一种罗汉果SgCAS基因的突变体及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种来源于罗汉果的SgCAS基因的突变体蛋白，其编码的核苷酸序列，以及该基因在酵母宿主或植物宿主中生产环阿乔醇或罗汉果甜苷V中的应用。
【专利说明】—种罗汉果SgCAS基因的突变体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种来源于罗汉果的SgCAS基因的突变体及其在生产罗汉果甜苷V中的用途。
【背景技术】
[0002]罗汉果(Siraiti grosvenorii)中含有多种阜苷成分，目前已报道分离到了 20多种罗汉果葫芦烷型四环三萜型皂苷成分，其中罗汉果苷IV、苷V和赛门苷I是迄今为止报道的罗汉果甜苷中甜度最高的3种成分，分别为蔗糖甜度的392，425和563倍。在所有甜苷中，罗汉果苷V的含量最高，约占总皂苷含量的20% ;同时作为主要的活性成分，罗汉果苷V具有镇咳、祛痰，解痉活性，具有抗癌，抗炎，降血糖等作用，使之成为为数不多的从中药中发掘出来的具有治疗功能的新型甜味剂。罗汉果甜苷具有甜度高，热量低，无毒，口感好，没有甜菊苷的特殊苦味，2008年美国可口可乐公司新推出的饮料中添加了罗汉果苷V，2011年中国2家公司的罗汉果提取物也通过了通过美国FDA的GRAS认证，成功打入美国市场。但是由于市场上罗汉果苷提取物的价格居高不下，因此在食品、保健品、日用健康用品方面无法与鹿糖竞争。
[0003]然而，罗汉果苷V的分布具有组织特异性，只存在果实中，而且含量很低仅占果实干重的1%左右，占鲜 果含量的3-4%。。常规杂交育种的手段来提高罗汉果苷V的含量难度大，周期长。首先，野生的罗汉果资源目前几乎灭绝，而栽培品种单一化严重，遗传背景狭窄(遗传相似系数在0.9以上)；其次，异花授粉的罗汉果从遗传角度来看是高度杂合的，近交后代性状衰退明显，培育纯合型的品系难度极大；第三，罗汉果的品质属于数量性状，受微效的多基因控制，如果将多个亲本上的优良性状集中于某一个品种的培育周期过长；再者，作为雌雄异株的罗汉果，其实生苗的后代雌雄比例约为3:7，利用目前的手段无法在开花前判定其性别分化，每株植株在种植时占地面积约为4.5cm2，大量组合高品质形状来筛选单株实生苗将极大浪费土地和资金；最后，采用多倍体育种的方法出现果实明显变小的问题。近年来，提高罗汉果苷含量的研究成为热门的研究方向。据统计，每提高1%。果实中罗汉果苷V含量可降低10%的提取成本。因此，我们认为从罗汉果苷V生物合成的相关酶入手，通过研究相关酶的基因功能，来调控解决罗汉果苷含量低的难题，将是一条更为直接、更加有效的新途径。
[0004]现有的报道一定程度预测了罗汉果甜苷生物合成途径，首先经甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成异戊烯二磷酸(IPP)和3，3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，IPP和DAMPP之间可以相互转化，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。这是三萜皂苷生物合成共有的途径，其中在MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase, HMGR)催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲轻戍酸(mevalonate, MVA),这一步反应是需要依赖于NADP的不可逆转的过程，HMGR是该途径中的关键限速酶，可以受洛伐他汀的专一性抑制。IPP和DMAPP能够被栊牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成栊牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸酯(FPP)，然后再经角鲨烯合酶(squalenesynthase, SQS)的催化形成角S烯(Squalene), SQS是异戍二烯途径中的限速酶，是一类与膜结合的蛋白，是具有两种功能的酶，首先能够催化2分子的法尼基焦磷酸(FPP)缩合生成前角S烯二磷酸(presqualene diphosphate, PSPP),接着在NADPH和Mg2+存在的情况下将PSPP转化成角鲨烯，作为植物中留醇和三萜化合物的第一个前体。