一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法
【专利摘要】一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，涉及食醋。以红曲酒为碳源富集福建红曲醋专用醋酸菌；初筛福建红曲醋专用醋酸菌菌株；复筛福建红曲醋专用醋酸菌菌株，比较不同初筛菌株的产酸能力，能在高于4%乙醇的培养基中快速产酸的菌株即为福建红曲醋中专用醋酸菌菌株。所述菌株为Y5052和Y5072。经鉴定，Y5052和Y5072均为木糖葡糖酸醋杆菌。采用两个关键技术。一是采用添加红曲酒富集醋母中目标菌株，二是采用高浓度乙醇培养基平板，使醋酸菌菌株可以在平板上形成水解透明圈，增加筛选的成功率。采用的在醋母中添加红曲酒的富集方法和在平板中添加高浓度乙醇的筛选方法，可简化筛选过程，提高筛选效率。
【专利说明】一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食醋，尤其是涉及一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法。
【背景技术】
[0002]食醋是我国传统的酿造调味品，能增进食欲、抑制病菌、帮助消化，在人们饮食生活中不可缺少。食醋是用粮食(粮谷类、薯类等)等淀粉质为原料，经不同种类微生物完成糖化、酒精发酵、醋酸发酵等阶段酿制而成。食醋的主要成分为醋酸(3%~5%)，还含有各种氨基酸、有机酸、糖类、维生素、醇和酯等营养成分及风味成分，具有独特的色、香、味。
[0003]食醋的生产工艺可分为固态发酵、液态发酵两大类。民间传统食醋采用固态发酵工艺，中、小型企业也有采用液态发酵工艺，这些工艺一般只能生产普通型的食醋。随着社会经济发展和人们生活水平提高，市场需要高档型食醋调味品。福建红曲醋是我国四大传统名醋之一，具有独特的风味和保健效果。传统特色高档食醋一般都具有工艺独特、产量较低等特点，无法实现工业规模生产，不能满足市场的需求。需要采用现代生物工程技术改造传统工艺，提高产品质量和产量，满足社会需要。
[0004]传统固态发酵工艺利用自然接种的多菌株醋酸菌生产食醋，现代液态发酵工艺采用单一纯菌接种发酵，但风味较差。福建红曲醋也为液态发酵，但采用多年醋母作为接种剂，产品风味独特，显然在这种醋母中存在一些特定的醋酸菌菌株。已有很多关于分离醋酸菌的研究，一般广泛取样，包括醋母、醋样、食醋生产环境的土样，等等。自然环境中微生物的种类繁多，每一种微生物种类所占比例很低。欲分离某特定菌种，研究者需要先采取富集措施，以增加该菌种在样品微生物总数量的比例，因此在分离纯化之前采用适当的富集技术将是成功获得目的菌种的关键。在分离醋酸菌菌种的工作中研究者多是采取添加葡萄糖、或者乙醇以富集醋酸菌。福建红曲醋的酿造采用了独特的保存多年的醋母，该醋母含酸量达6%~8%，远远大于一般食醋中醋酸3%~5%的含量，在这种环境中原来占优势的醋酸菌本身也受到抑制，数量大幅度下降；若是采取这种醋母作为样品，直接采用稀释平板法分离醋酸菌很难获得成功。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种福建红曲醋中专用醋酸菌。
[0007]所述筛选福建红曲 醋中专用醋酸菌菌株的方法，包括以下步骤:
[0008]1)以红曲酒为碳源富集福建红曲醋专用醋酸菌:
[0009]将糯米加第一次水浸泡，淘洗，浙干，蒸汽加热，摊凉后装入坛中，加入红曲和第二次水，搅匀后扎坛口，控制温度低于34°C，维持40~45天，中间搅拌4~5次，即制得红曲酒酒酿；再经过滤，加热后，即制得红曲酒；在红曲酒中加入红曲醋醋母，保持温度低于34°C，时间5~35天，即制得富集福建红曲醋专用醋酸菌菌株的富集培养物；
[0010]2)初筛福建红曲醋专用醋酸菌菌株:[0011]先制备醋酸菌选择性培养基，再制备醋酸菌选择性培养基平板；稀释步骤I)制得的富集福建红曲醋专用醋酸菌菌株的富集培养物，稀释的浓度依次为:10^10-2…、…至10_8，分别取各浓度稀释液100 μ L涂在醋酸菌选择性培养基平板上，倒置培养，挑选醋酸菌选择性培养基平板上周围出现的透明水解圈的菌落，在醋酸菌选择性培养基平板上划线纯化，然后接种于醋酸菌选择性培养基斜面上，即得到初筛的福建红曲醋专用醋酸菌菌株；
