包含具有改变的性质的α-淀粉酶变体的组合物和方法
【专利摘要】本发明描述了涉及变体α-淀粉酶的组合物和方法，相对于对照α-淀粉酶，该变体α-淀粉酶具有改变的生化性质和有利的性能特性。该变体适用于多种工业应用，例如淀粉转化；乙醇生产；衣物、餐具洗涤；纸浆和纸生产、纺织品退浆和/或甜味剂生产。
【专利说明】包含具有改变的性质的α-淀粉酶变体的组合物和方法
[0001]本申请是发明人于2010年4月I日提交的题为“包含具有改变的性质的α-淀粉酶变体的组合物和方法”的中国专利申请201080014543.9的分案申请。
[0002]优先权
[0003]本申请要求2009年4月I日提交的美国临时申请系列号N0.61/165，813的优先权，该美国临时申请完整引入本文作为参考。
【技术领域】
[0004]本发明描述了涉及变体α -淀粉酶的组合物和方法，相对于对照α -淀粉酶，该变体α-淀粉酶具有改变的生化性质和有利的性能特性。该变体适用于多种工业应用，例如淀粉转化；乙醇生产；衣物、餐具洗涤；纸浆和纸生产；纺织品退浆和/或甜味剂生产。
【背景技术】[0005]淀粉是直链淀粉(15-30%w/w)和支链淀粉(70-85%w/w)的混合物。直链淀粉由α -1, 4连接的葡萄糖单位的线性链组成，具有从约60，000至约800，000的分子量(MW)。支链淀粉是分支多聚体，其每24-30个葡萄糖单位含有α_1，6分支点。其分子量可以高达I亿。
[0006]目前是通过酶催化方法从淀粉产生浓缩的葡萄糖糖浆形式的糖，该催化方法包括:(I)用α -淀粉酶将固体淀粉液化(或薄化)为约7-10平均聚合度的糊精，和(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)对产生的液化淀粉(B卩，淀粉水解物)的糖化作用。产生的糖浆具有高的葡萄糖含量。商业生产的大部分葡萄糖糖浆随后被酶促异构化为葡萄糖/果糖混合物，称为异构糖衆(isosyrup)。
[0007]α -淀粉酶(α -1, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε.C.3.2.1.1)是通过随机切割内在的α-1，4-糖苷键水解淀粉、糖原和有关的多糖的一类酶。这类酶具有多种重要的商业应用，例如在淀粉加工的初始阶段(液化)中、在纺织品的退浆中、在再生纸的脱墨中、在纸和纸衆工业中的淀粉修饰、在湿酿酒糟(wet corn mi 11 ing)中、在乙醇生产中、在甜味剂(例如糖)生产中、在饮料工业中、在酿造业中、在油田、在动物饲料和在去污剂基质中作为清洁剂。例如，这类酶可以在餐具和洗衣过程中用于去除淀粉污溃。
[0008]α -淀粉酶分离自多种细菌、真菌、植物和动物来源。工业上，许多重要的α -淀粉酶分离自芽孢杆菌(Bacilli)。一种表征的α-淀粉酶是嗜碱性芽孢杆菌物种(Bacillussp.)TS_23菌株的α-淀粉酶，该菌株产生至少五类呈现淀粉水解活性的酶。(Lin等人，Biotechnol.Appl.Biochem.28:61-68，1998)。虽然其在宽范围 pH 内(即，ρΗ4.7 至 10.8)稳定，芽孢杆菌物种TS-23菌株的α -淀粉酶的最适宜pH为9。虽然该酶在较低温度例如15-20°C也有活性，但是其最适宜温度为45°C。
[0009]还是需要变体淀粉酶(如α -淀粉酶)，该变体具有改变的生化特征，并且在工业应用中提供改善的性能。
[0010]发明概述[0011]本发明描述了涉及变体α -淀粉酶的组合物和方法，相对于对照α -淀粉酶，该变体α-淀粉酶具有改变的生化性质和有利的性能特性。该变体适用于多种工业应用，例如淀粉转化；乙醇生产；衣物、餐具洗涤；纸浆和纸生产；纺织品退浆和/或甜味剂生产。
[0012]在一个方面，提供了分离的α -淀粉酶变体，其中变体是具有淀粉酶活性的α -淀粉酶的成熟形式，并且在选自 1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26，28，29，30，32，35，36，37，50，51，52，53，54，55，56，59，60，70，71，72，73，75，78，83，87，90，91，93，94，95，104，105，107，108，110，112，113，116，118，125，126，128，129，130，131，134，136，138，142，144，147，149，150，152，154，156，158，160，161，162，165，166，168，169，170，172，174，177，178，182，183，185，189，192，195，197，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，236，237，246，250，254，255，257，264，267，269，270，272，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419，433，436，438，444，447，448、451、453、459、465、470、475、476、483和484的一个或多个位置上包含取代；其中该位置对应于SEQ IDΝ0:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中不同的氨基酸残基对一个或多个位置上的天然氨基酸残基的取代产生了具有稳定性测量的性能指数>1.0，活性测量的性能指数>1.0的α -淀粉酶变体。
[0013]在一些实施方案中，α -淀粉酶变体在选自7、29、35、53、60、72、87、108、116、126、128、129、130、131、134、136、138、142、156、161、165、178、182、185、189、192、195、197、202、210、214、217、221、234、246、269、303、310、337、340、374、401 和 438 的一个或多个位置上包
含取代，并且其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有活性测量的性能指数>1.5和稳定性测量的性能指数>1.0的α -淀粉酶变体。
