上的分子标记技术，操作简单；成本低，适用性强；针对牡丹基因组研究技术而设计，开发了一种新的基于反转录转座子的分子标记体系，为牡丹的种质资源遗传变异和进化研究提供新的技术手段；整个分子标记开发思路上不囿于现有SSAP标记必须基于LTR特异引物的限制，大胆利用iPBS引物替代SSAP分子标记中的LTR特异引物，使该方法不需要费时费力地开发`引物，大大的降低了技术的应用难度；在牡丹上的应用表明，效果较好，具有较好的应用前景。
[0013]2、本发明有效结合了 iPBS标记方法和SSAP标记方法的优势，与SSAP标记相比，本发明方法不用开发特异的LTR引物，大大的降低了应用难度；与iPBS标记相比，本发明方法因为还扩增了反转录转座子与酶切位点区间，多态性大大增强。针对SSAP标记方法中LTR特异引物分离困难，利用iPBS引物替代该特异引物，不仅可以直接用于种质资源多态性研究，而且更加简单、高效，实用。本发明方法具有通用性，引物可以在物种间通用，可大大减少了开发特异引物的费用，多态性强，方法具有通用性，引物可以在物种间通用，具有广阔简单应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明的实施例1聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；
图2为本发明的实施例2聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；
图3为本发明的实施例3聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；
图4为本发明的实施例4聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；
图中标记是:1、M为marker。
【具体实施方式】[0015]一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:其具体操作步骤为:
步骤一、提取牡丹基因组DNA ；
步骤二、牡丹基因组DNA的酶切:用限制性内切酶Mse I和限制性内切酶EcoR I对上述步骤一所提取的基因组DNA进行酶切，得到基因组DNA酶切产物；
所述基因组DNA酶切的酶切体系为20 μ L，包括浓度为50ng/ μ L基因组DNA5-10 μ L，稀释10倍后的缓冲液4 2.0 μ L，稀释100倍后的牛血清蛋白OJyUMse I酶0.5 μ L，EcoR I酶0.5 μ L，余量为双蒸水。
[0016]步骤三、酶切产物和接头DNA连接:将所得基因组DNA酶切产物、Mse I接头引物、EcoR I接头引物、Τ4 DNA连接酶和稀释10倍后的连接缓冲液混合均匀后在温度为16°C的条件下保温30min，得到连接产物；
所述的Mse I接头引物序列包括Mse I 5’端接头引物和Mse I 3’端接头引物，其碱基序列如序列表序列I和序列2;所述的EcoR I接头引物序列包括EcoR I 5’端接头引物和EcoR I 3’端接头引物，其碱基序列如序列表序列3和序列4 ；
所述连接的具体操作方法为，在微量PCR离心管中，加入基因组DNA酶切产物8 μ L，MseI接头引物2.5yL、EcoR I接头 引物2.5 μ L、T4 DNA连接酶I μ L、稀释10倍后的连接缓冲液2.5 μ L，之后用双蒸水补齐至25 μ L ;用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下保温30min，得到连接产物。
[0017]步骤四、连接产物的预扩增:
(1)、取上述步骤三所得部分连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20 μ mo I/L的Mse I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到Mse I预扩增产物；
(2)、取上述步骤三所得剩余连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20 μ mo I/L的EcoR I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到EcoR I预扩增产物；
所述的Mse I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列5;所述EcoR I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列6 ；
所述连接产物的预扩增更具体的操作方法为在微量PCR离心管中，加入连接产物
2.5 μ L，稀释 10 倍后的缓冲液 2.5 μ L，含 Mg2+ 的溶液 1.875 μ L、dNTPs 0.5 μ L、Mse I 预扩增引物0.5 μ L、EcoR I预扩增引物0.5 μ L、Taq酶0.2 μ L，之后用双蒸水补齐至25 μ L，置于PCR仪中，进行PCR预扩增。
[0018]步骤五、选择性扩增:取上述步骤四得到的Mse I预扩增产物和EcoR I预扩增产物，分别用双蒸水稀释20-40倍后，将其与用双蒸水稀释至20 μ mol/L的内切酶接头选择性扩增引物、用双蒸水稀释至20 μ mol/L的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀释10倍后的缓冲液和双蒸水混合均匀后，进行PCR扩增，得PCR选择性扩增产物；
所述内切酶接头选择性扩增引物为碱基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse I选择性扩增引物中的任意一条，或者碱基序列如序列表序列10和序列11的EcoR I选择性扩增引物中的任意一条；
所述的iPBS引物为喊基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一条； 所述步骤五的操作方法为:在微量PCR离心管中，加入稀释到20ymol/L的内切酶接头选择性扩增引物5~10 μ 1，稀释到20 μ mol/L的iPBS引物5~10 μ 1，稀释10倍后的Buffer2.5 μ 1，含 Mg2+的溶液，的 L 875 μ 1，dNTP 0.5 μ I,Mse I 预扩增产物 0.5 μ l、EcoRI预扩增产物0.5μ l，Taq酶0.2μ 1，余量用双蒸水补齐至25μ 1，置于PCR仪中，进行PCR选择性扩增。所述PCR选择性扩增，具体PCR程序为94°C 5min ；94°C 30s,68°C 30s _0.7°C循环，72°C Imin 12 个循环，再进行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 个循环；72°C 5min。
[0019]步骤六、首先制备6.5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR选择性扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染，观察、拍照，分析结果。