[0012]3)复筛福建红曲醋专用醋酸菌菌株:
[0013]制备产酸培养基，将步骤2)初筛的福建红曲醋专用醋酸菌菌株接种于盛有IOOmL产酸培养基的三角瓶中，第一次摇床培养，即得初筛菌株种子液；再取IOOmL产酸培养基至三角瓶中，接入ImL初筛菌株种子液，第二次摇床培养，即得初筛菌株菌液，然后测定初筛菌株菌液的产酸能力，具体方法为:吸取初筛菌株菌液200 μ L，加1.8mL无菌水稀释10倍，滴加I~2滴0.1%的酒精酚酞溶液，用0.lmol/L NaOH溶液滴定至微粉色，记录下消耗的
0.lmol/L NaOH溶液的体积，初 筛菌株产酸量为:
[0014]X (g/L)=VNaOHXCNaOHX0.060X100/V
[0015]其中，VNa0H——测定用试样消耗NaOH标准液体积，mL ；
[0016]C_——NaOH标准溶液的浓度，mol/L ；
[0017]0.060-与 1.0mL NaOH 标准溶液[C(NaOH)=L 000mol/L]相当乙酸的质量，g ；
[0018]V-试样体积，mL ；
[0019]产酸量X——试样中总酸含量(以乙酸计)，g/L ；
[0020]比较不同初筛菌株的产酸能力，能在高于4%乙醇的培养基中快速产酸的菌株即为福建红曲醋中专用醋酸菌菌株。
[0021]在步骤I)中，所述糯米、第一次水、红曲、第二次水、红曲醋醋母与红曲酒的质量比可为20: 40: (I~2): (30~40): (20~40): (10~20);所述浸泡的时间可为15~18h ;所述淘洗可采用清水淘洗3~4遍；所述蒸汽加热的时间可为15~25min ;所述摊凉可摊凉至40~45°C ;所述红曲可采用市售红曲；所述扎坛口可采用报纸扎坛口 ；所述过滤可采用布袋压榨过滤；所述加热的条件可在80~95°C下加热5~20min。
[0022]在步骤2)中，所述醋酸菌选择性培养基的组成按质量百分比可为:葡萄糖5%~10%,蛋白胨0.5%，酵母粉1%，CaC03l%,琼脂1.5%~2%，无水乙醇1.5%~8%，余量为水；所述醋酸菌选择性培养基的制备方法可为:葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、CaCO3、琼脂和水混合，121°C灭菌20min，灭菌后冷却至45~55°C，再加无水乙醇，即得醋酸菌选择性培养基；所述稀释可采用十倍稀释法；所述倒置培养的条件可在25~32°C倒置培养3~7天。
[0023]在步骤3)中，所述产酸培养基按质量百分比的组成可为:葡萄糖1%~4%，酵母粉1%，无水乙醇1%~8%，余量为水，pH5.5~7.5 ;所述第一次摇床培养的条件可为在25~320CUOO~180r/min的摇床中培养24h ;所述第二次摇床培养的条件可为在25~32°C、100~180r/min的摇床中培养48~120h。
[0024]在步骤3)中，所述0.lmol/L NaOH溶液的制备方法可为:称取0.4g NaOH固体，用纯水溶解后用容量瓶定容至IOOmL ;所述0.1%的酒精酚酞溶液的制备方法可为:称取
0.025g酚酞粉末溶于无水乙醇中，用容量瓶定容至25mL。
[0025]所述福建红曲醋中专用醋酸菌菌株为:
[0026]1.(Gluconacetobacter swingsii)Y5052,所述(Gluconacetobacter swingsii)Y5052已于2013年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.8494。
[0027]2.(Gluconacetobacter swingsii)Y5072,所述(Gluconacetobacter swingsii)Y5072已于2013年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.8495。