[0014]在一些实施方案中，0-淀粉酶变体在选自2、7、22、25、28、30、37、70、75、83、87、91、93、108、128、160、165、178、182、183、217、269、270、279、283、298、305、306、310、320、374、375、376、407、419、475和476的一个或多个位置上包含取代，其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数>1.5和活性测量的性能指数>1.0的α -淀粉酶变体。
[0015]在一些实施方案中，α-淀粉酶变体在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476 和 483 的一个或多个位置上包含取代。
[0016]在相关方面，提供了分离的0-淀粉酶，其在选自83、125、128、131、160、178、182、183、185、189、279、305、319、320、379、407、433、453、475、476 和 483 的一个或多个位置上包
含取代，其中该位置对应于SEQ ID Ν0:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基，并且其中该取代提供了选自改善的清洁性能、改善的去污剂稳定性、改善的热稳定性和改善的蛋白质表达中的至少一中有益效果。
[0017]在另一相关方面，提供了分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的 α -淀粉酶的成熟形式，且其在选自 5、32、83、95、154、214、221、228、322、401、407、419、444、447、459、470、483和484的一个或多个位置上包含取代；其中该位置对应于SEQ IDNO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了这样的α -淀粉酶变体，该变体在ρΗ8下的活性、ρΗΙΟ下的活性、16°C下的活性、32°C下的活性的性能指数值为0.5或更高，在去污剂中的稳定性或热稳定性的性能指数值为0.5或更高。
[0018]在一些实施方案中，不同氨基酸残基选自:A、C、D、E、F、G、H、1、K、L、M.N、P、Q、R、
S、T、V、W和Y，条件是该不同氨基酸残基与天然出现的氨基酸残基不同。
[0019]在一些实施方案中，α -淀粉酶变体进一步包含在对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的243位上的取代。在一些实施方案中，任意前述α -淀粉酶变体进一步包含在对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的180和/或181位上的缺失。
[0020]在一些实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自亲本α -淀粉酶，其具有与选自SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID N0:13 和 SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列至少 75% 相同的氨基酸序列。
[0021]在一些实施方案中，α-淀粉酶变体具有与SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列至少75%的序列同一性。在一些实施方案中，α -淀粉酶变体具有与SEQ ID Ν0:2所示氨基酸序列至少80%的序列同一性。在一些实施方案中，α -淀粉酶变体具有与SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列至少90%的序列同一性。
[0022]在一些实施方案中，α-淀粉酶变体在选自对应于SEQ ID Ν0:2所示氨基酸序列的128、178、182、185和189的一个或多个位置上包含取代，其中该取代提供了改善的清洁性能或改善的去污剂稳定性。 [0023]在一些实施方案中，α -淀粉酶变体包含:
[0024]Ca)在125位的丙氨酸，
[0025]在128位的半胱氨酸，
[0026]在131位的异亮氨酸，
[0027]在165位的异亮氨酸，
[0028]在178位的亮氨酸，
[0029]在182位的甘氨酸，
[0030]在202位的酪氨酸，
[0031]在305位的精氨酸，
[0032]在319位的苏氨酸，或
[0033]在475位的精氨酸；
[0034](b)取代 N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K，和
[0035]选自S125A、T1311、T1651、F202Y和D319T的至少一种其他的取代；或
[0036](C)取代
[0037]N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K,
[0038]S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K,或
[0039]S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K ；
[0040]其中该变体任选的还包括在243位上的取代和/或180位和/或181位上的缺失；和
[0041]其中该位置对应于SEQ ID N0:2所示氨基酸序列。
[0042]在一些实施方案中，α -淀粉酶变体包含在位置475的取代。在一些实施方案中，α -淀粉酶变体包含在位置475的精氨酸。在一些实施方案中，α -淀粉酶变体还包含在位置243的取代和/或在位置180和/或位置181的缺失。
