一种应用abhd5基因的snp鉴定五指山小型猪近交系的方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用ABHD5基因的SNP鉴定五指山小型猪近交系的方法。本发明提供了一种辅助鉴定待测猪群体是否为五指山小型猪近交系群体的方法，包括如下步骤：从待测猪群体中随机抽样得到待测样本，然后检测待测样本基于ABHD5基因上的M1GA0017465SNP位点的基因型，如果所有待测样本均为杂合型、待测猪群体为候选的五指山小型猪近交系群体，如果所有待测样本中存在一个以上纯合型、待测猪群体为候选的非五指山小型猪近交系群体。本发明对于五指山小型猪近交系的种质资源鉴定具有重大价值。
【专利说明】—种应用ABHD5基因的SNP鉴定五指山小型猪近交系的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种应用ABHD5基因的SNP鉴定五指山小型猪近交系的方法。
【背景技术】
[0002]1989年-2003年期间，“五指山近交系培育、种质特性及开发利用”在农业部“七五、八五、九五”行业攻关项目，以及科技部“863”、国家自然基金委重点、重大项目有关等7个课题的资助下，研究工作取得突破性进展，即:以I公I母五指山猪(又称五指山小型猪)为系祖，连续采用“仔配母”、“全同胞”交配等综合措施，逐步克服近交繁育导致繁殖成活率极低、不足20%不良影响，组建F17近交系群体和系谱，并进行了利用分子遗传手段DNA指纹图相似系数、微卫星等多种先进的技术手段监测了该近交系品种F7-F16近交系培育研究过程，初步揭示五指山小型猪近交系的遗传规律和特点，验证了该近交系培育过程的真实性、科学性。并进行了大量的开发利用研究，显示出作为人类理想动物模型研究的无比优越型，取得一定的经济效益和较大的社会效益。其研究内容分别于1995年和2005年《五指山小型猪种质特性及开发利用研究》(农科果鉴定【95】第075号)、《五指山小型猪实验用近交系培育与分子遗传基础研究》两项成果通过农业部技术成果鉴定，其中1999年获得农业部科技进步三等奖。
[0003]小型猪近交培育初步研发成果，在国内外产生了较大的影响，如，美国、意大利、日本、西德、韩国等纷纷要求引种或合作研究，尤其美国1996年提出500万美元购买当时的50头种猪；韩国不同意引种后2 000年提议出资500万元在中国合资办厂等等。其主要原因在于近交系动物是特殊动物遗传资源，它能向化学分析纯试剂和物理学上的精密仪器一样，能为生命科学研究迅速得出、灵敏、准确的科学数据，具有很高的使用价值和研究意义，所以目前国际上已培育出360多种近交系系(小鼠、大鼠、鸡等)。小型哺乳动物近交系做为动物模型，已广泛应用于解决人类疑难病症、攻克生命科学和医学、药学难题等研究领域。由于种间生理等多方差异，近交系猪培育十分困难，经查新证实(2013.11)至今国际上未见成功报道。但猪和鼠类相比与人类有更大的相似性，在解决人类疑难病症、攻克生命科学和医学、药学难题等研究中将发挥不可代替的、独特的作用。近交系猪是国际上珍稀的、宝贵的大型动物基因遗传资源。此前，远在上世纪六十年代美欧一些发达国家多单位、就出巨资开展了近交系猪培育研究，但未能成功、近交系数最高的仅能达到0.75。而我国通过15年培育研究，利用我国特殊的小型猪资源已获得F17、近交系数已达0.965，更可喜的是已克服、跨越近交繁殖所导致仔猪死亡的高发阶段。因此，近交系猪培育成功很有可能在我国首次实现。经过近年的进一步工作，现在已获得五指山小型猪近交系F17至F22。
[0004]由于近交系猪国际尚未有培育成功报道，更无近交系建系标准和鉴定方法。因此，必须借鉴、严格遵循近交系小鼠、大鼠的培育方法进行，即同一世祖2头猪近亲繁育20代以上并建立完整系谱，检测其遗传稳定性，建立鉴定方法，建立品系标准尤其是与现海南五指山猪种间区别，才能向世人提供科学、可信证据，才能完成前无古人后暂无来者的遗传资源创新工程、造福人类。
[0005]一旦小型猪近交系培育成功，我国将拥有自主知识产权，具有国际领先水平的创新的猪遗传种质资源，将填补该研究领域内世界研究空白，丰富大型动物近交系培育理论与实践；作为人类理想的“替难者”，是生物技术研究取得进展的重要基石和创新基础，将会大大促进我国生命科学、人类医学、药学等方面的协同发展和创新，为解决人类疑难病症、延长生命而造福人类做出不可替代地位和作用。因此，具有重要的现实意义和理论意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种应用ABHD5基因的SNP鉴定五指山小型猪近交系的方法。
[0007]本发明提供了一种辅助鉴定待测猪群体是否为五指山小型猪近交系群体的方法，包括如下步骤:从待测猪群体中随机抽样得到待测样本，然后检测待测样本基于ABHD5基因上的M1GA0017465SNP位点的基因型，如果所有待测样本均为杂合型、待测猪群体为候选的五指山小型猪近交系群体，如果所有待测样本中存在一个以上纯合型、待测猪群体为候选的非五指山小型猪近交系群体。
[0008]所述方法中，从待测猪群体中随机抽样得到有统计学意义的待测样本。
[0009]所述方法中，从待测猪群体中随机抽样得到16头以上待测样本。
[0010]所述待测猪具 体可为五指山小型猪近交系或海南五指山猪。
[0011]所述五指山小型猪近交系具体属于F17至F22中的任一世代。