[0020]实施例1
一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:其具体操作步骤为:
步骤一、牡丹基因组DNA的提取:牡丹基因组DNA的获得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40个牡丹品种(包括葛巾紫、万花盛、岛大臣、鲁荷粉、呼红、白玉、三变赛玉、种生红、绿香球、雀好、二乔、乌龙捧盛、胭脂图、红冠玉带、肉芙蓉、银红巧对、桃红献媚、金岛、蓝海碧波、虞姬艳装、寿星红、小胡红、银鳞碧珠、红灯、盛丹炉、姚黄、萍实艳、罗汉红、锦袍红、红莲、佛门袈裟、冰山翡翠、首案红、状元红、玫瑰紫、岛锦、大花黄、紫牡丹、四川牡丹、杨山牡丹)的基因组DNA ；
步骤二、牡丹基因组DNA的酶切:利用NEB公司酶切试剂盒中的Mse I和EcoR I限制性内切酶对制备的牡丹基因组DNA分别进行酶切:20 μ L的酶切反应液成分为:浓度为SOng/yL基因组DNA 5yL，稀释10倍后的缓冲液4.2 μ L，稀释100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L, Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量为双蒸水。
[0021]步骤三、所得酶切产物和接头DNA的分别连接:取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:牡丹基因组DNA酶切产物8 μ L，MseI接头引物(其碱基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接头引物(其碱基序列如序列表序列3和序列4)各2.5yL，T4 DN A连接酶I μ L，稀释10倍后的连接缓冲液r2.5 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下连接30min。
[0022]步骤四、连接产物的预扩增JfMse I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列5)和EcoR I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列6)稀释至20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:连接产物2.5 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀释后Mse I预扩增引物和EcoR I预扩增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，PCR扩增产物稀释20-40倍后备用。将所配制的体系，均放入PCR仪，进行反应；具体PCR程序为94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 个循环；72°C IOmin0
[0023]步骤五、选择性扩增反应:将选择性扩增引物Mzx6 (其碱基序列如序列表序列7)和iPBS引物2224 (其碱基序列如序列表序列18)分别稀释到20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:预扩增PCR产物稀释液5-10 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L,选择性扩增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L。将所得PCR反应液，均置于PCR仪中，进行反应，具体PCR程序为94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C/循环，72°C Imin 12 个循环，再进行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 个循环；72°C 5min)。[0024]步骤六、电泳检测:首先制备6.5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染，观察、拍照，电泳检测结果如图1所示。
[0025]实施例2
一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:其具体操作步骤为:
步骤一、牡丹基因组DNA的提取:牡丹基因组DNA的获得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40个牡丹品种(包括葛巾紫、万花盛、岛大臣、鲁荷粉、呼红、白玉、三变赛玉、种生红、绿香球、雀好、二乔、乌龙捧盛、胭脂图、红冠玉带、肉芙蓉、银红巧对、桃红献媚、金岛、蓝海碧波、虞姬艳装、寿星红、小胡红、银鳞碧珠、红灯、盛丹炉、姚黄、萍实艳、罗汉红、锦袍红、红莲、佛门袈裟、冰山翡翠、首案红、状元红、玫瑰紫、岛锦、大花黄、紫牡丹、四川牡丹、杨山牡丹)的基因组DNA ；
步骤二、牡丹基因组DNA的酶切:利用NEB公司酶切试剂盒中的Mse I和EcoR I限制性内切酶对制备的牡丹基因组DNA分别进行酶切:20 μ L的酶切反应液成分为:浓度为SOng/yL基因组DNA 8yL，稀释10倍后的缓冲液4.2 μ L，稀释100倍后的牛血清蛋白
0.2 μ L, Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量为双蒸水。
[0026]步骤三、所得酶切产物和接头DNA的分别连接:取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:牡丹基因组DNA酶切产物8 μ L，MseI接头引物(其碱基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接头引物(其碱基序列如序列表序列3和序列4)各2.5yL，T4 DNA连接酶I μ L，稀释10倍后的连接缓冲液r2.5 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下连接30min。
`[0027]步骤四、连接产物的预扩增JfMse I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列5)和EcoR I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列6)稀释至20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:连接产物2.5 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5yL，1%(:12溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀释后Mse I预扩增引物和EcoR I预扩增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，PCR扩增产物稀释30倍后备用。将所配制的体系，均放入PCR仪，进行反应；具体PCR程序为94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 个循环；72°C IOmin0