[0043]在 另一方面，提供了分离的α-淀粉酶的变体，其中，该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，且在选自 1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32，35，36，37，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，70，71，72，73，75，78，82，83，87，90，91，93，94，95，103，104，105，107，108，110，112，113，114，115，116，118，121，123，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，170，171，172，174，175，176，177，178，179，182，183，185，186，188，189，190，191，192，193，195，197，199，200，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，237，238，239，240，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，272，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408、419、433、436、438、444、447、448、451、453、459、465、479、475、483 和 484 的一个或多个位置包括取代；其中该位置对应于SEQ ID NO: 2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一些实施方案中，在一个或多个位置的取代是在1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个位置的取代。
[0044]在一些实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自亲本α -淀粉酶，其选自组BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK。在一些实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自亲本α-淀粉酶，其具有与由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 所组成的组的成员至少是75%相同的氨基酸序列。
[0045]在另一方面，提供了编码α -淀粉酶变体的分离核酸。在相关方面，提供了包括与启动子有效组合的分离核酸的表达载体。在另一方面，提供了包括表达载体的宿主细胞。
[0046]在另一方面，提供了包括α-淀粉酶变体的清洁组合物。在一些实施方案中，清洁组合物进一步包括至少一种选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶(perhydrolase)、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的其他酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶BPN'或其变体。在具体实施方案中，该至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶BPN' Y217L或其变体。
[0047]在另一方面，提供了清洁织物或硬表面的方法，其包括将织物或硬表面与该清洁组合物接触。在一些实施方案中，清洁组合物还包括至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，清洁组合物进一步包括至少一种选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的其他酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种其他酶是BPN' Y217L枯草杆菌蛋白酶。
[0048]在具体实施方案中，α -淀粉酶变体包含取代:
[0049]N128C+K178L+T182G+F202Y+S243Q+Y305R+D319T+G475K ；
[0050]S125A+N128C+K178L+T182G+S243Q+Y305R+G475K ;或[0051]S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+S243Q+Y305R+G475K。
[0052]在一些相关的实施方案中，本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自1、2、3、4、5、7、15、16、17、18、19、22、25、26、28、29、30、32、35、36、37，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，70，71，72，73，75，78，82，83，87，90，91，93，94，95，103，104，105，107，108，110，112，113，114，115，116，118，121，123，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158,159,160，161，162，164，165，166，167，168，169，170，171，172，174，175，176，177，178，179，182，183，185，186，188，189，190，191，192，，193，195，197，199，200，201，202，203，207，210，214，217，221，228，234，237，238，239，240，243，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，272，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，314，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408、419、433、436、438、444、447、448、451、453、459、465、479、475、483 和 484的一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID