一种产异戊二烯基因工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产异戊二烯基因工程菌及其应用，属于基因工程【技术领域】。本发明通过将含有乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因转化入宿主菌获得重组菌，并利用重组菌发酵生产异戊二烯。本发明所提供的方法大大缩短了大肠杆菌利用外源MVA途径合成异戊二烯的反应过程，由乙酰辅酶A仅需5步反应就可合成异戊二烯，避免了由于过多外源基因的表达而导致的对细胞自身代谢的影响。同时，通过对发酵条件的优化，发酵产物异戊二烯的产量可达39.49μg/L。
【专利说明】一种产异戊二烯基因工程菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种产异戊二烯基因工程菌及其应用，属于基因工程【技术领域】。
技术背景
[0002]异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。
[0003]目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。
[0004]生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戍二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)，之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。
[0005]利用MVA途径 和MEP途径生产异戊二烯的反应分别涉及8和9步反应，反应涉及过多的基因。随着分子生物学技术的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。例如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了 50微克/克干细胞/天的产率(Pia Lindberg等，2009)，但藻类生长缓慢、生物量低下是利用藻类制备异戊二烯的瓶颈问题。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而利用工程菌发酵生产异戊二烯(美国专利公开，2009/0203102)。该工程菌中获得外源MVA途径时需要转入多达8个异源基因，由于过多的异源基因表达可能会导致细胞自身代谢的紊乱，影响细胞的正常生长代谢。
【发明内容】
[0006]为避免代谢途径过长可能导致的细胞自身代谢紊乱的问题，本发明提出利用可再生资源葡萄糖为原料，通过缩短MVA途径的反应步骤，完成生物催化剂的制备，构建了具有简短的异戊二烯代谢途径的基因工程菌。本发明所采取的技术方案如下:
[0007]—种产异戊二烯的基因工程菌，是在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因得到的重组菌。
[0008]所述基因工程菌的宿主菌是大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);所述表达乙酰辅酶A酰基转移酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录序列号为AAG02438 ;所述表达3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶的基因是3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录序列号为AAG02439;所述表达末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶的基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT, GenBank登录序列号为ADW41779.1 ;所述表达油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM, GenBank 登录序列号为 ACT54545.1。
[0009]本发明还提供了一种利用所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法，是通过化学合成或克隆获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，构建含有上述基因的重组菌，再利用重组菌发酵生产异戊二烯。
[0010]具体地，本发明利用所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法步骤如下:
[0011]I)分别克隆或化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因，末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因和油酸水合酶；
[0012]2)将步骤I)所得的基因连接到表达载体上，获得重组质粒；
[0013]3)将步骤2)所得的重组质粒转化到宿主菌，获得重组菌；
[0014]4)利用步骤3)所得重组菌，发酵生产异戊二烯。
[0015]所述方法步骤I)中所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE, GenBank登录序列号为AAG02438。
[0016]所述方法步骤I)中所述 3-轻-3甲基戍二酰辅酶A合酶基因mvaS,GenBank登录序列号为AAG02439。
[0017]所述方法步骤I)中所述末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT，GenBank登录序列号为 ADW41779.1。
[0018]所述方法步骤I)中所述油酸水合酶基因OhydEM, GenBank登录序列号为ACT54545.1。
[0019]所述利用基因工程菌生物合成异戊二烯的方法的具体步骤如下:
[0020]I)分别化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶OhydEM，并分别与载体pGH连接；
[0021]2)将步骤I)所得的含有基因mvaE和基因mvaS的pGH载体与pACYDuet-Ι载体重组后获得重组质粒pACY-mvaE-mvaS ;将步骤I)所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH载体与pCOLADuet-Ι载体重组后获得重组质粒pC0LA-01eT_0hydEM ；
[0022]3)将步骤2)中所得的重组质粒pACY-mvaE-mvaS和pC0LA-01eT-0hydEM转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌；
[0023]4)利用步骤3)所得重组菌发酵生产异戊二烯。
[0024]在本发明的另一方面，提供了本发明的基因工程菌在生产异戊二烯中的应用。
[0025]本领域技术人员应该理解，为在重组细胞中更好地表达，上述各种酶的基因序列或由其衍生的编码具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根据所用的宿主细胞的密码子偏好性进行密码子优化。
[0026]本领域技术人员还应该理解，上述各种酶的基因序列或由其衍生的编码具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常规分子克隆技术克隆到宿主细胞中。另外，这些核苷酸片段还可以与适当的表达控制元件(例如，启动子，增强子等)可操作地连接。这些都在本领域技术人员的能力范围之内。这些核苷酸片段可操作性连接可以借助于接头也可以不用接头，这可以由本领域技术人员根据实际需要进行适当的选择。
