一种基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了属于水产品副产物加工领域的一种基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽，本发明主要是将鱼皮打成浆，然后用胶体磨磨成鱼皮浆液，离心去掉脂肪；再用超声波处理，接着用风味蛋白酶水解，超滤，得分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉；再将鱼皮蛋白多肽粉与乳糖混合进行糖基化反应，即得鱼皮抗冻蛋白多肽。本发明还公开了鱼皮抗冻蛋白多肽的制备方法。本发明鱼皮抗冻蛋白多肽抗冻功能好，可以将冷冻干燥微生物的活率提高50%；其次，因采用超声波处理，鱼皮抗冻蛋白多肽得率高；此外，本发明制备方法反应条件温和，方法简单，设备投资少，操作场地小。
【专利说明】一种基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产品副产物加工领域，具体涉及一种基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽，以及该鱼皮抗冻蛋白多肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]抗冻蛋白具有低温保护功能，可作为一种高级防冻剂应用，在医学、化妆品、生物、食品、农学等领域有广泛的应用价值，如抗冻蛋白可用于人体或动物器官的超低温保存，改善其冷冻质量；抗冻蛋白可提高特定微生物的抗冻能力，减少食品冻藏时冰晶形成和重结晶对食品结构的破坏，改善食品品质。
[0003]1957年，Scholander等首次报道一些海洋鱼类存在具有抗冻活性的蛋白。1969年,Devries和Wohlschlag在南极海洋鱼类的血液中首次提取并证明了具有抗冻活性的物质是蛋白。此后，人们相继对极区鱼类、植物、昆虫、真菌和细菌中的抗冻蛋白进行了研究。从现有的报道来看，关于鱼类抗冻蛋白的研究主要集中在分离纯化、功能结构特性等方面。由于动植物自身存在的抗冻蛋白数量非常有限，采用传统的分离提纯方法从动植物得到的抗冻蛋白数量十分有限，导致最终产品价格昂贵，很难实现规模化生产，也很难在农业，生物及医药工业等领域得到广泛应用。
[0004]抗冻蛋白的抗冻活性片段主要存在于局部的特异多肽链结构域，并不是整体蛋白质在起作用(Evans, R.P.等.Biochimicaet Biophysica Acta(BBA)-Proteinsand Proteomics, 2004 .1700 (2), 209-217.Fletcher, G.L.等.Annual Reviewof Physiology,2001.63,359-390.Low, ff.K.等.Journal of Biological Chemistry, 2001.276(15), 11582-11589.Wang, S.Y.等.Applied Mechanics andMaterials, 2012.140，411-415)。国内已有从小麦、沙冬青、牛皮、猪皮、昆虫中提取制备抗冻蛋白的相关专利申请(如 CN200610166427.4，CN201010277569.4，CN200810072986.8，CN201110091198.5，CN201010292036.3)，其中专利申请《一种鱼源抗冻多肽及其制备方法》(申请号为:201310441149.9)公开了以鱼皮胶原蛋白为原料，通过木瓜蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性抗冻多肽。国外方面，欧洲专利EP9301969W公开了一种获得抗冻蛋白基因的方法，并利用其在酵母中的表达生产抗冻蛋白多肽，而含有抗冻多肽的酵母可以用在冷冻面团等的生产中。日本专利JP2003142850公开了一些鱼类血中的抗冻蛋白以及它们的氨基酸序列和碱基序列。
[0005]经检索，没有发现利用以鱼皮为原料，通过酶解制备蛋白多肽，再与糖经过糖基化反应制备具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽。该鱼皮抗冻蛋白多肽具有较好的微生物低温保护作用。
[0007]本发明另一目的在于提供上述鱼皮抗冻蛋白多肽的制备方法。[0008]本发明第三目的在于提供上述鱼皮抗冻蛋白多肽在微生物抗冻保护上的用途。
[0009]实现本发明的技术方案如下:
[0010]本发明一种基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽，按照如下方法制备:
[0011](I)、将冷冻鱼皮在10~12°C下进行解冻，然后用水将鱼皮清洗干净，再将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0~5.0倍鱼皮浆重量的水，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000~5000g条件下离心5~8分钟，去上层脂肪，得去脂鱼皮浆液；
[0012](2)、将去脂鱼皮浆液用超声波处理5~10分钟；然后按照0.4~0.7%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入风味蛋白酶，在40~50°C、pH6.5~7.5条件下进行酶解反应1.5~2.5小时；再在85~90°C下保温3~5分钟，冷却至室温；在3000~5000g条件下离心3~6分钟，收集上清液；
[0013](3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000~5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉；