[0028]步骤五、选择性扩增反应:将选择性扩增引物Ezxl2和iPBS引物2240分别稀释到20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:预扩增PCR产物稀释液5-10 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5μ L，Mgcl2溶液
1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L，选择性扩增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L ;将所得PCR反应液，均置于PCR仪中，进行反应，具体PCR程序为94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C / 循环，72°C Imin 12 个循环，再进行 94°C 30s, 56°C 30s,72°C Imin 23 个循环；72°C 5min)。
[0029]步骤六、电泳检测:首先制备6.5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染，观察、拍照，电泳检测结果如图2所示。
[0030]实施例3
一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:其具体操作步骤为:
步骤一、牡丹基因组DNA的获得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40个牡丹品种(包括葛巾紫、万花盛、岛大臣、鲁荷粉、呼红、白玉、三变赛玉、种生红、绿香球、雀好、二乔、乌龙捧盛、胭脂图、红冠玉带、肉芙蓉、银红巧对、桃红献媚、金岛、蓝海碧波、虞姬艳装、寿星红、小胡红、银鳞碧珠、红灯、盛丹炉、姚黄、萍实艳、罗汉红、锦袍红、红莲、佛门袈裟、冰山翡翠、首案红、状元红、玫瑰紫、岛锦、大花黄、紫牡丹、四川牡丹、杨山牡丹)的基因组DNA;
步骤二、牡丹基因组DNA的酶切:利用NEB公司酶切试剂盒中的Mse I和EcoR I限制性内切酶对制备的牡丹基因组DNA分别进行酶切:20 μ L的酶切反应液成分为:浓度为SOng/yL基因组DNA 8yL，稀释10倍后的缓冲液4.2 μ L，稀释100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L, Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量为双蒸水。
[0031]步骤三、所得酶切产物和接头DNA的分别连接:取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:牡丹基因组DNA酶切产物8 μ L，MseI接头引物(其碱基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接头引物(其碱基序列如序列表序列3和序列4)各2.5 μ L，T4 DNA连接酶I μ L，稀释10倍后的连接缓冲液r2.5 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下连接30min。
[0032]步骤四、连接产物的预扩增JfMse I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列5)和EcoR I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列6)稀释至20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:连接产物2.5 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5yL，1%(:12溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀释后Mse I预扩增引物和EcoR I预扩增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，PCR扩增产物稀释40倍后备用。将所配制的体系，均放入PCR仪，进行反应；具体PCR程序为94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 个循环；72°C IOmin0
[0033]步骤五、选择性扩增反应:将选择性扩增引物Mzxll (其碱基序列如序列表序列8)和iPBS引物2249 (其碱基序列如序列表序列36)分别稀释到20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:预扩增PCR产物稀释液5-10 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L,选择性扩增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L。将所得PCR反应液，均置于PCR仪中，进行反应，具体PCR程序为94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C/循环，72°C Imin 12 个循环，再进行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 个循环；72°C 5min)。
[0034]步骤六、电泳检测
首先制备6.5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染，观察、拍照，电泳检测结果如图3所示。
[0035]实施例4
一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:其具体操作步骤为:
步骤一、牡丹基因组DNA的获得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40个牡丹品种(包括葛巾紫、万花盛、岛大臣、鲁荷粉、呼红、白玉、三变赛玉、种生红、绿香球、雀好、二乔、乌龙捧盛、胭脂图、红冠玉带、肉芙蓉、银红巧对、桃红献媚、金岛、蓝海碧波、虞姬艳装、寿星红、小胡红、银鳞碧珠、红灯、盛丹炉、姚黄、萍实艳、罗汉红、锦袍红、红莲、佛门袈裟、冰山翡翠、首案红、状元红、玫瑰紫、 岛锦、大花黄、紫牡丹、四川牡丹、杨山牡丹)的基因组DNA;步骤二、牡丹基因组DNA的酶切:利用NEB公司酶切试剂盒中的Mse I和EcoR I限制性内切酶对制备的牡丹基因组DNA分别进行酶切:20 μ L的酶切反应液成分为:浓度为SOng/yL基因组DNA 8yL，稀释10倍后的缓冲液4.2 μ L，稀释100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L, Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量为双蒸水。
