一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的ssr引物及方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物包括引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304-F和下游引物ChQSSR304-R，所述上游引物ChQSSR304-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述下游引物ChQSSR304-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。还公开了一种玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，该引物和方法可对玲珑节瓜杂交种子及其母本、父本种子进行有效区分，快速、准确检测出杂交种子纯度，同时具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。
【专利说明】一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于杂交种子纯度鉴定【技术领域】，具体涉及一种玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定的SSR引物及鉴定玲珑节瓜杂交种子纯度的方法。
【背景技术】
[0002]种子纯度是种子质量检验的最主要的质量指标之一。植物新品种特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)的测试(简称 DSU 测试)是农业部植物新品种保护办公室对申请品种授予新品种权进行实质审查最重要的工作内容。
[0003]玲珑节瓜是杂交一代节瓜品种。制种时，亲本(父本和母本)繁种田、一代杂种制种田与其它品种或类型的节瓜、冬瓜材料须严格隔离，隔离距离1000米以上。制种时母本和父本按照一定比例分行种植，母本雌花开花前，母本植株逐一去雄。开花期利用昆虫媒介或者人工辅助的方法将父本的花粉授到母本的雌花柱头上，从而产生杂交种子。如果母本去雄不彻底，母本的花粉就有可能落到母本的雌花柱头上产生自交种子，出现假杂种，这是制种过程导致种子不纯的最主要原因；此外，如果父本行植株未能及时铲除，也有可能将父本果实混入杂交果实，造成混杂。因此杂交种子在销售前必须做纯度鉴定，符合国家对杂交种子纯度标准的才能出售给客户。
[0004]传统的节瓜杂种纯度鉴定都是在田间进行，根据植株的形态特征对杂种群体进行纯度识别，由于多数特征性状需要在结果期才能识别，杂种纯度鉴定通常需要2-3个月方可完成，所需周期长 ，并需占用土地和人力，且鉴定结果受环境影响大，不良气候、病虫为害和栽培水平均会使纯度鉴定准确性降低。20世纪后期，随着分子生物学的迅速发展，使从DNA分子水平上对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种快速、便捷、准确、有效的方法。目前，现有技术中仍未建立对节瓜杂交种子纯度鉴定方法。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的在于提供一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，该引物能产生母本特异性标记和父本特异性标记，特异性强。
[0006]本发明的目的还在于提供一种玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，该方法利用上述SSR引物，能快速、便捷、准确、有效的鉴定玲珑节瓜杂交种子纯度。
[0007]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物包括引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304_F和下游引物ChQSSR304-R,所述上游引物ChQSSR304_F的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物ChQSSR304-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304_F和下游引物ChQSSR304_R的具体核苷酸序列如下:
[0009]ChQSSR304-F:5，-GGGGCCTGAAAATGAAGTAA-3，(SEQ ID N0.1)；[0010]ChQSSR304-R:5’ -AAAACATGGTCTAGGGCTATGC-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0011]该标记带型清晰、重复性好，对PCR扩增产物进行凝胶电泳时，电泳结果显示，弓丨物ChQSSR304能产生185bp的父本特异性标记SSR304185 (序列如SEQ ID N0.3中所示)和156bp的母本特异性标记SSR304156 (序列如SEQ ID N0.4中所示)。
[0012]本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的:一种玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，含以下步骤:
[0013](I)提取节瓜幼苗的基因组DNA ；
[0014](2)以节瓜基因组DNA为模板，使用上述SSR引物ChQSSR304进行PCR扩增；
[0015](3)对扩增产物进行凝胶电泳；
[0016](4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，SSR引物ChQSSR304能产生185bp的父本特异性标记ChQSSR304185以及156bp的母本特异性标记ChQSSR304156。
[0017]在上述各步骤中:
[0018]本发明步骤⑵中PCR扩增时采用的反应体系优选为:基因组DNAlOng，10XPCRbuffer (含 Mg2+):2μ L,2.5Mm dNTP:1.5 μ L，SSR 引物 ChQSSR3040.25mmol.?Λ Taq 酶 IU，ddH20 补足至 20 μ L。
[0019]本发明步骤(2)中PCR扩增时扩增程序优选为:95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C终延伸7min，置于4°C保存。
[0020]本发明步骤(3)中凝胶电泳时优选采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0021]本发明具有如下优点:
[0022](I)本发明中的SSR引物ChQSSR304能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；
[0023](2)本发明的方法可将玲珑节瓜杂交种子与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；
[0024](3)本发明方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为是实施例1中玲珑节瓜种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱(M: marker I分子量标准；1:父本江心节6号；2:母本强雌系4号；3:商品种玲珑节瓜；圆圈内的条带为SEQ ID NO: 3，长方形内的条带为SEQ ID NO: 4)；
[0026]图2为实施例2中实验室内种植小苗种子纯度抽样鉴定的部分结果(M:markerl分子量标准；1:父本江心节6号；2:母本强雌系4号；21，31:假杂种；3-20，22-30, 32:抽样商品种玲珑节瓜)；
[0027]图3为实施例3中大丰基地玲珑节瓜种子纯度抽样的部分结果(M:markerl分子量标准；1:父本江心节6号；2:母本强雌系4号；3-30:抽样商品种玲珑节瓜)。
【具体实施方式】
[0028]实施例1杂交种玲珑节瓜种子纯度检测方法的建立[0029]1、筛选纯度鉴定的SSR引物
[0030]根据冬瓜转录组测序结果设计的引物若干对在亲本(父本江心节6号，母本强雌系4号)及子代间进行筛选，选出共显性差异标记条带的引物ChQSSR304，该标记带型清晰、重复性好，序列如下所示:
[0031 ] ChQSSR304-F: 5，-GGGGCCTGAAAATGAAGTAA-3，(SEQ ID NO:1)
[0032]ChQSSR304-R:5，-AAAACATGGTCTAGGGCTATGC-3’ (SEQ ID NO:2) ?