[0014](4)、按照鱼皮蛋白多肽粉和乳糖之间质量比为3.5~5:1的比例将鱼皮蛋白多肽粉和乳糖混合，然后溶解于去离子水中，轻轻搅拌5~10分钟，溶液最终浓度为12~15%(w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉；
[0015](5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉在50~60°C、相对湿度为76~79%条件下反应15~20小时，得基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽。
[0016]上述鱼皮抗冻蛋白多肽步骤(1)中所述的鱼皮来自于河豚鱼、鳕鱼、马面鱼或鲽鱼
坐寸ο
[0017]上述鱼皮抗冻蛋白多肽步骤(1)中所述的鱼皮解冻的时间为5~10小时。
[0018]上述鱼皮抗冻蛋白多肽步骤(1)中所述的清洗鱼皮的水的温度为10~12°C。
[0019]上述鱼皮抗冻蛋白多肽步骤(2)中所述的超声波的频率为25-30kH。
[0020]上述鱼皮抗冻蛋白多肽步骤(2)中所述的pH用lmol/L的NaOH或HCl调节。
[0021]上述基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽的制备方法，包括如下步骤:
[0022](I)、将冷冻鱼皮在10~12°C下进行解冻，然后用水将鱼皮清洗干净，再将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0~5.0倍鱼皮浆重量的水，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000~5000g条件下离心5~8分钟，去上层脂肪，得去脂鱼皮浆液；
[0023](2)、将去脂鱼皮浆液用超声波处理5~10分钟；然后按照0.4~0.7%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入风味蛋白酶，在40~50°C、pH6.5~7.5条件下进行酶解反应1.5~2.5小时；再在85~90°C下保温3~5分钟，冷却至室温；在3000~5000g条件下离心3~6分钟，收集上清液；
[0024](3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000~5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉；
[0025](4)、按照鱼皮蛋白多肽粉和乳糖之间质量比为3.5~5:1的比例将鱼皮蛋白多肽粉和乳糖混合，然后溶解于去离子水中，轻轻搅拌5~10分钟，溶液最终浓度为12~15%(w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉；
[0026](5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉在50~60°C、相对湿度为76~79%条件下反应15~20小时，得基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽。
[0027]上述制备方法步骤(1)中所述的鱼皮来自于河豚鱼、鳕鱼、马面鱼或鲽鱼等。
[0028]上述制备方法步骤(1)中所述的鱼皮解冻的时间为5~10小时。
[0029]上述制备方法步骤(1)中所述的清洗鱼皮的水的温度为10~12°C。
[0030]上述制备方法步骤(2)中所述的超声波的频率为25~30kH。
[0031]上述制备方法步骤(2)中所述pH用lmol/L的NaOH或HCl调节。
[0032]上述鱼皮抗冻蛋白多肽在微生物抗冻保护上的应用。
[0033]本发明具有的优点和有益效果:(I)、本发明鱼皮抗冻蛋白多肽抗冻功能好，可以将冷冻干燥微生物的活率提高50%。(2)、本发明采用超声波技术处理鱼皮浆，鱼皮抗冻蛋白多肽的得率高。(3)、本发明制备方法反应条件温和，反应温度较低，反应时间较短，制备过程中不会产生任何对身体不利的物质，安全性好。(4)、本发明方法操作工艺简单，设备投资少，操作场地小，适用于工业化生产。(5)、本发明鱼皮抗冻蛋白多肽，能广泛应用于微生物的冷冻保护作用、改善冰淇淋的组织结构。
【具体实施方式】
[0034]实施例1本发明基于糖修饰的鳕鱼鱼皮抗冻蛋白多肽的制备
[0035]按照如下方法进行:
[0036](I)、将冷冻鳕鱼鱼皮50克在10°C下进行解冻5小时，然后用温度为10°C的水将鱼皮清洗干净，再用打浆机将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入4.0倍鱼皮浆重量的水200克，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000g条件下离心8min，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液235克。
[0037](2)、将去脂鱼皮浆液于超声波发生器中，用频率为30kH的超声波处理5分钟；然后按照0.7%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入风味蛋白酶(购自Novozymes,以下同)0.35克，在50°C、pH为7.5 (用lmol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解1.5h ;然后在90°C下保温3分钟，冷却至室温；在4000g条件下离心5min,收集上清液，得上清液208克；
[0038](3)、将步骤(2)所得的上清液208克通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，留取分子量小于5000的蛋白多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000-5000道尔顿的多肽，得蛋白液95克；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉3.1克。