[0027]本领域技术人员还应该理解，在选择适当的宿主细胞构建好能够从乙酰辅酶A合成α-或β_菔烯的重组细胞后，本领域技术人员能够根据技术常识或经过有限次实验确定合适的培养条件(例如，发酵培养的温度、搅拌速度、PH值、溶氧率、发酵时间等参数)，也能够选择合适的诱导剂，确定加入诱导剂的时机，等等。
[0028]本发明的有益效果:本发明所提供的方法大大缩短了大肠杆菌外源MVA途径的反应过程，以乙酰辅酶A作为原料合成异戊二烯只需要5步反应，仅涉及5种酶，避免了由于过多外源基因的表达而导致的对细胞自身代谢的影响，最终在大肠杆菌中构建生物基异戊二烯合成途径。提供的生物合成异戊二烯新方法大大缩短了工程大肠杆菌利用外源途径合成异戊二烯的反应过程，具有重要的社会意义和有益效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1是利用乙酰辅酶A生物合成异戊二烯代谢途径示意图。
[0030]图2是pFHR-Ι质粒图谱。
[0031]图3是pFHR-2质粒图谱。
[0032]图4是pFHR-3质粒图谱。
[0033]图5是异戊二烯标准品与发酵产物异戊二烯的GC-MS分析图谱。
[0034]图6显示IPTG浓度对工程菌产异戊二烯的影响。 [0035]图7显示诱导温度对工程菌产异戊二烯的影响。
【具体实施方式】
[0036]下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0037]通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE，SEQ ID N0.1)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶 A 合酶基因(mvaS，SEQ ID N0.2);来源于 Jeotgalicoccus sp.ATCC8456的末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因(01eT，SEQ ID N0.3)和来源于脑膜炎脓毒性黄杆菌(Elizabethkingiameningoseptica)的油酸水合酶基因(OhydEM, SEQ ID N0.4),利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成异戊二烯，缩短了异戊二烯的代谢途径(图1)。
[0038]实施例1外源基因的克隆和表达载体的构建
[0039]1.外源基因的克隆
[0040]1.1粪肠球菌MVA上游代谢途径基因的克隆
[0041]来自于幾肠球菌(Enterococcusfaecalis)的mvaS 基因(GenBank N0.AAG02439),mvaE基因(GenBank N0.AAG02438)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。之后分别与载体pGH (购自上海捷瑞生物工程有限公司)连接获得pGH/mvaS，pGH/mvaE。
[0042]1.201 eT, OhydEM 基因的克隆
[0043]来自于Jeotgalicoccus sp.ATCC8456 的 OleT 基因(GenBank N0.ADW41779.1),Elizabethkingia meningoseptica 的 OhydEM基因(GenBank N0.ACT54545.1)由上海捷瑞公司进行化学合成，分别连入PGH载体上分别形成pGH/OleT，pGH/OhydEM载体。
[0044]2表达载体的构建
[0045]2.1pFHR-1 载体构建
[0046]将pGH-OleT 与 pCOLADuet-Ι 载体(Novagen)分别用 BamH I 和 Sac I 进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coli DH5a，然后涂布加有50mg.mL—1卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pFHR-1 (pCOLA-OleT,图2)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0047]2.2pFHR-2 载体构建
[0048]将pCOLA-OleT (pFHR-1)与 pGH-OhydEM 载体分别用 BglII 和 NdeI 进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coliDH5 a，然后涂布加有50mg.mL—1卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pFHR-2(pC0LA-01eT-0hydEM，图3)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0049]2.3pFHR-3 载体构建
[0050]将pACY-mvaE-mvaS-1spSPa 载体(pYJM20,实验室保存)与 pACYDuet-Ι 载体分别用NcoI和PstI进行双酶切,载体pACYDuet-Ι与外源片段mvaE-mvaS按摩尔比1:5的比例,4°C连接过夜或16°C连接4~6h，连接产物转化E.coli DH5 α，然后涂布加有34 μ g -mol-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM3 (pACY-mvaE-mvaS,图4)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0051]实施例2重组菌株的构建和发酵培养 [0052]将构建好的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过摇瓶发酵对重组菌进行发酵培养，利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和气相色谱(GC)分别对发酵产物进行定性和定量的检测。
[0053]2.1E.coli重组菌株的构建
[0054]将pFHR-2 (pC0LA-01eT-0hydEM)和 pFHR-3 (pACY-mvaE-mvaS)重组质粒共同热击转化E.coli BL21 (DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和卡那霉素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pFHR-2和pFHR-3的工程大肠杆菌。
[0055]2.2工程大肠杆菌的培养
[0056]将活化后的工程大肠杆菌按1:100的比例接种到含有氯霉素和卡那霉素的LB液体培养液中，37°C，180rpm条件下振荡培养，当OD6tltol为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol吨'然后转入在30°C，180rpm条件下，继续培养。当工程菌株诱导24h后，取顶空气体1ml，利用GC-MS定性检测。
[0057]GC-MS 检测条件=GC-MS 仪器型号=Thermo GC Trace ITQl 110 ;分离柱型号:HP-1NN0Wax30m*0.25mm*0.25um ;离子源:EI ;进样量:0.2ml ;检测器:ICR ;柱温:40°C 保温5min,然后以20°C /min的速度升温至75°C,保温lmin,然后再以20°C /min的速度升至245°C，保温 5min。
[0058]GC-MS检测结果如图5所示，该结果表明:发酵产物与异戊二烯标准品气相色谱出峰时间及质谱特征一致，从而确定发酵产物为异戊二烯。