SQS是三萜类物质生物合成途径中的关键酶,其表达高低及活性强弱直接决定了下游产物的含量高低，目前已经在细菌、酵母、灵芝、动物、人类和植物中得到克隆分离。角鲨烯环氧化酶的继续作用形成2，3-氧化角鲨烯，该物质是植物留醇和三萜皂苷合成的共同前体物质，氧化角鲨烯的环化一步决定了下游的走向，是植物留醇还是三萜皂苷。在罗汉果中，葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienol synthase, CS)和环阿乔醇合酶(cycloartenol synthase, CAS)基因同属于角鲨烯环化酶基因家族，其中CS能够环化成葫芦二烯醇，经过一系列的加羟基、加糖基反应生成罗汉果苷，是甜苷合成中的关键一步；而CAS能够环化成环阿乔醇，在此基础上经过基部修饰得到植物留醇，CAS是植物留醇及留体类化合物合成的第一个关键酶。
[0005]异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，葫芦二烯醇合酶基因最初在西葫芦(Cucurbitapepo)中报道,能够以2，3-氧化角S烯作为底物,催化生成葫芦二烯醇，同时证明葫芦二烯醇合酶催化的反应是独立于环阿乔醇合酶环化形成留醇的另一途径，因此提高其催化功能潜力很大。目前已经报道的CS基因只在西葫芦、黄瓜和罗汉果中，在黄瓜中也已经证明CS具有角鲨烯环化酶的功能。
[0006]至少从上述已知的通路来看，SgCAS竞争SgCS的底物，争夺其碳骨架，朝着植物甾醇的方向发展，间接影响了罗汉果苷的合成，因此，可以预期的是，CAS基因和CS基因将是罗汉果苷V生物合成的关键节点。
[0007]罗汉果在分子 生物学方面的研究多见于通过分子标记的方法来研究遗传多样性、亲缘关系等，相对于其他药用植物的研究稍显缓慢，目前对于罗汉果功能基因的研究鲜有报道，虽然GENEBANK中已经可以检索到罗汉果葫芦二烯醇合酶(SgCS)、罗汉果环阿乔醇合酶(SgCAS)的序列结构，但是，发明人通过分子生物学的手段以该现有的基因对原核和真核宿主进行改造时，发现该基因转入宿主后，无法产生有活性的蛋白，因此，需要通过一定的分子生物学功能改进或分子进化方法，对该基因序列进行改进和优化，以克服罗汉果苷V生物合成途径中的关键难点。
【发明内容】
[0008]本发明首先涉及一种来源于罗汉果的SgCAS基因突变体蛋白，及其功能片段或活性结构域，所述的SgCAS基因突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]本发明还涉及所述的SgCAS基因的突变体的蛋白的编码序列，及其功能片段，所述的编码核苷酸序列优选的如SEQ ID N0.1所示。
[0010]本发明还涉及所述的罗汉果SgCAS基因的突变体在催化角鲨烯底物合成环阿乔醇中的应用，所述的应用包括，将所述的突变体基因通过基因工程手段转入真核酵母宿主、植物宿主,使所述的突变体高表达，以催化鲨烯底物合成环阿乔醇。所述的酵母宿主优选为酵母菌株IVF，所述的植物宿主优选为烟草、拟南芥或罗汉果。
[0011]本发明还进一步涉及所述的突变体基因在合成罗汉果甜苷V中的应用，所述的应用包括，以所述的突变体基因模板，构建植物干扰载体，下调宿主中SgCAS基因的表达量，从而增加罗汉果甜苷V的生物合成，所述的宿主为能够通过特定的生物合成途径合成罗汉果甜苷V的酵母或植物宿主，优选为酵母、烟草、拟南芥或罗汉果。所述的植物干扰载体中含有的干扰序列优选如SEQ ID N0.3所示。所述的植物干扰载体优选为PBI121载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1，重组质粒pYES2_SgCAS的双酶切电泳检测。
[0013]图2，GC-MS方法检测含有pYES2_SgCAS重组质粒的酵母的次生代谢产物:2A:阴性对照；2B:环阿乔醇标准品；2C:含有重组质粒的酵母次生代谢产物。
[0014]图3，GC-MS方法检测含有未突变SgCAS重组质粒的酵母的次生代谢产物:3A:阴性对照；3B:含有未突变蛋白编码序列的酵母次生代谢产物。
[0015]图3，SgCAS正向干扰片段的PCR扩增:M:DNA标记；1_6 =SgCAS正向干扰片段。
[0016]图4，SgCAS反向干扰片段的PCR扩增:1，2 =SgCAS正向干扰片段；M:DNA标记。