[0039](4)、将鱼皮蛋白多肽粉3.1克和乳糖0.8克混合均匀，然后溶解于去离子水中，轻轻搅拌10分钟，溶液最终浓度为12% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉3.9克；
[0040](5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉在温度为50°C、相对湿度为79%条件下反应20小时，得基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽3.7克。
[0041]实施例2本发明基于糖修饰的河豚鱼鱼皮抗冻蛋白多肽的制备
[0042]按照如下方法进行:[0043](I)、将冷冻河豚鱼鱼皮100克在10°C下进行解冻8小时，然后用温度为10°C的水将鱼皮清洗干净，再用打浆机将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入3.0倍鱼皮浆重量的水300克，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在4000g条件下离心5min，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液370克。
[0044](2)、将去脂鱼皮浆液于超声波发生器中，用频率为25kH的超声波处理10分钟；然后按照0.5%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入风味蛋白酶0.5克，在45°C、pH为7.0 (用lmol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解2.0h ;然后在88°C下保温4分钟，冷却至室温；在5000g条件下离心3min，收集上清液，得上清液320克。
[0045](3)、将步骤(2)所得的上清液320克通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000道尔顿的蛋白多肽，再用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000-5000道尔顿的多肽，得蛋白液155克；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉6.3克。
[0046](4)、将鱼皮蛋白多肽粉6.3克和乳糖1.5克混合均匀，然后溶解于去离子水中，轻轻搅拌10分钟，溶液最终浓度为13% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉7.8克；
[0047](5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉在温度为55°C、相对湿度为79%条件下反应18小时，得基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽7.6克。
[0048]实施例3 基于糖修饰的鳕鱼鱼皮抗冻蛋白多肽的制备
[0049]按照如下方法进行:
[0050](I)、将冷冻鳕鱼鱼皮200克在10°C进行解冻10小时，然后用温度为10°C的水将鱼皮清洗干净，再用打浆机将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0倍鱼皮浆重量的水400克，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在4000g条件下离心8min，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液562克。
[0051](2)、将步骤(1)所得的去脂鱼皮浆液于超声波发生器中，用频率为25kH的超声波处理8分钟；按照鱼皮重量0.4%的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入风味蛋白酶0.8克，在50°C、pH为6.5 (用lmol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解
2.5h ;然后在90°C下保温3分钟，冷却至室温，在4000g条件下离心5min，收集上清液，得上清液478克。
[0052](3)、将步骤(2)所得的上清液478克通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的蛋白多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截取分子量为3000-5000道尔顿的多肽，得蛋白液375克，冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉12.5克。
[0053](4)、将鱼皮蛋白多肽粉12.5克和乳糖3.0克混合均匀，然后溶解于去离子水中，轻轻搅拌10分钟，溶液最终浓度为15% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉15.5 克;
[0054](5)、将鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉在温度为60°C、相对湿度为76%条件下反应18小时，得基于糖修饰的的鱼皮抗冻蛋白多肽15.3克。
[0055]实施例4本发明基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽对微生物抗冻保护对比试验[0056]按照如下方法进行:
