一种液态深层发酵生产猪苓菌粉的方法
【专利摘要】本发明提供了一种液态深层发酵生产猪苓菌粉的培养基和发酵条件。该发酵方法依次经斜面培养、一级和二级摇瓶种子的制备，最后将种子移入发酵罐中进行生产，所得的发酵液经菌粉制备工艺后得到猪苓菌粉。该方法的发酵周期仅为60-80h，菌体产率可到1.2％，同时菌粉具有高达5.29％的多糖含量(用硫酸-蒽酮法测定)和可靠的食品安全性。
【专利说明】一种液态深层发酵生产猪苓菌粉的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药用真菌的发酵工程领域，具体涉及一种液态深层发酵生产猪苓菌粉的方法。
技术背景
[0002]猪茶[Polyporus umbellatus (Pers.) Fries]是一种药用真菌。我国古文献中有许多关于猪苓的记载。《本经》记载其主痃疟、利水道。《药性论》记载其解伤寒温疫大热、发汗、主肿胀、满腹急痛。《本草求真》其文曰猪苓，凡四苓、五苓等方，并皆用此，性虽有类泽泻，同人膀胱肾经，解热除湿，行窍利水，然水消则脾必燥，水尽则气必走；泽泻虽同利水，性亦类燥，然咸性居多，尚有润存，泽虽治火，性亦损气，然润能滋阴，尚有补在。故猪必合泽泻以同用，则润燥适均，而无偏陂之患矣。《神农本草经》将猪苓列为上品，是利水渗湿的常用药。用于小便不利，水肿、泄泻、淋浊、带下等症。在20世纪70年代，日本的T Miyazaki和N Oikawa首次从猪苓菌核中提取出猪苓多糖，经临床证明是具有药理作用的有效组分。临床上猪苓多糖用于原发性肺癌、肝癌、子宫颈癌、鼻咽癌、食道癌和白血病等放化疗的辅助治疗。
[0003]目前已报道的猪苓发酵生产专利，主要有栽培生产和固体发酵生产方式(见中国专利号 CN1332019C、CN101849476、CN101080989B、CN1912199B、CN100469868C 和CN101080989B)。栽培猪苓存在非常不利的因素:(I)受其生物学特性的影响，菌核从萌发到成熟至少需要3年以上的时间，以至于猪苓菌核在药材市场上始终是供不应求；(2)猪苓的林地栽培还需要消耗大量木材，会破坏森林资源。固态发酵生产猪苓一般也需要较长时间(一般20d以上) ，且菌丝体生长期间容易受到污染。因此亟待开发新的猪苓生产方式。液态发酵技术具有大规模连续化生产、产量高、发酵周期短、活性成分高和生产效益高等优点，较栽培和固体发酵生产具有无可比拟的优势，其必将成为猪苓的主要生产方法。然而已报道的液体发酵生产猪苓存在着发酵周期较长、需与蜜环菌共发酵或研发规模小等缺点(见中国专利号CN1332019C、CN101294139A和CN101948760)。为此本发明公开一种新的液体发酵生产猪苓菌粉的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是通过液体深层发酵技术，较大规模的生产出较经济、食用安全和多糖成分较高的猪苓菌粉。
[0005]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0006]一种液态深层发酵生产猪苓菌丝体的方法，包括以下步骤:
[0007](I)菌种的斜面培养:将菌种接入PDA斜面培养基中，培养温度25-28 °C，培养2-4d，得到斜面菌种；
[0008](2)种子的制备:将斜面菌种接入装有种子培养基的摇瓶中，培养温度25_28°C，转速100-150rpm，培养2_4d，获得一级摇瓶种子；将一级摇瓶种子以体积比5%移入摇瓶中进行再扩大培养，培养温度25-28°C，转速100-150rpm，培养2_4d，得到二级摇瓶菌种；
[0009](3)发酵培养:将步骤(2)得到的适量种子转入装灭菌培养基的500L发酵罐中进行培养，培养温度25-28°C，罐压0.02-0.05Mpa,搅拌速率80_150rpm(2h搅拌5min)，通气量I: 0.8V / V*min~1: 1.5V / V.π?η，发酵60_80h后放罐(放罐标准为:发酵液变得粘稠，培养基菌PH降到3.0~4.0，菌丝体的浓度达到20~30g湿菌丝/ IOOmL)；
[0010](4)菌粉的加工:将发酵液经板框过滤后放置12-24h，在60_85°C的烘箱中烘6-12h，将菌粉经粉碎机进行粉碎，即为猪苓菌粉。
[0011]上述的猪苓菌的发酵方法，所涉及到的种子培养基配方为:葡萄糖10-20g / L，玉米粉 10-20g / L，豆柏粉 5-15g / L，VB1 10_20mg / L，KH2P04l_3g / L，MgSO4.7H20
0.5-lg / L，豆油0.5-1.5g / L，泡敌0.5-lg / L，其余为饮用安全水，pH5.5_6.0 (用食品级NaOH调节pH)；
[0012]上述的猪苓菌的发酵方法，所涉及到的发酵培养基配方为:玉米粉10_20g /L，葡萄糖 20-40g / L，豆柏粉 5-10g / L，麸皮 5-10g / L，KH2P04l_3g / L，MgSO4.7H20
0.5-lg / L7VB1 0.005-0.01g / L，豆油 0.5-1.5g / L，泡敌 0.5-lg / L，其余为饮用安全水，ρΗ5.0-7.0 (用食品级NaOH调节pH)。
