来源于小麦的抗病性相关蛋白TaVIP2及其相关生物材料与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了来源于小麦的抗病性相关蛋白TaVIP2及其相关生物材料与应用。该抗病性相关蛋白TaVIP2是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质。实验证明TaVIP2以及与TaVIP2相关的生物材料可用于调控植物抗病性，特别是可用于调控烟草对白粉病的抗性。
【专利说明】来源于小麦的抗病性相关蛋白TaVI P2及其相关生物材料与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及来源于小麦的抗病性相关蛋白TaVIP2及其相关生物材料与应用。
【背景技术】
[0002]小麦白粉病(Powderymildew)是由小麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.Tritici, Bgt)引起的真菌性病害，过去仅在气候温和、潮湿、多雨的地区为害。20世纪60年代以来，随着小麦半矮杆品种的推广，氮肥施用量的增大，白粉病的危害日趋严重，在世界主要麦区由次要病害上升为主要病害，成为小麦生产的严重威胁。化学防治虽不无成效，但必然增加人力、物力投入，而且引起环境污染等问题。因此，培育和推广抗病品种是防治小麦白粉病最为经济、安全和有效的途径。优异的小麦抗源及抗病基因是小麦抗病育种的基础。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种来源于小麦的抗病性(如抗白粉病)相关蛋白TaVIP2及其相关生物材料与应用。
[0004]本发明提供的蛋白质为植物抗病性相关蛋白，名称为TaVIP2，来源于小麦CB037，是如下a)或b)的蛋白质:
[0005]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0006]b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质。
[0007]其中，序列表中的序列2由612个氨基酸残基组成。
[0008]上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列I所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0009]表1标签的序列
[0010]
标签残基序列
Poly-Arg5-6(通常为 5 个) RRRRR
Poly-His2-10(通常为 6个) HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strop-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL[0011]与TaVIP2相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
[0012]本发明所提供的与TaVIP2相关的生物材料，为下述BI)至B5)中的任一种:
[0013]BI)编码TaVIP2的核酸分子；
[0014]B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0015]B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体、或含有BI)所述表达盒的重组载体；
[0016]B4)含有BI)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[0017]B5)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有BI)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0018]其中，所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
[0019]上述生物材料中，BI)所述核酸分子具体可为如下I)或2)或3)所示的基因:
[0020]I)其编码序列是序列表中序列I的第1-1839位核苷酸的DNA分子；
[0021]2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码TaVIP2的DNA分子；
[0022]3)与I)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码TaVIP2的DNA分子。
[0023]这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(% )表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0024]其中，序列表中的序列I的编码序列是序列表中序列I的第1-1839位核苷酸，编码序列表的序列2所不的蛋白质。
[0025]上述严格条件可为在0.1 X SSPE (或0.1 X SSC), 0.1% SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗膜。
[0026]上述生物材料中，B2)所述的含有编码TaVIP2的核酸分子的表达盒(TaVIP2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaVIP2的DNA，该DNA不但可包括启动TaVIP2基因转录的启动子，还可包括终止TaVIP2转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于:组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于:花椰菜花叶病毒的组成型启动子CAMV35S ;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(LAP，Chao等人(1999)PlantPhysioll20:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关I (PRl)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267);四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pP128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于:农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见,例如:0dell等人(I985)Nature313:810 ;Rosenberg等人