[0028]经鉴定，(Gluconacetobacterswingsii) Y5052 和(Gluconacetobacterswingsii) Y5072均为木糖葡糖酸醋杆菌。生理生化学分析发现，(Gluconacetobacterswingsii)Y5052 的发酵产酸速度较慢，(Gluconacetobacter swingsii)Y5072 的发酵产酸速度较快。
[0029]本发明采用两个关键技术。一是采用添加红曲酒富集醋母中目标菌株，二是采用高浓度乙醇培养基平板，使醋酸菌菌株可以在平板上形成水解透明圈，增加筛选的成功率。本发明采用的在醋母中添加红曲酒的富集方法和在平板中添加高浓度乙醇的筛选方法，可简化筛选过程，提高筛选效率。
【具体实施方式】 [0030]以下实施例将对本发明作进一步的说明。
[0031]实施例1:
[0032]菌株的筛选，具体操作步骤如下:
[0033]1.以红曲酒为碳源富集福建红曲醋专用醋酸菌
[0034]1.1.制备红曲酒酒酿
[0035]取糯米20kg,清水淘洗,加水40kg浸泡18h ;清水淘洗4遍、浙干；在蒸锅中将糯米蒸汽加热20min，摊凉至42°C ;将蒸煮后的糯米饭移至坛中，加入市售红曲1.5kg，水30kg，搅匀；用报纸扎坛口，控制温度低于32°C，维持45天，中间搅拌4~5次，即制得红曲酒酒酿。
[0036]1.2.制备红曲酒
[0037]将前述红曲酒酒酿经布袋压榨过滤，85°C加热lOmin，即制得红曲酒。
[0038]1.3.富集福建红曲醋专用醋酸菌
[0039]取传统红曲醋醋母30kg，添加所制得的红曲酒15kg，保持温度低于30°C，时间15天，制得富集福建红曲醋专用醋酸菌菌株的富集培养物。
[0040]2.筛选福建红曲醋专用醋酸菌菌株
[0041]2.1.制备醋酸菌选择性培养基
[0042]选择性培养基配方:葡萄糖7%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，CaC03l%,琼脂1.5%7，121°C灭菌20min，灭菌后冷却至50°C，加6%无水乙醇，制得醋酸菌选择性培养基，制备醋酸菌选择性培养基平板备用。
[0043]2.2.初筛过程
[0044]采用十倍稀释法，稀释上述富集福建红曲醋专用醋酸菌的富集培养物，稀释的浓度依次为:10_\10_2...、…至10_8，分别取各浓度稀释液100 μ L涂在选择性培养基平板上，32°C倒置培养7天；挑选选择性培养基平板上周围出现透明水解圈的菌落，在选择性培养基平板上划线纯化，然后接种于选择性培养基斜面上，得到12株福建红曲醋专用醋酸菌初筛菌株。
[0045]3.复筛福建红曲醋专用醋酸菌优良菌株
[0046]3.1.产酸培养基
[0047]产酸培养基配方如下:葡萄糖1%~4%,酵母粉1%,无水乙醇6%, pH6.0。
[0048]3.2.制备种子液
[0049]从初筛菌株的选择性培养基斜面上挑取少量待测菌株接种于盛有IOOmL产酸培养基的150mL三角瓶；在32°C、150r/min的摇床中培养24h，即制得初筛菌株种子液。[0050]3.3.制备菌液
[0051]取IOOmL产酸培养基至150mL三角瓶，接入ImL初筛菌株种子液，在30°C、150r/min的摇床中培养72h，即制得初筛菌株菌液。
[0052]3.4.测定初筛菌株的产酸能力
[0053]采用常规的测定总酸的方法测定初筛菌株的产酸能力。
[0054]制备0.lmol/L NaOH溶液:称取0.4g NaOH固体，用纯水溶解后用容量瓶定容至IOOmL0制备0.1%酒精酚酞:称取0.025g酚酞粉末溶于无水乙醇中，用容量瓶定容至25mL。
[0055]吸取初筛菌株菌液0.2mL,加1.8mL无菌水稀释10倍，滴加I~2滴0.1%的酒精酚酞溶液，用0.lmol/L NaOH溶液滴定至微粉色，记录下消耗的0.lmol/L NaOH溶液的体积。
[0056]初筛菌株产酸量X (g/L)=V_XC_X0.060X100/V
[0057]V_——测定消耗NaOH标准液体积，mL
[0058]C_——NaOH标准溶液的浓度，mol/L