[0033]以节瓜基因组DNA为模板，使用上述SSR引物ChQSSR304进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果显示，SSR引物ChQSSR304能产生185bp的父本特异性标记ChQSSR304185以及156bp的母本特异性标记ChQSSR304156。
[0034]2、利用上述特异性引物对杂交节瓜玲珑节瓜种子进行纯度鉴定
[0035]2.1节瓜DNA的提取
[0036]实验材料为节瓜玲珑节瓜实验种及其父本(江心节6号)、母本(强雌系4号)子叶DNA，步骤如下:
[0037]①取一片子叶放入2mL离心管中，加入液氮用研磨杵研磨，在液氮快蒸干时迅速加入1000 μ L2% CTAB提取液，混匀后置于65°C水浴50min (每隔IOmin摇匀一次)；
[0038]②静置至室温 后离心，12000rmp, IOmin,取上清(约800 μ L)转移至新的2mL离心管；
[0039]③加入与步骤2中上清液等体积的酚:氯仿:异戊醇混合物，该混合物中各组分的体积比为25:24:1 ;剧烈震荡，静置5min，12000rmp，10min，取上清液(约SlOyL)转入
1.5mL离心管中；
[0040]④加入2/3体积340 μ L预冷的异丙醇，缓慢摇匀(缓慢颠倒20次)，置于_20°C下培养Ih ；
[0041]⑤离心，4°C, 13000rmp, IOmin,弃上清，用预冷的75%乙醇(体积百分比)洗漆DNA1-2次，放在超净工作台上吹干；
[0042]⑥加入100 μ L TE溶解。
[0043]2.2SSR-PCR 扩增
[0044]PCR 体系(20 μ L)
[0045]
【权利要求】
1.一种用于玲珑节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其特征是:所述引物包括引物ChQSSR304的上游引物ChQSSR304-F和下游引物ChQSSR304_R，所述上游引物ChQSSR304_F的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物ChQSSR304-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.—种玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征是:含以下步骤: (1)提取节瓜幼苗的基因组DNA； (2)以节瓜基因组DNA为模板，使用权利要求1中的引物ChQSSR304进行PCR扩增； (3)对扩增产物进行凝胶电泳； (4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，引物ChQSSR304能产生185bp的父本特异性标记ChQSSR304185以及156bp的母本特异性标记ChQSSR304156。
3.根据权利要求2所述的玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征是:步骤(2)中PCR扩增时采用的反应体系为:基因组DNAIOng，10XPCR buffer (含Mg2+) 2 μ L，2.5Mm dNTP:1.5 μ L，SSR 引物 ChQSSR3040.25mmol.?Λ Taq 酶 IU，ddH20 补足至 20 μ L。
4.根据权利要求2所述的玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征是:步骤(2)中PCR扩增时扩增程序为:95°C预变性3min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环后，72°C终延伸7min，置于4°C保存。
5.根据权利要求2所述的玲珑节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征是:步骤(3)中凝胶电泳时采用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
【文档编号】C12Q1/68GK103993070SQ201410119286
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】何晓明, 彭庆务, 郭明鑫, 谢大森, 江彪, 罗少波, 黄智文, 刘文睿, 林毓娥, 刘洪彪 申请人:广东省农业科学院蔬菜研究所, 广东科农蔬菜种业有限公司