[0036]步骤三、所得酶切产物和接头DNA的分别连接:取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:牡丹基因组DNA酶切产物8 μ L，MseI接头引物(其碱基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接头引物(其碱基序列如序列表序列3和序列4)各2.5yL，T4 DNA连接酶I μ L，稀释10倍后的连接缓冲液r2.5 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下连接30min。
[0037]步骤四、连接产物的预扩增JfMse I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列5)和EcoR I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列6)稀释至20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:连接产物2.5 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀释后Mse I预扩增引物和EcoR I预扩增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，PCR扩增产物稀释40倍后备用。将所配制的体系，均放入PCR仪，进行反应；具体PCR程序为94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 个循环；72°C IOmin0
[0038]步骤五、选择性扩增反应:将选择性扩增引物Mzxl6 (其碱基序列如序列表序列9)和iPBS引物2255 (其碱基序列如序列表序列19)分别稀释到20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:预扩增PCR产物稀释液5-10 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L,选择性扩增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L。将所得PCR反应液，均置于PCR仪中，进行反应，具体`PCR程序为94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C/循环，72°C Imin 12 个循环，再进行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 个循环；72°C 5min)。
[0039]步骤六、电泳检测:首先制备6.5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行电泳，电泳完成后，银染，观察、拍照，电泳检测结果如图4所示。
[0040]实施例5
一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:其具体操作步骤为:
(I)牡丹基因组DNA的获得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40个牡丹品种(包括葛巾紫、万花盛、岛大臣、鲁荷粉、呼红、白玉、三变赛玉、种生红、绿香球、雀好、二乔、乌龙捧盛、胭脂图、红冠玉带、肉芙蓉、银红巧对、桃红献媚、金岛、蓝海碧波、虞姬艳装、寿星红、小胡红、银鳞碧珠、红灯、盛丹炉、姚黄、萍实艳、罗汉红、锦袍红、红莲、佛门袈裟、冰山翡翠、首案红、状元红、玫瑰紫、岛锦、大花黄、紫牡丹、四川牡丹、杨山牡丹)的基因组DNA;
步骤二、牡丹基因组DNA的酶切:利用NEB公司酶切试剂盒中的Mse I和EcoR I限制性内切酶对制备的牡丹基因组DNA分别进行酶切:20μ L的酶切反应液成分为:浓度为SOng/yL基因组DNA 8yL，稀释10倍后的缓冲液4.2 μ L，稀释100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L，Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量为双蒸水。
[0041]步骤三、所得酶切产物和接头DNA的分别连接:取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:牡丹基因组DNA酶切产物8 μ L，MseI接头引物(其碱基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接头引物(其碱基序列如序列表序列3和序列4)各2.5 μ L，T4 DNA连接酶I μ L，稀释10倍后的连接缓冲液r2.5 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下连接30min。
[0042]步骤四、连接产物的预扩增JfMse I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列5)和EcoR I预扩增引物(其碱基序列如序列表序列6)稀释至20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:连接产物2.5 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5yL，1%(:12溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀释后Mse I预扩增引物和EcoR I预扩增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L，PCR扩增产物稀释40倍后备用。将所配制的体系，均放入PCR仪，进行反应；具体PCR程序为94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 个循环；72°C IOmin0
[0043]步骤五、选择性扩增反应:将选择性扩增引物Ezxl5其碱基序列如序列表序列11)和iPBS引物2399其碱基序列如序列表序列48)分别稀释到20mol/L后备用；取微量PCR离心管，在每个微量PCR离心管内配制25 μ L PCR反应液，其成分为:预扩增PCR产物稀释液5-10 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L,选择性扩增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用双蒸水补齐至25 μ L。将所得PCR反应液，均置于PCR仪中，进行反应，具体PCR程序为94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C/循环，72°C Imin 12 个循环，再进行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 个循环；72°C 5min)。