[0057]试验处理:A.空白对照(不加任何保护剂)B.乳糖；C.未进行糖基化反应的鱼皮蛋白多肽；D.实施例1制备的鱼皮抗冻蛋白多肽；E.实施例2制备的鱼皮抗冻蛋白多肽；F.实施例3制备的鱼皮抗冻蛋白多肽。
[0058]试验方法:将离心浓缩后的乳酸菌菌体(保加利亚乳杆菌(中国农业大学提供，编号:S_5)和嗜热链球菌(中国农业大学提供，编号:5Y)分别添加不同冻干保护剂(见试验处理B~F)后(菌体与冻干保护剂的比例为4:1 (ν/ν)，置于_40°C的冻干机中，待菌液冻结后，于0.01mbar的真空度下冷冻干燥48小时，然后在适当条件下复水，测定菌体存活率。
[0059]
【权利要求】
1.一种基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽，其特征在于按照如下方法制备: (1)、将冷冻鱼皮在10~12°C下进行解冻，然后用水将鱼皮清洗干净，再将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0~5.0倍鱼皮浆重量的水，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000~5000g条件下离心5~8分钟，去上层脂肪，得去脂鱼皮浆液； (2)、将去脂鱼皮浆液用超声波处理5~10分钟；然后按照0.4~0.7%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入风味蛋白酶，在40~50°C、pH6.5~.7.5条件下进行酶解反应1.5~2.5小时；再在85~90°C下保温3~5分钟，冷却至室温；在3000~5000g条件下离心3~6分钟，收集上清液； (3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000~5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉； (4)、按照鱼皮蛋白多肽粉和乳糖之间质量比为3.5~5:1的比例将鱼皮蛋白多肽粉和乳糖混合，然后溶解于去离子水中，轻轻搅拌5~10分钟,溶液最终浓度为12~15% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉； (5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉在50~60°C、相对湿度为76~79%条件下反应15~20小时，得基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽。
2.按照权利要求1所述的鱼皮抗冻蛋白多肽，其特征在于其步骤(1)中所述的鱼皮来自于河豚鱼、鳕鱼、马面鱼或鲽鱼。
3.按照权利要求1所述的鱼皮抗冻蛋白多肽，其特征在于其步骤(1)中所述的鱼皮解冻的时间为5~10小时；所述的清洗鱼皮的水的温度为10~12°C。
4.按照权利要求1所述的鱼皮抗冻蛋白多肽，其特征在于其步骤(2)中所述的超声波的频率为25-30kH。
5.权利要求1所述的基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)、将冷冻鱼皮在10~12°C下进行解冻，然后用水将鱼皮清洗干净，再将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0~5.0倍鱼皮浆重量的水，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000~5000g条件下离心5~8分钟，去上层脂肪，得去脂鱼皮浆液； (2)、将去脂鱼皮浆液用超声波处理5~10分钟；然后按照0.4~0.7%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入风味蛋白酶，在40~50°C、pH6.5~.7.5条件下进行酶解反应1.5~2.5小时；再在85~90°C下保温3~5分钟，冷却至室温；在3000~5000g条件下离心3~6分钟，收集上清液； (3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000~5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉； (4)、按照鱼皮蛋白多肽粉和乳糖之间质量比为3.5~5:1的比例将鱼皮蛋白多肽粉和乳糖混合，然后溶解于去离子水中，轻轻搅拌5~10分钟,溶液最终浓度为12~15% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉；(5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-乳糖冻干粉在50~60°C、相对湿度为76~79%条件下反应15~20小时，得基于糖修饰的鱼皮抗冻蛋白多肽。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的鱼皮来自于河豚鱼、鳕鱼、马面鱼或鲽鱼。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的鱼皮解冻的时间为5~10小时；所述的清洗鱼皮的水的温度为10~12°C。
8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)中所述的超声波的频率为25 ~30kH。
9.权利要求1~4任一所 述的鱼皮抗冻蛋白多肽在微生物抗冻保护上的应用。
【文档编号】C12P21/06GK103805668SQ201410077871
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】刘鹏, 徐萍 申请人:山东瀚龙生物科技有限公司