(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mol.Gen.Genet, 262:141 ；Proudfoot(1991)Cell, 64:671 ；Sanfacon 等人 Genes Dev., 5: 141 ；Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ；Munroe 等人(1990)Gene, 91: 151 ;Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891 ；Joshi等人(1987) Nucleic Acid Res., 15:9627)。
[0027]在本发明的实施例中，所述TaVIP2基因表达盒中启动所述TaVIP2基因转录的启动子为CaMV35S启动子，终止所述TaVIP2基因转录的终止子为胭脂碱合成酶基因终止子Nos0
[0028]可用现有的植物表达载体构建含有所述TaVIP2基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pBI121、pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pCAMBIA1391_Xa 或pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标 记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0029]上述生物材料中，B4)所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。B5)所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。
[0030]实验证明TaVIP2、或上述与TaVIP2相关的生物材料可用于调控植物抗病性。
[0031]其中，所述抗病性具体可为抗白粉病。所述白粉病可由白粉病菌引起。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如烟草。在本发明的一个实施方式中，所述烟草为烟草NC89。
[0032]本发明还提供了具体的利用上述与TaVIP2相关的生物材料培育抗病性转基因植物的方法。
[0033]本发明所提供的培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入TaVIP2的编码基因(TaVIP2基因)得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物的步骤。
[0034]在本发明的实施例中，所述TaVIP2的编码基因通过含有TaVIP2基因表达盒的TaVIP2基因重组表达载体导入所述受体植物中。
[0035]上述方法中，其中所述TaVIP2基因可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果:
[0036]I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TaVIP2基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60% ；
[0037]2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
[0038]3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于受体物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0039]4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。[0040]5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
[0041]在本发明的一个实施例中，所述TaVIP2基因重组表达载体具体为pBI121-TaVIP2，所述 pBI121-TaVIP2 是用 pRTL2_TaVIP2 中的 HindIII 和 XbalI 位点间的片段(含有序列表中序列I的TaVIP2基因)替换pBI121中HindIII和XbalI之间的片段得到的重组表达载体；所述pRTL2-TaVIP2是用序列表中序列I的TaVIP2基因替换pRTL2的KpnI和XbalI位点间片段得到的重组载体。
[0042]所述TaVIP2基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach, 1998, Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463 ；Gei serson andCorey，1998，Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0043]上述方法中，所述白粉病可由白粉病菌，如二孢白粉菌引起。所述受体植物可为单子叶植物或双子叶植物，如烟草。在本发明的一个实施方式中，所述烟草为烟草NC89。
[0044]上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0045]将TaVIP2基因导入烟草中的分子检测与抗病性实验结果证明，TaVIP2基因过表达的转TaVIP2基因烟草的白粉病平均病级为I级，对照烟草的白粉病平均病级为9级。说明TaVIP2是一种与白粉病抗性相关的蛋白质，可利用转基因技术将TaVIP2基因导入受体植物以增强植物对白粉病的抗性。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1是克隆小麦CB037TaVIP2基因的PCR产物电泳图谱。左侧泳道为PCR产物，右侧泳道为DNA分子量标准。[0047]图2是部分过表达小麦TaVIP2基因的转基因烟草植株的Southern blot检测结果。CK为受体植株-未转基因的烟草NC89，P为pBI121-TaVIP2，其余为Ttl代单株。
[0048]图3是过表达小麦TaVIP2基因转基因烟草植株整株抗白粉病鉴定。TaVIP2表示T0代烟草/pBI121-TaVIP2，WT表示未转基因烟草植株。
[0049]图4是过表达小麦TaVIP2基因Ttl代烟草/pBI121_TaVIP2植株叶片抗白粉病鉴定。左侧叶片为Ttl代烟草/pBI121-TaVIP2，右侧叶片为未转基因烟草。
【具体实施方式】
[0050]以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0051]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为白常规生化试剂商店购买得到的。
[0053]克隆载体pMD_18T购白Takara公司。
[0054]下述实施例中的大肠杆菌T0P10购白北京市全式金公司。含有PRK2013质粒的大肠杆菌 T0P10 (Ely ( 1985)，Mol Gen Genet, 200:302-304)和根癌农杆菌 C58C1 (Ashby 等人
(1988)，T.Bacteriol.170(9):4181-4187)。