[0012]所述“检测待测样本基于ABHD5基因上的M1GA0017465SNP位点的基因型”的方法具体可为:以待测样本的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。所述特异引物对由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组成。
[0013]本发明还保护一种辅助鉴定待测猪是否为五指山小型猪近交系的方法，包括如下步骤:检测待测猪基于ABHD5基因上的M1GA0017465SNP位点的基因型，如果为杂合型、待测猪为候选的五指山小型猪近交系，如果为纯合型、待测猪为候选的非五指山小型猪近交系。
[0014]所述待测猪具体可为五指山小型猪近交系或海南五指山猪。
[0015]所述五指山小型猪近交系具体属于F17至F22中的任一世代。
[0016]所述“检测待测猪基于ABHD5基因上的M1GA0017465SNP位点的基因型”的方法具体可为:以待测样本的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。所述特异引物对由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组成。
[0017]本发明还保护一种特异引物对；所述特异引物对由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所不的单链DNA分子组成。
[0018]以上任一所述M1GA0017465SNP位点具体可为序列表的序列I自5’末端第323位
核苷酸。
[0019]以上任一所述M1GA0017465SNP位点具体可为以待测猪的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物的自5’末端第323位核苷酸。
[0020]本发明对于五指山小型猪近交系的种质资源鉴定具有重大价值。【具体实施方式】
[0021]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0022]五指山小型猪近交系:
[0023]李凯、冯书堂、牟玉莲，杨述林，韩建林，刘歲，员新旭，郭勇，五指山小型猪3个近交家系微卫星等位基因遗传变化，中国农业科学，2012，42 (5):1751-1760
[0024]海南五指山猪:
[0025]侯冠或，王东劲，管松，荣光，黄显洲，五指山猪小群体遗传学检测，家畜生态学，2007，第 28 卷第 6 期:44-47
[0026]实施例1、“永不纯合”基因的遗传规律的发现
[0027]利用Illumina猪高密度SNP芯片(6万个SNPs)，对五指山小型猪近交系中的F17至F22共6个世代、以及海南五指山猪共计112个样品的基因型进行了系统测定。
[0028]1、纯合度分析
[0029]分布于五指山小型猪近交系的18对常染色体上的61，565个有效SNPs中，F2tlSNPs已被固定的比例高达80.0%以上，随着世代的推进，几乎在所有的染色体上都有一些区域有规律的被慢慢固定，杂合度由大到小直至为0，而且这些区域随世代推进呈现变大趋势，这些现象都符合近交系动物特有的遗传规律。海南五指山猪群体几乎所有染色体区域均表现高度杂合，61565个有效SNPs呈弥漫性、均匀性、无规律的分布在18个染色体上。证实由海南五指山猪培育出的五指山小型猪近交系是一种新的遗传种质资源。
[0030]2、杂合度分析，揭示了近交系“永不纯合”基因遗传规律
[0031]杂合度分析发现:虽然五指山小型猪近交系群体SNPs杂合数由F17的15368个逐步降低至F22的9630个；但平均基因组的杂合度在F17 (0.3540±0.1735)至F22(0.4502±0.1551)世代还呈现出缓慢的上升趋势；各对染色体之间的杂合度却又不尽相同(0.2775-0.4364)，是各染色体所携带基因之功能的异同所致；还发现各对染色体内有一定数量、长度不等的基因组区域相对独立地被固定下来，世代之间有许多相同的被固定区域。分析结果表明:五指山小型猪近交系群体严格地遵循了闭锁繁育的方式，而这种被固定的区域随近交世代的递增，在数量或长度上也有规律的、一定程度的增加，而海南五指山猪群体几乎所有染色体区域均仍然呈现无规律、弥漫性高杂合度分布。进一步分析发现:这些被固定区域分布在各染色体之间又呈现较大差别，虽在近交过程有一定的减少，但绝大多数同源染色体区域在世代之间却仍然维持明显波动的杂合状态；经过与猪基因组对比发现，这些仍处于杂合状态的基因组区域，与其正常繁殖性状和生长发育、存在高度关联。
[0032] 以上结果不仅验证了五指山小型猪近交系等位基因变化规律和“永不纯合”基因的存在，而且表明处于杂合状态的基因组区域所携带的“永不纯合”的关键基因，应该具有特殊的“抗近交”衰退的生物学功能，而挖掘并利用这些“抗近交”基因，将为深入探讨该近交系的基因学结构变化规律及特征、种系延续等遗传学理论，增添新的材料和内容、提供了新的研究视角，也为进一步定向培育这一新的遗传种质资源奠定理论基础。[0033]实施例2、杂合度为I位点的分析，进一步验证“永不纯合”基因
[0034]分析发现，7646个SNP位点在第F2tl以上仍保持杂合，这些SNP位点能够映射到2238个基因上。分析结果表明80%以上的基因涉及代谢过程(metabolic process，共750个基因，占45%)和细胞过程(cellular process，共643个基因，占38.6%)，这些基因是维持生命活动必须的，与全基因组测序取得一致性结果。再次揭示了没被近交过程所纯合的原因。