Ν0:2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与由SEQ ID Ν0:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的成员至少 75% (优选80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%)相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，该位置选自:1、2、3、4、5、7、16，17，18，19，22，25，26，28，29，30，32，35，36，37，57，60，70，71，72，73，75，78，82，83，87，90，91，93，94，95，103，104，105，108，112，114，115，116，118，121，123，125，126，128，129，130，131，13ο，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，171，172，174，175，176，177，178，179，182，183，185，186，189，190，191，192，193，195，197，199,202,207，214，217，221，228，234，237，238，243，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，272，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，318，319，320，322，323，336，337，338，339，340，344，359，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419，433，436，438，447，451，453，459，465，479、475 和 483，并且其中该位置对应于 SEQ IDΝ0:2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，该位置选自:1、2、3、4、5、7、16、17、18、19，22，25，26，28，29，30，32，35，36，37，57，60，70，71，72，73，75，78，82，83，90，91，93，94，95，103，104，105，108，112，114，115，116，118，121，123，125，126，128，129，130，131，132，134，135，136，138，140，142，144，147，149，150，152，154，156，158，159，160，161，162，164，165，166，167，168，169，171，172，174，175，176，177，178，179，185，186，189，190，191，192，193，195，197，199，202，207，214，217，221，228，234，237，238，246，250，254，255，257，264，266，267，268，269，270，273，275，279，283，284，298，301，303，305，306，310，311，318，319，322，323，336，337，338，339，340，344，374，375，376，377，379，381，382，393，394，399，401，407，408，419、433、436、438、447、451、453、459、465、479、475 和 483，并且其中该位置对应于SEQ ID Ν0:2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在优选的实施方案中，α-淀粉酶变体包含58位的酪氨酸和236位的丙氨酸，且其中该位置对应于SEQ ID NO: 2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α -淀粉酶变体包含243位的谷氨酰胺和475位的赖氨酸，且其中该位置对应于SEQ ID NO: 2所示的对照α -淀粉酶氨基酸序列编号。
[0053]本公开还提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自 182、183、305、320、379、407、419和475 的一至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID NO: 2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α -淀粉酶。在另一实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自这样的亲本α -淀粉酶，该亲本 α-淀粉酶具有与由 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ IDNO: 14 组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中，该取代包含Χ182Ν、Χ183Ν、X305Q、X320F、Χ379Α、X407D、X419S和Χ475Τ组成的组中的I至8个。在这些实施方案的亚组中，取代包含 Τ182Ν、G183N、Y305Q、Q320F、Ρ379Α、Q407D、T419S 和 G475T 组成的组中的 I 至 8个(例如，1、2、3、4、5、6、7 或 8 个)。