[0017]图5，SgCAS基因在野生型和转基因烟草中的表达变化。
图6，干扰载体对烟草中CAS基因表达的影响。
【具体实施方式】
[0018]实施例1，Sg CAS基因的生物信息学分析及突变体序列的获得
[0019]以SgCAS-ORF序列作为分析材料，利用ExPAEy Proteomics Server的在线软件Protparam(http://web.expasy.0rg/protparam/)对 SgCAS 基因编码的蛋白进行理化性质的预测，Interproscan 在线软件(http://www.eb1.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)预测蛋白的保守结构域，利用SOPMA在线软件(http://www.1bcp.fr/predict.html)对SgCAS编码的蛋白进行二级结构的预测，经在线软件SWISS MODEL (http: //swissmode 1.expasy.0rg/)进行三级结构的预测，通过 SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，PSORT(http://wolfpsort.0rg/)和 TMHMM Server v.2.0 软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)来预测该蛋白的信号肽,亚细胞定位及跨膜区的位置。利用NCBI的BLAST来分析该基因编码的蛋白与其他物种中该蛋白的同源性，并通过MEGA6软件构建Neighbor-joining系统进化树。通过与化学修饰法结合的对蛋白结构进行突变预测的方法(例如可使用SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant)程序来评价和预测点突变对蛋白质功能的影响等)，获得了经程序预测的功能优化的突变蛋白序列，方法如下:
[0020]利用改良Trizol法提取罗汉果幼果中RNA，经I %琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性和质量的鉴定，Nanodrop对RNA的得率和纯度进行检测。以RNA为模板，用PrimeScript?First Strand cDNA Synthesis Kit (大连宝生物公司)反转录成cDNA第一链,反应体系如
下:
[0021]
【权利要求】
1.一种来源于罗汉果SgCAS蛋白，其特征在于,来源于罗汉果(Siraiti grosvenorii)。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.编码权利要求1或2所述的蛋白的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的序列如SEQID N0.1所示。
5.权利要求1或2所述的蛋白，权利要求3或4所述的基因在生产环阿乔醇中的应用，其特征在于，通过基因工程的方法，在真核宿主中高表达该蛋白，催化角鲨烯环化，成为环阿乔醇。
6.权利要求1或2所述的蛋白，权利要求3或4所述的基因在生产罗汉果甜苷V中的应用，其特征在于，通过基因工程的方法，下调真核宿主中的所述蛋白的表达量，从而抑制角鲨烯环化为环阿乔醇，以提高罗汉果甜苷V的产量。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的真核宿主为酵母宿主或植物宿主，所述的酵母优选为酵母菌株IVF，所述的植物优选为烟草或罗汉果。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过植物干扰载体下调所述蛋白的表达量，所述的植物干扰载体优选为PBI121。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的植物干扰载体中含有针对所述蛋白的编码基因的干扰序 列，所述的干扰序列优选为SEQ ID N0.3所示的序列。
【文档编号】C12N1/19GK104017797SQ201410244958
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】马小军, 赵欢, 唐其 申请人:中国医学科学院药用植物研究所