[0044]步骤六、电泳检测:首先制备6.5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，取PCR扩增产物，加入染色液并点样进行 电泳，电泳完成后，银染，观察。
【权利要求】
1.一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:其具体操作步骤为: 步骤一、提取牡丹基因组DNA ； 步骤二、牡丹基因组DNA的酶切:用限制性内切酶Mse I和限制性内切酶EcoR I对上述步骤一所提取的基因组DNA进行酶切，得到基因组DNA酶切产物； 步骤三、酶切产物和接头DNA连接:将所得基因组DNA酶切产物、Mse I接头引物、EcoRI接头引物、T4 DNA连接酶和稀释10倍后的连接缓冲液混合均匀后在温度为16°C的条件下保温30min，得到连接产物； 所述的Mse I接头引物序列包括Mse I 5’端接头引物和Mse I 3’端接头引物，其碱基序列如序列表序列I和序列2 ； 所述的EcoR I接头引物序列包括EcoR I 5’端接头引物和EcoR I 3’端接头引物，其碱基序列如序列表序列3和序列4 ； 步骤四、连接产物的预扩增: (1)、取上述步骤三所得部分连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20 μ mo I/L的Mse I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到Mse I预扩增产物； (2)、取上述步骤三所得剩余连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20 μ mo I/L的EcoR I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到E coR I预扩增产物； 所述的Mse I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列5;所述EcoR I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列6 ； 步骤五、选择性扩增:取上述步骤四得到的Mse I预扩增产物和EcoR I预扩增产物，分别用双蒸水稀释20-40倍后，将其与用双蒸水稀释至20μπιΟ1/1的内切酶接头选择性扩增引物、用双蒸水稀释至20μπιΟ1/1的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀释10倍后的缓冲液和双蒸水混合均匀后，进行PCR扩增，得PCR选择性扩增产物； 所述内切酶接头选择性扩增引物为碱基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse I选择性扩增引物中的任意一条，或者碱基序列如序列表序列10和序列11的EcoR I选择性扩增引物中的任意一条； 所述的iPBS引物为喊基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一条； 步骤六、将所得PCR选择性扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果。
2.如权利要求1所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:所述步骤二中基因组DNA酶切体系总量为20 μ L，包括浓度为50ng/ μ L基因组DNA5-10 μ L，稀释10倍后的缓冲液4 2.0 μ L，稀释100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L7Mse I酶0.5 μ L，EcoR I酶0.5 μ L，余量为双蒸水。
3.如权利要求1所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:所述步骤三的操作方法为:在微量PCR离心管中，加入基因组DNA酶切产物8 μ L，Mse I接头引物2.5 μ L、EcoR I接头引物2.5yL、T4 DNA连接酶I μ L、稀释10倍后的连接缓冲液2.5 μ L，之后用双蒸水补齐至25 μ L ;用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16°C的条件下保温30min，得到连接产物。
4.如权利要求1所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:所述步骤四的操作方法为:在微量PCR离心管中，加入连接产物2.5 μ L，稀释10倍后的缓冲液2.5μ L，含Mg2+的溶液1.875 μ L、dNTPs 0.5 μ L、Mse I预扩增引物0.5 μ L、EcoR I预扩增引物·0.5 μ L、Taq酶0.2 μ L，之后用双蒸水补齐至25 μ L，置于PCR仪中，进行PCR预扩增。
5.如权利要求4所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:所述的PCR预扩增，具体 PCR 程序为 94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 个循环；72°C IOmin0
6.如权利要求1所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:所述步骤五的操作方法为:在微量PCR离心管中，加入稀释到20ymol/L的内切酶接头选择性扩增引物5~10 μ 1，稀释到20ymol/L的iPBS引物5~10 μ 1，稀释10倍后的Buffer2.5 μ 1，含Mg2+的溶液，的 1.875 μ 1，dNTP 0.5 μ I, Mse I 预扩增产物 0.5 μ 1、EcoR I 预扩增产物 0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ I，余量用双蒸水补齐至25 μ 1，置于PCR仪中，进行PCR选择性扩增。
7.权利要求6所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于:所述PCR选择性扩增，具体 PCR 程序为 94 °C 5min ；94°C 30s, 68 °C 30s -0.7°C 循环，72°C Imin 12 个循环，再进行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C ·Imin 23 个循环；72°C 5min。
【文档编号】C12Q1/68GK103820546SQ201410055992
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】郭大龙, 侯小改, 段亚宾, 魏冬峰, 吕静霞 申请人:河南科技大学