[0054]本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自 160、182、183、189、305、379 和 475 的 1-7 个(例如，1、2、3、4、5、6 或 7 个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID Ν0:2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α -淀粉酶。在优选的实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自这样的亲本α -淀粉酶，该亲本α -淀粉酶具有与 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ IDNO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%)相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该取代包含X160E、X182G、X183N、X189P、X305G、X379E和X475T组成的组中的I至7个。在这些实施方案的亚组中，取代包含Y160E、T182G、G183N、E189P、Y305G、P379E 和 G475T 组成的组中的 I 至 7 个(例如，1、2、3、4、5、6 或7个)。
[0055]本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自 125、182、214、279、305、319、320 和 475 的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7 或8个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID NO: 2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α -淀粉酶。在优选的实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自这样的亲本α -淀粉酶，该亲本 α-淀粉酶具有与 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 和 SEQ IDNO: 14 组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该取代包含Χ125Α、Χ182Α、X214Q、X279N、X305R、X319T、X320N和X475R组成的组中的I至8个。在这些实施方案的亚组中，取代包含 S125A、T182A、T214Q、T279N、Y305R、D319T、Q320N 和 G475R 组成的组中的 I至 8 个(例如，1、2、3、4、5、6、7 或 8 个)。[0056]本公开提供另一分离的α -淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自7、182、298、376、379、407、419和453的一个至八个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)位置上包含取代；并且其中该位置对应于SEQ ID NO: 2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α -淀粉酶。在优选的实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自这样的亲本α -淀粉酶，该亲本 α-淀粉酶具有与 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQID NO: 14 组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%,98%或99%)相同的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该取代包含X7H、X182W、X298Q、X376R、X379K、X407W、X419S和X453W组成的组中的I至8个。在这些实施方案的亚组中，取代包含 E7H、T182W、T298Q、Y376R、P379K、Q407W、T419S 和 L453W 组成的组中的 I至 8 个(例如，1、2、3、4、5、6、7 或 8 个)。
[0057]本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自128、178、182和185的一个至四个(例如，1、2、3或4个)位置上包含取代，并且该α-淀粉酶变体包含在243位的丝氨酸或谷氨酰胺，并且其中该位置对应于SEQ ID NO:2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α-淀粉酶。在优选的实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO: 12、SEQ ID NO : 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，该取代包含N128C、K178L、T182G和A185D1组成的组中的I至4个(例如，1、2、3或4个)。
[0058]本公开提供另一分离的α -淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自 125、182、183、189、279、305、319、379 和 475 的一个至九个(例如，1、2、3、4、
5、6、7、8或9个)位置上包含取代，并且该α -淀粉酶变体包含在320位的谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺，并且其中该位置对应于SEQ ID NO: 2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一个实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α -淀粉酶。在优选的实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自这样的亲本α -淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%)相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，该α -淀粉酶变体包含:在125位的丝氨酸或丙氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸；并且其中该位置对应于SEQ ID Ν0:2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。