[0059]0.060-与 1.0mT, NaOH 标准溶液[C(NaOH)=L 000mol/L]相当乙酸的质量，g
[0060]V——初筛菌株菌液体积，mL
[0061]产酸量X——试样中总酸含量(以乙酸计)，g/L
[0062]得到12株初筛菌株的产酸量，比较12株初筛菌株的产酸量，发现其中一株编号为Y5052菌株培养6天产酸量大于10g/L，耐乙醇浓度达6%，耐酸；Y5052菌株即为福建红曲醋专用醋酸菌。经鉴定Υ5052菌株为木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter swingsii)。
[0063]实施例2:
[0064]具体操作步骤如下:
[0065]1.以红曲酒为碳源富集福建红曲醋专用醋酸菌
[0066]1.1.制备红曲酒酒酿
[0067]同上，略。
[0068]1.2.制备红曲酒
[0069]同上，略。
[0070]1.3.富集福建红曲醋专用醋酸菌
[0071]同上，略，但25天结束富集过程。
[0072]2.筛选福建红曲醋专用醋酸菌菌株
[0073]2.1制备选择性培养基[0074]配方同上，略；加入5%乙醇，制备平板备用。
[0075]2.2.初筛过程
[0076]配方同上，略。得14株醋酸菌初筛菌株
[0077]3.复筛
[0078]3.1.产酸培养基
[0079]配方同上,但无水乙醇7%, ρΗ5.5。
[0080]3.2.制备种子液[0081]过程同上，略。
[0082]3.3.制备菌液
[0083]取IOOmL产酸培养基至150mL三角瓶，接入ImL初筛菌株种子液，在32°C、180r/min的摇床中培养96h,即制得初筛菌株菌液。
[0084]3.4.测定初筛菌株的产酸能力
[0085]测定14株初筛菌株的产酸量，发现其中编号Y5072菌株培养6天产酸量大于24g/L，耐乙醇浓度大于6%，耐酸，Y5072菌株即为福建红曲醋专用醋酸菌。经鉴定Y5072菌株为木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter swingsii)。
【权利要求】
1.一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)以红曲酒为碳源富集福建红曲醋专用醋酸菌: 将糯米加第一次水浸泡，淘洗，浙干，蒸汽加热，摊凉后装入坛中，加入红曲和第二次水，搅匀后扎坛口，控制温度低于34°C，维持40~45天，中间搅拌4~5次，即制得红曲酒酒酿；再经过滤，加热后，即制得红曲酒；在红曲酒中加入红曲醋醋母，保持温度低于34°C，时间5~35天，即制得富集福建红曲醋专用醋酸菌菌株的富集培养物； 2)初筛福建红曲醋专用醋酸菌菌株: 先制备醋酸菌选择性培养基，再制备醋酸菌选择性培养基平板；稀释步骤I)制得的富集福建红曲醋专用醋酸菌菌株的富集培养物，稀释的浓度依次为dO'lO—2...、…至10_8，分别取各浓度稀释液100 μ L涂在醋酸菌选择性培养基平板上，倒置培养，挑选醋酸菌选择性培养基平板上周围出现的透明水解圈的菌落，在醋酸菌选择性培养基平板上划线纯化，然后接种于醋酸菌选择性培养基斜面上，即得到初筛的福建红曲醋专用醋酸菌菌株； 3)复筛福建红曲醋专用醋Ife囷囷株: 制备产酸培养基，将步骤2)初筛的福建红曲醋专用醋酸菌菌株接种于盛有IOOmL产酸培养基的三角瓶中，第一次摇床培养，即得初筛菌株种子液；再取IOOmL产酸培养基至三角瓶中，接入ImL初筛菌株种子液，第二次摇床培养，即得初筛菌株菌液，然后测定初筛菌株菌液的产酸能力，具体方法为:吸取初筛菌株菌液200 μ L，加1.8mL无菌水稀释10倍，滴加I~2滴0.1%的酒精酚酞溶液，用0.lmol/L NaOH溶液滴定至微粉色，记录下消耗的 0.lmol/L NaOH溶液的体积，初筛菌株产酸量为:
X (g/L) =V臟 X CNa0H X 0.060 X 100/V 其中，VNa(B——测定用试样消耗NaOH标准液体积，mL ； CNa0H——NaOH标准溶液的浓度，mol/L ； 0.060——与1.0mL NaOH标准溶液[C(NaOH)=L 000mol/L]相当乙酸的质量，g ； V-试样体积，mL ； 产酸量X——试样中总酸含量，以乙酸计，g/L ； 比较不同初筛菌株的产酸能力，能在高于4%乙醇的培养基中快速产酸的菌株即为福建红曲醋中专用醋酸菌菌株。