[0055]下述实施例中的烟草NC89(陈江华等人(2004)，中国烟草学报，10(5):20_27)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
[0056]下述实施例中的小麦CB037(别晓敏等人(2011)，植物遗传资源学报，12 (6):975-981)由本课题组陈孝研究员培育，本实验室保存，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
[0057]下述实施例中的植物表达载体pBI121 (Chen等人(2003), Molecular Breeding,11:287-293)和 pRTL2 (Restr印ο 等人(1990)，Plant Cell，2:987-998)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
[0058]下述实施例中的烟草白粉病菌为二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearumDC)(牟建英等人(2013)，植物遗传资源学报，14(4):668-672)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
[0059]实施例1、小麦TaVIP2基因的克隆
[0060]本发明的发明人首次从小麦基因组中获得TaVIP2基因(SEQ ID N0.1)，并首次发现该基因具有抗白粉病的功能，具体克隆方法如下:
[0061]提取小麦CB037叶鞘的总RNA,根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以Fl和Rl (Fl:AGAGGTACCATGTCAGGATCACTGAAT, Rl:AAATCTAGATTATAATCTAACGTTTTGGCTGG)为引物，进行PCR扩增，将得到的PCR产物进行电泳检测，结果如图1所示，该PCR产物的大小为1800bp左右。将得到的PCR产物连接到pMD18-T载体上，得到含有该PCR产物重组载体，将该重组载体命名为pMD-18T-TaVIP2，进行测序。测序结果表明该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列I所不，序列表中序列I即是TaVIP2基因的编码序列,编码序列表中序列2所不的蛋白质TaVIP2。序列表中序列2由612个氨基酸参见组成，其氨基酸序列与拟南芥VIP2序列相似性仅48%。
[0062]实施例2、白粉病转基因烟草的获得和抗病性鉴定
[0063]一、重组载体pBI121_TaVIP2的构建
[0064]根据TaVIP2 基因的序列设计引物 Fl 和 Rl (Fl:AGAGGTACCATGTCAGGATCACTGAAT,Rl:AAATCTAGATTATAATCTAACGTTTTGGCTGG)，以 pMD_18T_TaVlP2 为模板使用高保真酶 KOD进行PCR扩增，然后利用KpnI和XbalI限制性内切酶对PCR产物和pRTL2载体进行酶切，得到带酶切位点的目的基因TaVIP2和线性化质粒，将得到带酶切位点的目的基因TaVIP2和线性化质粒连接，连接产物热激转化到大肠杆菌ToplO菌株感受态细胞中，37°C培养8h后挑取单克隆，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并进一步测序验证，将测序结果表明用序列表中序列I的TaVIP2基因替换pRTL2的KpnI和XbalI位点间片段得到的重组载体命名为pRTL2-TaVIP20
[0065]然后再用限制性内切酶Hindi 11和Xbal I对pRTL2_TaVIP2和pBI 121进行酶切，得到带酶切位点的含有目的基因TaVIP2的片段和线性化质粒，将得到的带酶切位点的含有目的基因TaVIP2的片段和线性化质粒连接，连接产物热激转化到大肠杆菌ToplO菌株感受态细胞中，37°C培养8h后挑取单克隆，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并进一步测序验证，将测序结果表明用pRTL2-TaVIP2中的HindIII和XbalI位点间的片段(含有序列表中序列I的TaVIP2基因)替换pBI121中HindIII和XbalI之间的片段得到的重组表达载体命名为 pBI121-TaVIP2。将转入 pBI121_TaVIP2 的重组大肠杆菌命名为 ToplO/pBI121_TaVIP2。
[0066]将载体pBI121_TaVIP2转入根癌根癌农杆菌C58C1，具体方法如下: [0067]I)将宿主菌根癌根癌农杆菌C58C1菌株在含利福平(Rif)、庆大霉素(Gen)，4mlLB培养基的试管中，180rpm，28°C培养36_40h，ToplO/pBI121_TaVIP2及辅助菌大肠杆菌PRK2013在含卡那霉素(Kan)，4ml LB培养基的试管中，225rpm，37°C培养12_16h ;
[0068]2)将根癌农杆菌 C58Cl、ToplO/pBI121-TaVIP2、辅助菌 PRK2013 各取 100 μ I 加入
1.5ml离心管中，混匀，用只有根癌农杆菌C58C1、辅助菌PRK2013各100 μ I加入1.5ml离心管中作对照，4000rpm,离心3min收集菌体；
[0069]3)弃上清，并用移液枪将剩余的上清液吸干，加入50 μ I不含抗生素的LB培养基，重悬浮菌体；
[0070]4)用移液枪将菌体加入不含抗生素的LB固体培养基上，注意不要晃动平板，使菌体成团，待平板晾干后，用封口膜封好，28°C培养16_24h ；
[0071]5)用接种针将从菌团上接取少量菌体，在含Rif、Gen、Kan的LB固体培养基上划线，每个平板划一个目的菌和一个对照，28°C培养36-48h。
[0072]6)从三亲杂交的平板上挑取单克隆，PCR验证阳性农杆菌菌株，以农杆菌菌株的基因组DNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR，得到1839bp PCR产物的重组农杆菌菌株即为阳性农杆菌菌株，将阳性农杆菌菌株命名为C58Cl/pBI121-TaVIP2。
[0073]二、转基因烟草的获得
[0074]本研究中采用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化，具体步骤如下:
[0075]I)将烟草NC89无菌苗上发育正常、叶面平展的叶片切下剪成5.0mmX 5.0mm大小方块，平铺于MS基本培养基(含MS维生素)+1.0mgL—VBA+0.2mgr1IAA的培养基上25°C、光照条件下预培养3d。
[0076]2)在侵染前4d，将C58Cl/pBI121-TaVIP2分别接种于含Gen (庆大霉素)SOmgL'Kan50mgr\ RifSOmgL—1的YEP固体培养基上，28°C黑暗条件下复苏培养3d。挑取单菌落于5ml含有相应抗生素的YEP液体培养基中，200rpm、28°C黑暗条件下过夜震荡小量培养，在45ml含有相应抗生素的YEP液体培养基中大量培养，200rpm、28°C恒温震荡器上培养至0D_值为0.5左右。