[0059]本公开提供分离的α-淀粉酶变体，其中该变体是具有淀粉酶活性的成熟形式，并且在选自 125、128、178、182、183、189、279、305、319、379 和 475 的一个至 4^一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个)位置上包含取代，并且该α -淀粉酶变体包含在243位的丝氨酸或谷氨酰胺，和320位的谷氨酰胺、苯丙氨酸或天冬酰胺，并且其中该位置对应于SEQID ΝΟ:2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q和ACE-QK的亲本α -淀粉酶。在优选的实施方案中，α -淀粉酶变体衍生自这样的亲本α-淀粉酶，该亲本α-淀粉酶具有与SEQ ID NO: 2,SEQ ID ΝΟ:5、SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:1USEQID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 组成的组的任一成员至少 75% (优选 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，该α -淀粉酶变体包含:在125位的丝氨酸或丙氨酸；在128位的天冬酰胺或半胱氨酸；在178位的赖氨酸或亮氨酸；在182位的苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丙氨酸；在183位的甘氨酸或天冬酰胺；在189位的谷氨酸或脯氨酸；在279位的苏氨酸或天冬酰胺；在305位的酪氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或精氨酸；在319位的天冬氨酸或苏氨酸；在379位的脯氨酸或丙氨酸；和在475位的甘氨酸、苏氨酸或精氨酸；并且其中该位置对应于SEQ ID ΝΟ:2所示的对照α-淀粉酶氨基酸序列编号。在另一个优选的实施方案中，取代选自:N128C、Τ131Ι、T134P、Q138E、Y1601、T1651、T165V、K178L、T182A、T182C、T182D、T182M、T182F、T182N、T182G、T182P、T182Q、A185D、A185E、E189P、S243D、S243E 和 S243Q。
[0060]使用示例性α -淀粉酶作为起点，即“骨架”，制备和测试本文描述的氨基酸突变，然而，可以理解可以在相关的α-淀粉酶中制备相当的氨基酸突变，其预期制备相似的效应和产生相似的优点。其他用作骨架的示例性的α-淀粉酶包括但不限于本文中鉴别的那些。[0061]本公开进一步提供了编码任意前述段落中的α -淀粉酶变体的分离的核酸。在一个实施方案中，包括了这样的表达载体，该表达载体包含与启动子有效组合的分离的核酸。在另一实施方案中，包括了包含该表达载体的宿主细胞。另一实施方案提供了产生α-淀粉酶变体的方法，其包括:用包含编码α -淀粉酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；和在适合产生该α-淀粉酶变体的条件下培养转化的宿主细胞。另一实施方案进一步包括收获所产生的α-淀粉酶变体的步骤。另一实施方案包括作为宿主细胞的芽孢杆菌物种，且在另一实施方案中，该芽孢杆菌物种是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
[0062]本公开提供了清洁组合物，其包含任意前述段落的α-淀粉酶变体，进一步包含至少一种其他酶。在一个实施方案中，其他的酶是选自蛋白酶(包括但不限于枯草杆菌蛋白酶、中性金属蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶等)、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过氧化氢酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶。在另一实施方案中，清洁组合物是洗衣去污剂，在另一实施方案中，清洁组合物是洗碗去污剂。在另一实施方案中，清洁组合物是含漂白剂的洗衣和/或洗碗去污剂。在另一实施方案中，清洁组合物是用于织物的预处理，例如在洗涤之前应用。在另一实施方案中，清洁组合物是洗衣去污剂或洗碗去污剂的添加物。本公开进一步提供了清洁的方法，其包括将包含织物的表面和/或物品与包含该α-淀粉酶变体的清洁组合物接触的步骤。在一个实施方案中，方法是洗碗方法，其包括步骤:提供i)洗碗组合物，和ii)需要清洁的餐具；和在有效提供餐具清洁的条件下将餐具与洗碗组合物接触。在另一实施方案中，方法是织物清洁方法，其包括步骤:提供i)织物清洁组合物，和ii)需要清洁的衣物；和在有效提供衣物清洁的条件下将衣物与织物清洁组合物接触。在另一实施方案中，方法涉及将材料从编织的织物中的纱线上去除，如在纺织品脱浆的情况下。
[0063]根据本说明书，组合物和方法的这些和其他方面和实施方案是显而易见的。
[0064]附图简述
[0065]图1提供了 SEQ ID N0S:2和5_14分别所示的各种对照淀粉酶的成熟形式的比对。使用 MUSCLE3.7 多重序列比对算法(Edgar, Nucleic Acids Research, 32:1792-1797，2004)比对序列。
[0066]图2提供了含有地衣芽孢杆菌(B.licheniformis) LAT启动子(Plat)和来着pUBllO (McKenzie 等人，Plasmid, 15:93-103，1986)的其他元件的 pHPLT 载体的图，该其他元件包括复制酶基因(r印pUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)o