[0059]实施例3不同发酵条件对重组菌产量的影响
[0060]不同的发酵条件，如诱导温度，转速，诱导剂浓度，氮源，底物浓度，培养基pH值及成分配比等，会影响发酵产物异戊二烯的产量。本发明检测了不同的诱导温度，诱导剂浓度对异戊二烯产量的影响。培养方法同实施例2，利用GC对发酵产物进行定量。
[0061 ] GC检测条件:GC系统采用山东鲁南瑞虹SP-6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-1NNOffAX column (25mX250 μ mX 0.2 μ m)，检测器为 FID检测器；气化室温度 200°C，检测器温度230°C，载气流速:lml/min。柱温:50°C恒温。
[0062]3.1E.coli重组菌株的构建
[0063]将pFHR-2 (pCOLA-OleT-OhydEM)和 pFHR-3 (pACY-mvaE-mvaS)重组质粒共同热击RKE.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和卡那霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pFHR-2和pFHR-3的工程大肠杆菌。
[0064]3.2研究不同IPTG (异丙基-β -D-硫代半乳糖苷)浓度对异戊二烯产量的影响
[0065]挑取单克隆于5ml LB小瓶中培养活化过夜，按I %接种于10ml含有Cm+Kan抗生素的液体发酵培养基中，37°C振荡培养4h，当OD6tltlnm = 0.6-0.8左右，加入不同浓度IPTG(0.125mM,0.25mM,0.5mM,0.75mM, ImM, 1.125mM, 1.25mM)在 30°C 条件下进行诱导培养。培养48h后取Iml顶空气体进行GC测定。检测结果如图6所示，结果表明:IPTG浓度为ImM时，异戊二烯产量最高，为35.43 μ g/L。
[0066]3.3研究不同诱导温度对异戊二烯产量的影响
[0067]挑取单克隆于5ml LB小瓶中培养活化过夜，按I %接种于10ml含有Cm+Kan抗生素的液体发酵培养基中，37°C，180rpm条件下振荡培养，当OD6tltol为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度Immol吨―1，然后转入不同温度下(25°C，28°C，30°C，34°C，37°C )进行诱导培养。培养48h后取Iml顶空气体进行GC测定。检测结果如图7所示，结果表明:诱导温度为37°C时，异戊二烯产量最高，为39.49 μ g/L。 [0068]应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
【权利要求】
1.一种产异戊二烯的基因工程菌，其特征在于，是在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因得到的重组菌。
2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌E.coli BL2KDE3);所述表达乙酰辅酶A酰基转移酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录序列号为AAG02438 ;所述表达3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶的基因是3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录序列号为AAG02439 ;所述表达末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶的基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT，GenBank登录序列号为ADW41779.1 ;所述表达油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM，GenBank登录序列号为ACT54545.1。
3.一种利用权利要求1所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法，其特征在于，通过化学合成或克隆获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，构建含有上述基因的重组菌，再利用重组菌发酵生产异戊二烯。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下: O分别克隆或化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因，末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因和油酸水合酶； 2)将步骤I)所得的基因连接到表达载体上，获得重组质粒； 3)将步骤2)所得的重组质粒转化到宿主菌，获得重组菌； 4)利用步骤3)所得重组菌，发酵生产异戊二烯。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤I)中所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录序列号为AAG02438。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤I)中所述3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS, GenBank登陆序列号为AAG02439。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤I)中所述末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT，登录序列号为ADW41779.1。
8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤I)中所述油酸水合酶基因OhydEM，登陆序列号为ACT54545.1。
9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，具体步骤如下: O分别化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶OhydEM，并分别与载体pGH连接； 2)将步骤I)所得的含有基因mvaE和基因mvaS的pGH载体与pACYDuet-Ι载体重组后获得重组质粒pACY-mvaE-mvaS ;将步骤I)所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH载体与pCOLADuet-Ι载体重组后获得重组质粒pC0LA-01eT_0hydEM ； 3)将步骤2)中所得的重组质粒pACY-mvaE-mvaS和pC0LA-01eT_0hydEM转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌； 4)利用步骤3)所得重组菌发酵生产异戊二烯。
10.权利要求1或2的基因工程菌在生产异戊二烯中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK104031872SQ201410152878
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】咸漠, 杨建明, 邹慧斌, 冯红茹 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所