2.如权利要求1所述一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，其特征在于在步骤I)中，所述糯米、第一次水、红曲、第二次水、红曲醋醋母与红曲酒的质量比为20: 40:(I ~2): (30 ~40): (20 ~40): (10 ~20)。
3.如权利要求1所述一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，其特征在于在步骤I)中，所述浸泡的时间为15~18h ;所述淘洗可采用清水淘洗3~4遍；所述蒸汽加热的时间可为15~25min ;所述摊凉可摊凉至40~45°C ;所述红曲可采用市售红曲；所述扎坛口可采用报 纸扎坛口 ；所述过滤可采用布袋压榨过滤；所述加热的条件可在80~95°C下加热5~20min。
4.如权利要求1所述一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，其特征在于在步骤2)中，所述醋酸菌选择性培养基的组成按质量百分比为:葡萄糖5%~10%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，CaC03l%，琼脂1.5%~2%，无水乙醇1.5%~8%，余量为水。
5.如权利要求1所述一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，其特征在于在步骤2)中，所述醋酸菌选择性培养基的制备方法为:葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、CaCO3、琼脂和水混合，121°C灭菌20min，灭菌后冷却至45~55°C，再加无水乙醇，即得醋酸菌选择性培养基。
6.如权利要求1所述一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，其特征在于在步骤2)中，所述稀释采用十倍稀释法；所述倒置培养的条件可在25~32°C倒置培养3~7天。
7.如权利要求1所述一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，其特征在于在步骤3)中，所述产酸培养基按质量百分比的组成为:葡萄糖1%~4%，酵母粉1%，无水乙醇1%~8%，余量为水，pH5.5~7.5 ;所述第一次摇床培养的条件可为在25~32°C、100~180r/min的摇床中培养24h ;所述第二次摇床培养的条件可为在25~32°C、100~180r/min的摇床中培养48~120h。
8.如权利要求1所述一种筛选福建红曲醋中专用醋酸菌菌株的方法，其特征在于在步骤3)中，所述0.lmol/L NaOH溶液的制备方法为:称取0.4g NaOH固体，用纯水溶解后用容量瓶定容至IOOmL ;所述0.1%的酒精酚酞溶液的制备方法可为:称取0.025g酚酞粉末溶于无水乙醇中，用容量 瓶定容至25mL。
9.(Gluconacetobacter swingsii)Y5052,已于 2013 年 11 月 21 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.8494。
10.(Gluconacetobacter swingsii) Y5072,已于 2013 年 11 月 21 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.8495。
【文档编号】C12R1/01GK103834598SQ201410089140
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】董志刚, 周素珊, 何云龙 申请人:厦门惠尔康食品有限公司