[0067]图3提供了 pHPLT-BASE质粒的图。
[0068]图4 提供了 pHPLT-ACE-S243Q 质粒的图。
[0069]图5提供了显示多个α-淀粉酶在洗衣去污剂应用中的洗涤性能的图图表。所测试的酶如下:W9 (BASE-S125A-N128C-K178L-T182G-S243Q-T279N-D319T-Q320N-G475R)；W10(BASE-N128C-K178L-T182G-S243Q-Y305R-D319T-G475R)；ffll (BASE-SI25A-N128C-KI78L-T182G-S243Q-Y305R-G475R);和 ACE-S243Q-G475K。
[0070]图6提供了显示多 个α -淀粉酶在洗衣去污剂应用中的洗涤性能的图表。所测试的酶如下:BASE-X8C、BASE-W10EK、ACE-QK和对照(基准的商业酶)。
[0071]图7A提供了显示在ACEa-淀粉酶和BPN' Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。图7B提供了显示在ACE-S243Q-G475K (ACE-QK) a -淀粉酶和BPN' Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。
[0072]图8 提供了显示在 BASE-X8C(W11-T131I_T165I) α-淀粉酶和 BPN' Y217L 枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。
[0073]图 9 提供了显示在 BASE WlOEK(BASE-N128C-K178L-T182G-S243E-Y305R-D319T-G475K) a -淀粉酶和BPN' Y217L枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。
[0074]图10 提供了显示在 ACE-S243Q-G475K(ACE-QK) a -淀粉酶和 BPN' Y217L 枯草杆菌蛋白酶在洗衣应用中的协同作用的图表。
[0075]发明详述
[0076]本发明描述了涉及淀粉酶变体，尤其涉及芽孢杆菌a -淀粉酶的变体的组合物和方法。本文所述淀粉酶变体具有该变得生化特征且在多种工业应用中显示出特别功效(例如洗衣和洗碗)。该变体以及用于使用变体的方法的各个特征将详细的描述如下。
[0077]1、Ct -淀粉酶变体的定义和系统命名
[0078]除非本文中另外定义，否则本文中所有的技术和科学术语都具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY,第 2 版，John Wiley 和 Sons, New York(1994)和 Hale&Markham, THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)为本领域技术人员提供了本文使用的许多术语的通用字典。
[0079]组合物和方法的一些方面取决于基因工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。下列资源包括了可用于本组合物和方法中的通用方法学的描述=SambiOOk等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL (第 2 版，1989);Kreigler, GENE TRANSFER ANDEXPRESSION ；A LABORATORY MANUAL (1990)和 Ausubel 等人编辑，CURRENT PROTOCOLS INMOLE⑶LAR B10L0GY(1994)。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。然而，本组合物和方法并非旨在限于所描述的任何特定的技术、方案和试剂，这是可以改变的。虽然任何与本文所述的相似或等价的方法和材料都可用于实践或测试本组合物和方法，但优选的方法和材料描述如下。
[0080]当描述蛋白质及其编码基因时，基因的名称一般是斜体且非大写的，而蛋白质的名称一般是非斜体且首字母大写。
[0081]除非文中明确地另外指出，单数形式“一个”、“这个”和“该”包含了复数含义。因此，例如，指代“一种酶”包括了复数的此种酶，指代“这个配方”包括了指代本领域技术人员已知的一个或多个配方及其等价物，如此类推。
[0082]本文中提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有序列，都通过引用清楚地合并到本文中。
[0083]1.1 定义
[0084]出于清楚的目的，定义下列术语。
[0085]如本文使用的，术语“淀粉”指包括植物糖类的复杂多糖的任何材料，包括具有通式(C6HltlO5)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数字。特别而言，该术语指任何基于植物的材料，包括但不限于谷粒、草、块茎和根，更特别的是小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、黍、马铃薯、甘薯和木薯粉(tapioca)。
[0086]如本文使用的，术语“淀粉酶”指能够催化淀粉降解的酶。一般而言，α-淀粉酶(EC3.2.1.1 ;a-D_(l — 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)是以随机方式切割淀粉分子内部的a-D-(l — 4)0-糖苷键的内切酶。相反，外切作用的淀粉水解酶，例如淀粉酶(EC3.2.1.2 ; a -D-(I — 4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶，如产麦芽糖(maltogenic) α -淀粉酶(EC3.2.1.133),从底物的非还原端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α -葡糖苷酶(EC3.2.1.20 ；a -D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3 ；a -D-(I — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖。如本文中使用的，淀粉酶包括任何/所有的淀粉酶，包括葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、淀粉酶和野生型α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属物种的淀粉酶，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的淀粉酶，同时，α -淀粉酶包括这些酶的上述亚组。