[0013]本发明所述液态深层发酵生产猪苓菌丝体的方法，具有如下优点:(I)发酵周期仅60-80h，培养周期较短；(2)菌粉具有高的胞内多糖含量(硫酸-蒽酮法测定)，多糖含量最高达到5.29% ；(3)菌粉重金属铅、总砷不超国家限定标准。
【具体实施方式】
[0014]菌粉胞内多糖的提取和测定均参照《中华人民共和国药典》(2010版)。
[0015]重金属铅、总砷的测定和限定标准参照《食用菌卫生标准GB7096-2003》。
[0016]实例
[0017]本实例为最优的发酵培养基条件:(I)将菌种接入PDA斜面培养基中培养，培养温度28°C，培养2d，得到斜面菌种；(2)切取0.5cm2的斜面菌块接入装有200mL种子培养基的500mL摇瓶中培养，培养温度28°C，转速150rpm，培养2d，将一级种子以体积比5%转入到装有400mL种子培养基的IL的摇瓶中进行再扩大培养，培养温度28°C，转速150rpm，培养2d ； (3)将二级种子800mL转入到装已灭菌的300L发酵培养基的500L发酵罐中进行培养，培养温度28°C，罐压0.04Mpa，搅拌速率100rpm(2h转5min)，通气量I: 0.94V / V *min,发酵76h，发酵液中的菌丝体的浓度达到22g湿菌丝/ IOOmL,结束发酵放罐。(4)将发酵液经板框过滤放置24h后，在85°C的烘箱中烘12h，将菌粉用粉碎机进行粉碎，即为猪苓发酵菌粉。菌粉多糖含量为5.29%，菌粉得率1.2%，铅、总砷含量分别0.32ppm和0.035ppm，低于国家限定标准。
[0018]实例I所涉及的种子培养为:葡萄糖20g / L，玉米粉IOg / L，豆柏粉15g / L，VB1 20mg / L，KH2PO4Ig / L，MgS04.7H20 0.5g / L，豆油 0.5g / L，泡敌 Ig / L，pH5.5(用食品级NaOH调节pH)；
[0019]实例I所涉及的发酵培养为:玉米粉IOg / L，葡萄糖30g / L，豆柏粉5g / L，麸皮 5g / L，KH2PO4L 5g / L，MgSO4.7H20 0.75g / L，VB1 0.005g / L，豆油 0.5g / L，泡敌
0.5g / L，其余为饮用安全水，pH6.0(用食品级NaOH调节pH)。[0020]虽然本发明仅举一个具体实例，但明显本发明不限于以上实例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员可以很容易对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做 的任何修改或改进，均应认为本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种液态深层发酵生产猪苓菌丝体的方法，其特征包括如下具体步骤: (1)斜面培养:将菌种接入PDA斜面培养基中，培养温度25-28°C，培养2_4d； (2)种子的制备:将斜面菌种接入装有种子培养基的摇瓶中，培养温度25-28°C，转速100_150rpm,培养2_4d,获得一级摇瓶种子；将一级摇瓶种子以体积比5%移入摇瓶中进行再扩大培养，培养温度25-28°C，转速100-150rpm，培养2_4d，得到二级摇瓶菌种； (3)发酵生产:将发酵培养基装入500L发酵罐中，灭菌冷却后，调节pH值到5.5~6.5，将适量的二级种子接入500L发酵罐中培养，保持培养温度为25~28°C，搅拌速度为80~150rpm(2h转 5min)，通气量为 I: 0.8V/V.min ~I: 1.5V / V.π?η，罐压 0.02-0.05MPa，经60~80h培养后放罐； (4)菌粉的加工:将发酵液经板框过滤后放置12-24h，在60-85°C的烘箱中烘6-12h，将菌粉经粉碎机进行粉碎，即为猪苓菌粉。
2.根据权利要求1所述的猪苓菌的发酵方法，其特征是:所述的种子培养基为:葡萄糖 10-20g / L，玉米粉 10-20g / L，豆柏粉 5-15g / L，VB1 10_20mg / L，KH2P04l_3g /L, MgSO4.7H20 0.5-lg / L，豆油 0.5-1.5g / L，泡敌 0.5_lg / L，其余为饮用安全水，ρΗ5.5-6.0 (用食品级NaOH调节pH)。
3.根据权利要求1所述的猪苓菌的发酵方法，其特征是:所述的发酵培养基为:玉米粉 10-20g / L，葡萄糖 20-40g / L，豆柏粉 5-10g / L，麸皮 5_10g / L，KH2P04l_3g / L，MgSO4.7H20 0.5-lg / LjVB1 0.005-0.01g / L，豆油 0.5-1.5g / L，泡敌 0.5-lg / L，其余为饮用安全水，pH5.0-7.0 (用食品`级NaOH调节pH)。
【文档编号】C12R1/645GK103820334SQ201410097346
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】曾化伟, 乔洁, 饶胜齐, 李煜林, 孙见凡 申请人:曾化伟