[0077]3)室温下3, 500rpm离心10min收集农杆菌菌体，倒掉上清，用MS重悬液(pH6.0)重悬。
[0078]4)将在培养皿中预培养3d的烟草叶片小方块转移至农杆菌菌液中侵染20min，然后用无菌滤纸吸干叶片表面菌液，转移至盛有MS基本培养基(含MS维生素)+1.0mgLl-BA+0.2mgr1IAA的培养皿中，25°C黑暗条件下共培养2d。
[0079]5)将共培养后的烟草叶片小方块转至盛有MS基本培养基(含MS维生素 Hl.0mgl^e-BA+0.angl^IAA+Cb (羧苄青霉素)^Omgl^+Cef (头孢青霉素)lOOmgl^+KanlOOmgL—1的的培养皿中，25°C、光照条件下培养至烟草叶片小方块周边不定芽长至0.5cm,每隔3周更换一次培养基。
[0080]6)将长有不定芽的烟草愈伤组织转移至1/2MS基本培养基(含MS维生素)添加Cb400mgL' Cef IOOmgL' KanlOOmgL-1 培养基中进一步筛选、培养。
[0081]7)将高度为2-3cm的再生芽从愈伤组织上分割出来，转移到三角瓶中培养，获得抗性再生植株，该抗性再生植株为Ttl代转pBI121-TaVIP2植株，以下将转pBI121_TaVIP2植株称为烟草/pBI121-TaVIP2。
[0082]8)根据pBI121载体上的NptII筛选标记基因设计引物，对Ttl代烟草/pBI121-TaVIP2植株进行PCR检测筛选阳性植株，得到63株PCR阳性植株(用引物Fl和Rl从基因组DNA中扩增出1839bp PCR产物的植株)。将60株Ttl代单株以序列表中序列I的DNA为探针按照地高辛试剂盒(Roche)说明书进一步进行Southern blot检测(图2),选择7株Southern blot阳性的植株(编号分别为14、21、41、49、58、12、13)进行无性繁殖获得Ttl代烟草/pBI121-TaVIP2株系，进行白粉病抗性鉴定。
[0083]三、转空载体植物的获得
[0084]用pBI121代替重组质粒pBI121_TaVIP2，其它同步骤二，得到Ttl代转空载体烟草株系，作为烟草/pBI121-TaVIP2株系的对照。
[0085]四、含小麦TaVIP2基因转基因烟草植株抗白粉病鉴定
[0086]将5个Ttl代烟草/pBI121_TaVIP2株系和5个Ttl代转空载体烟草株系和5株未转基因烟草(烟草NC89)在MS基本培养基上进行无性扩繁，然后在相同的条件下种植(均种植于装有体积比为4: I的蛭石和营养土的花盆中，在20-25°C温室中培养)，培养至5-6叶期分别接种烟草白粉病菌种，接种40天时调查烟草白粉病(Erysiphe cichoracearum DC)病情。
[0087]参照GB/23222-2008中烟草白粉病病害严重度分级标准(牟建英等人(2013)，植物遗传资源学报，14(4):668-672)进行烟草白粉病病害分级:
[0088]O级:无病斑；
[0089]I级:病斑面积占叶片面积的5%以下；[0090]3级:病斑面积占叶片面积的大于5%小于等于10% ；
[0091]5级:病斑面积占叶片面积的大于10%小于等于20% ；
[0092]7级:病斑面积占叶片面积的大于20%小于等于40% ；
[0093]9级:病斑面积占叶片面积的大于40%。
[0094]转pBI121_TaVIP2植株对白粉病抗性显著提高结果见表2。5个转pBI121_TaVIP2烟草植株的白粉病平均病级为1，5个转空载体和5个未转基因的烟草植株的白粉病平均病级都为9，说明转TaVIP2基因可增强植株对白粉病的抗性。表2中，株系编号为14、21、49、12、13的15个植株为转pBI121-TaVIP2烟草Ttl代植株；植株编号为1、2、3、4、5的5个植株为转空载体烟草Ttl代植株；植株编号为6、7、8、9、10的5个植株为未转基因烟草植株。
[0095]接种白粉病菌40天后转pBI121_TaVIP2烟草Ttl代植株白粉病病症和未转基因烟草植株白粉病病症见图3和图4。
[0096]表2转基因及受体植株纹枯病抗性调查结果
【权利要求】
1.蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质: a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述BI)至B5)中的任一种: BI)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒； B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体、或含有BI)所述表达盒的重组载体； B4)含有BI)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物； B5)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有BI)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于:B1)所述核酸分子为如下I)或2)或3)或4)所示的基因: I)其编码序列是序列表中序列I的第1-1839位核苷酸的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子; 4)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述相关生物材料在调控植物抗病性中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述抗病性为抗白粉病；和/或，所述白粉病由白粉病菌引起。
6.一种培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物的步骤。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述受体植物为烟草。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于: 权利要求1所述蛋白质的编码基因为如下I)或2)所示的基因: 1)其编码序列是序列表中序列I的第1-1839位核苷酸的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 3)与I)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
9.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于:所述抗病性为抗白粉病，和/或，所述白粉病由白粉病菌引起。
10.扩增编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子全长或其片段的引物对。
【文档编号】C12N5/10GK103923197SQ201410152879
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】王轲, 赵佩, 叶兴国, 林志珊, 何聪芬, 杜丽璞, 张伟, 张云龙 申请人:中国农业科学院作物科学研究所