[0087]如本文中使用的，“芽孢杆菌属物种TS-23菌株α -淀粉酶”和类似的词组，指源自芽孢杆菌属物种TS-23菌株的α-淀粉酶。编码该α-淀粉酶的基因可以是编码该淀粉酶的野生型基因或密码子优化的多核苷酸。芽孢杆菌属物种TS-23菌株的成熟的α-淀粉酶(按从氨基至羧基的方向)是(SEQ ID NO:1):
[0088]
【权利要求】
1.分离的α-淀粉酶变体，其中所述变体是具有淀粉酶活性的α-淀粉酶的成熟形式，并且在185的位置上包含取代； 其中所述位置对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中的氨基酸残基；并且其中185位上的天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数>1.0，且活性测量的性能指数>1.0的α -淀粉酶变体。
2.权利要求1的分离的α-淀粉酶变体，其中天然氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基产生了具有稳定性测量的性能指数>1.5和活性测量的性能指数>1.0的α -淀粉酶变体。
3.权利要求1的分离的α-淀粉酶变体，其中所述取代提供了选自改善的清洁性能、改善的去污剂稳定性、改善的热稳定性和改善的蛋白质表达中的至少一中有益效果。
4.权利要求1-3中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其中所述不同氨基酸残基选自Α、C、D、Ε、F、G、H、1、K、L、Μ、N、P、Q、R、S、Τ、V、W和Y，条件是所述不同氨基酸残基与天然出现的氨基酸残基不同。
5.权利要求1-3中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其进一步包含在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的243位上的取代。
6.权利要求1-3中任 一项的分离的α-淀粉酶变体，其进一步包含在对应于SEQIDNO:2所示氨基酸序列的180位和/或181位上的缺失。
7.权利要求1-3中任一项的分离的α-淀粉酶变体，其中所述α -淀粉酶变体的氨基酸序列是: (a)下述氨基酸序列，所述氨基酸序列编码的核酸在严格杂交条件下与编码SEQIDNO:2所示氨基酸序列的核酸杂交；或 (b)下述氨基酸序列，其通过取代、缺失和/或插入一个或几个氨基酸衍生SEQIDNO:2所示氨基酸序列， 且具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列类似的功能。
8.权利要求1-3中任一项的α-淀粉酶变体，其中所述α -淀粉酶变体包含在185位的精氨酸； 其中所述变体任选还包含在243位上的取代，和/或在180位和/或181位上的缺失；和 其中所述位置对应于SEQ ID ΝΟ:2所示的氨基酸序列。
9.权利要求1-3中任一项的α-淀粉酶变体，其中所述α-淀粉酶变体衍生自选自BASE、ACE、ACE-Q 和 ACE-QK 的亲本 α -淀粉酶。
10.权利要求1-3中任一项的α-淀粉酶变体，其中所述取代提供了改善的清洁性能或改善的去污剂稳定性。
11.分离的核酸，其编码权利要求1-10中任一项的α-淀粉酶变体。
12.表达载体，其包含权利要求11的分离的核酸，所述分离的核酸与启动子有效组合。
13.宿主细胞，其包含权利要求12的表达载体。
14.清洁组合物，其包含权利要求1-10中任一项的α-淀粉酶变体。
15.权利要求14的清洁组合物，其进一步包含至少一种选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的其他酶。
16.权利要求15的清洁组合物，其中所述至少一种其他酶是蛋白酶。
17.权利要求16的清洁组合物，其中所述至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶。
18.权利要求17的清洁组合物，其中所述至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’或其变体。
19.权利要求18的清洁组合物，其中所述至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’ Y217L或其变体。
20.清洁织物或硬表面的方法，其包括将织物或硬表面与权利要求14的清洁组合物接触。
21.权利要求20的方法，其中所述清洁组合物进一步包含至少一种表面活性剂。
22.权利要求20或21的方法，其中所述清洁组合物进一步包含至少一种选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、果胶酸裂合酶和过氧化物酶的其他酶。
23.权利要求22的方法，其中所述至少一种其他酶是蛋白酶。
24.权利要求23的方法，其中所述至少一种其他酶是枯草杆菌蛋白酶。
25.权利要求24的方法，其中所述至少一种其他酶是BPN’Y217L枯草杆菌蛋白酶。
【文档编号】C12N15/75GK103923895SQ201410144033
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2010年4月1日 优先权日:2009年4月1日
【发明者】D·A·埃斯特尔, B·E·琼斯, M·科尔克曼, C·D·亚当斯, E·M·孔卡 申请人:丹尼斯科美国公司