小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦山融3号甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrB3.1。本发明还公开了所述基因TaMsrB3.1在拟南芥和小麦植株中提高其抗盐/耐旱性的应用。实验结果表明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的抗盐/耐旱能力得到了很大程度的提高，为通过基因工程手段提高作物抗盐/耐旱性提供了理论依据和实践基础。
【专利说明】小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于生物基因工程【技术领域】，尤其涉及一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1及其应用。 【背景技术】
[0002] 干旱和高盐等逆境是限制植物产量的重要因素。因此，鉴定抗逆相关基因用于作 物改良是未来抗逆育种的关键策略之一。Msr能被多种非生物胁迫诱导表达，而且MSR可以 清除机体内过量的R0S，也可以体外催化因 R0S氧化的R和S型MetSO的还原，暗示其在植 物胁迫应答中发挥作用。
[0003] 小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，提高小麦产量一直是科研和育种工作者 们最为关注的研究课题。然而，近年来农业生态环境不断恶化，许多土地处于干旱、盐渍、沼 泽、冷土等逆境中，干旱胁迫与盐胁迫尤其严重影响作物生长发育和产量。因此加强小麦应 对各种非生物胁迫的能力是提高小麦产量最为有效的途径之一。本实验室前期将小麦近缘 禾草中耐逆性极强的长穗偃麦草的染色质渐渗入小麦济南177的基因组，创制了一批抗逆 新种质资源并从中选育出高产/耐盐小麦新品种山融3号（SR3)。前期的盐旱处理SR3幼 苗构建的cDNA芯片显示其中的TaMsrB3. 1有显著响应。Msr在拟南芥、水稻以及一些其他 植物中抗胁迫方面的作用已有初步结果，但在主要粮食作物小麦中该基因的克隆、功能验 证尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种抗盐和抗旱相关基因一小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基 因 TaMsrB3. 1，以及利用该基因在提高植株抗盐/耐旱性中的应用。
[0005] 本发明的技术方案是：从小麦山融3号（SR3)中分离得到小麦甲硫氨酸亚砜还原 酶基因 TaMsrB3. 1，在植物真核系统拟南芥中验证其功能，再在转化小麦实验中验证其提高 抗盐和抗旱性。
[0006] 本发明所述的小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1，其特征在于：所述基因 cDNA序列如SEQ ID No. 1所示。其中，所述小麦是山融3号小麦。
[0007] 本发明在小麦中克隆的甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1与其他物种中的类 似基因相比同源性在40?75%之间。对其保守区分析发现，小麦中甲硫氨酸亚砜还原酶基 因 TaMsrB3. 1推导的氨基酸序列含有两个保守的CxxC，这两个CxxC用于结合Zn2+，为酶的 热稳定性和催化活性所必须。和其它同类基因相比，也存在保守序列的多态性，比如在除了 以上两个功能相关的保守序列外，TaMsrB3. 1存在其它位点保守序列的差异，这暗示在小麦 中该基因功能上的分化。
[0008] 本发明所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1在提高植株抗盐/耐旱性中 的应用。
[0009] 实验证实：在逆境处理的条件下，无论是盐还是旱处理，转入本发明所述基因 TaMsrB3. 1的植株过表达系的根长相比于野生型差异明显，在逆境下生长良好，说明该基因 的转化的确增强了植株（小麦）抗盐/旱的能力。
[〇〇1〇] 本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦 SR3甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1并进行了功能验证。通过不同诱导子处理显示该 基因与抗盐和抗旱密切相关。故对于该基因 TaMsrB3. 1的研究具有重要理论意义和应用前 旦 -5^ 〇 【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图 1 :TaMsrA2. 1 基因的cDNA 电泳图，其中：M为DNAMarker，泳道 1-3 为TaMsrB3. 1 的 cDNA。
[0012] 图2 :转TaMsrB3. 1基因的拟南芥转基因植株筛选，绿苗为转基因植株。
[0013] 图3 :甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1在转基因拟南芥中RealTime-PCR表达 分析，Clo-Ο为野生型拟南芥，0E1和2为不同转基因纯系。
[0014] 图4 :转基因的拟南芥中甘露醇处理分析，WT为野生型，0E1和0E2为 RealTime-PCR分析的过表达系。
[0015] 图5 :转基因的拟南芥中NaCl处理分析，WT为野生型，0E1和0E2为过表达系。
[0016] 图6 :转基因的拟南芥中控水试验的析，WT为野生型，0E1和0E2为过表达系。
[0017] 图7 :转基因小麦PCR筛选电泳结果，1-22为不同转基因植株，PC为阳性对照，NC 为阴性对照，Μ为DNA Marker。 【具体实施方式】
[0018] 实施例1、TaMsrB3. 1的克隆
[0019] 1. 1提取小麦SR3总RNA
[0020] (1)将SR3植物材料放入研钵中，加入液氮将其研磨成粉；
[0021] (2)待液氮挥发后，取约100-200mg粉末转入到1. 5ml离心管中，加入1ml Trizol 提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温静置5min ;
[0022] (3)4°C，12, OOOrpm，离心lOmin后，取0· 9ml上清液转移到新的1. 5ml离心管中， 再加入0. 2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温静置2-5min ;
[0023] (4)4°C，12, OOOrpm，离心lOmin后，取0· 4ml上清液转移到新的1. 5ml离心管中， 加入0. 4ml异丙醇后混勻，室温静置15mim ;
[0024] (5)4°C，12, OOOrpm，离心lOmin,弃上清，用1Π11751%的乙醇洗漆沉淀两次后，于 4°C，8, OOOrpm，离心 5min ;
[0025] (6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2_5min，加入40 μ 1 RNase-Free 水，在60°C中充分溶解RNAlOmin ;
[0026] (7)用紫外分光光度计测RNA样品的0D值和浓度，A26(i/A28(i达到1. 7-2. 0为佳；琼 脂糖凝胶电泳检测的质量。
[0027] 1. 2cDNA第一链的合成
[0028] (1)向离心管中依次加入下列物质（40 μ 1反应体系）：
[0029]
[0030]
【权利要求】
1. 一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1，其特征在于：所述基因 cDNA的核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 如权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1，其特征在于：所述小麦 是山融3号小麦。
3. 权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrB3. 1在提高植株抗盐/耐旱性 中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植株是小麦或拟南芥。
【文档编号】C12N15/84GK104046639SQ201410313216
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】陈凡国, 黄舒, 丁鹏程, 张尚立, 夏光敏 申请人:山东大学