[0035]进一步分析保持杂合的SNP位点，发现该近交系出现了杂合度为I的位点，而在对应的海南五指山猪位点上没观察到，并且这种现象在该近交系各近交世代中仍呈不规律的、马赛克状变化趋势，即=F17有21个杂合度为I的位点，能够映射到7个基因上#8有24个杂合度为I的SNP位点，仍然涉及以上7个基因；F19有35个杂合度为I的位点；F2(I有25个位点保持杂合度为I ;F21有21个，仍然映射到最初的7个基因上，出现新的8个基因高杂合度、又都表现小于I ;F22有29个位点表现出杂合度为1，但有18个位点几乎在各个世代中杂合度均为I。这些基因涉及的功能大致为细胞免疫、细胞增殖、可能糖代谢、ATP结合及能量代谢、脂肪沉积、听力等。这一发现再次证实:该近交系猪存有少量、部分永不纯合的等位基因，并且呈现马赛克状不规律的变化，是高度近交繁育的结果，也是近交系猪维持生命所必需的。
[0036]上述研究结果，不仅证明五指山小型猪近交系培育成功，验证了发明人前期研究发现近交系猪等位基因遗传变化规律模式“生命基因”的存在，也从该近交系SNP杂合度分析中，证实该近交系与现海南五指山猪具有本质区别，尤其是杂合度为I的位点、永不纯合基因的发现，为该近交系存在“生命基因”的论断假说提供了科学依据。该结果丰富了大型哺乳动物近交系遗传学理论与实践，为认识近交衰退、杂交优势利用等重大基础生物学问题提供了全新的视角。
[0037]实施例3、应用永不纯合ABHD5基因鉴定五指山小型猪近交系与非五指山小型猪近交系
[0038]一、ABHD5 基因
[0039]ABHD5基因的功能:脂肪沉积。ABHD5基因位于13号染色体，本发明中涉及的SNP位于13号染色体中29861003 (Sscrofal0.2)位点(序列表的序列I自5，末端第323位核苷酸)，为A/G突变。
[0040]待测样本为五指山小型猪近交系中的F17至F22共6个世代的96头(每个世代16头)，以及34头海南五指山猪。各个待测样本分别进行如下操作:
[0041]1、取血样，从血样中提取基因组DNA。
[0042]2、以步骤I提取的基因组DNA为模板，以Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增(退火温度为55°C )，得到598bp的PCR扩增产物。
[0043]Fl (序列表的序列 2):5’ -CCATCGCTCCACCTGTTGTA-3’ ；
[0044]Rl (序列表的序列 3):5’ -TCAGAAGGAAGGCTTTGGCA-3’。
[0045]3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序。
[0046]测序结果表明，各个待测样本得到的PCR扩增产物的差异仅在于序列表的序列I自5’末端第323位核苷酸(该SNP位点又称为M1GA0017465SNP位点)。基于M1GA0017465SNP位点，五指山小型猪近交系的96头猪的基因型均为AG，即杂合型。基于M1GA0017465SNP位点，34头海南五指山猪中6头猪的基因型为AG， 剩余的猪的基因型均为AA或GG，即杂合率(杂合体所占总测定个体数的百分比)为17.7%。
【权利要求】
1.一种辅助鉴定待测猪群体是否为五指山小型猪近交系群体的方法，包括如下步骤:从待测猪群体中随机抽样得到待测样本，然后检测待测样本基于ABHD5基因上的M1GA0017465SNP位点的基因型，如果所有待测样本均为杂合型、待测猪群体为候选的五指山小型猪近交系群体，如果所有待测样本中存在一个以上纯合型、待测猪群体为候选的非五指山小型猪近交系群体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，从待测猪群体中随机抽样得到有统计学意义的待测样本。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，从待测猪群体中随机抽样得到16头以上待测样本。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述待测猪为五指山小型猪近交系或海南五指山猪。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述五指山小型猪近交系属于F17至F22中的任一世代。
6.一种辅助鉴定待测猪是否为五指山小型猪近交系的方法，包括如下步骤:检测待测猪基于ABHD5基因上的M1GA0017465SNP位点的基因型，如果为杂合型、待测猪为候选的五指山小型猪近交系，如果为纯合型、待测猪为候选的非五指山小型猪近交系。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于:所述待测猪为五指山小型猪近交系或海南五指山猪。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述五指山小型猪近交系属于F17至F22中的任一世代。
9.一种特异引物对，由序列表的序列2所不的单链DNA分子和序列表的序列3所不的单链DNA分子组成。
【文档编号】C12N15/11GK103923993SQ201410152864
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】牟玉莲, 冯书堂, 刘岚, 吴添文, 魏景亮 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所