芯片表面toehold协助下增强的单碱基突变检测的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种基于toehold协助下的芯片表面增强DNA链替换反应来检测单碱基突变的技术。该技术将双链DNA(toehold交换探针)接枝到芯片表面，利用双偏振干涉测量技术(DPI)，根据toehold协助下的DNA链替换反应原理，实现在DPI上实时定量研究单碱基突变进程。该技术大幅度提高了正确目标链DNA的替换效率同时又能很好的抑制有突变目标链DNA的替换效率，大大提高了单碱基突变检测的信号。
【专利说明】芯片表面toehold协助下增强的单碱基突变检测
【技术领域】
[0001]本发明涉及DNA分子检测【技术领域】，具体涉及用于检测单碱基突变的双链DNA “toehold交换探针”分子，连接有所述分子的芯片，及其应用。
【背景技术】
[0002]单碱基突变是一种普遍存在的基因变异种类，在人类基因组中几乎有1%的等位基因会出现单碱基突变。基因序列中的变异与人类遗传病密切相关，对早期诊断，药物响应测试，疾病预防，和特定遗传疾病的治疗至关重要，因此基因多态性的研究成为遗传病学和预防医学的研究重点。发明一种简单，省时和高灵敏度的基因多样性检测方法非常有价值和必要。
[0003]目前为止，实现单碱基突变检测的方法有很多种，其中重要的方法有酶辅助方法以及DNA杂交的方法。酶辅助方法具有很高的灵敏度以及强的特异性，但是操作过程复杂，酶的不稳定性，价格昂贵和严格的实验条件等固有的缺点，限制了其在复杂样品检测中的应用。另外一种方法，DNA杂交具有独一无二的优势，其中无需酶参与反应，有效克服了以上缺点，同时具备高灵敏度以及特异性，很好实现了的单碱基突变检测。
[0004]在DNA杂交检测单碱基突变的方法中主要有界面检测方法和溶液检测方法两大类。其中，采用界面检测方法的，主要集中于SNP基因分型的研究，借助于toehold的调控，来实现单碱基突变检测，但是只能检测toehold上的突变，无法实现DNA全序列不同位点和不同突变类型(SNP，插入和缺失)的单碱基突变检测。溶液检测的方法由Zhang [ZhangDY.Nature Chemistry2012, 4, 208-214]等人提出，设计了新颖的双链 DNA“toehold 交换探针”，该探针具有对检测条件(PH，温度和浓度)不敏感的优点，能进行不同突变点和突变类型的单碱基突变检测。但同时由于可逆反应的影响，存在着正确的DNA目标链替换效率低下的缺点。
[0005]因此，为了克服现有技术中在DNA单碱基突变上检测的困难，本发明人进行了深入研究。本发明采用DNA杂交的方法，整合界面检测和溶液检测的优势，首次将双链DNA “toehold交换探针”分子接枝到芯片表面，利用双偏振干涉技术(DPI)，借助toehold的DNA链替换反应原理实现在芯片表面实时定量研究单碱基突变进程。该发明不仅实现了DNA全序列不同位点的突变检测，而且克服了溶液中正确的DNA目标链替换效率低的缺点，大幅度提高了正确的目标链DNA的替换效率(达到86.1% )同时又能很好的抑制有突变的目标链DNA的替换效率(约14% )，从而大大提高单碱基检测信号。同时，我们设计了一种简单实用的DNA微阵列芯片，借助普通荧光显微镜，在玻璃芯片表面实现了高通量的单碱基突变检测。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明提供用于检测单碱基突变的基于toehold的芯片。
[0007]具体地，本发明涉及以下各项:
[0008]1.一种配体修饰的双链DNA “toehold交换探针”分子，其特征在于:所述分子由N端带有配体的固定链和C端与固定链C端互补的互补链退火得到,从而固定链和互补链的互补区形成双链DNA刚性端，所述双链DNA刚性端靠近配体侧具有自发解离端，互补链的N端非互补部分形成粘性toehold末端。
[0009]2.根据I所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，其中所述配体选自由生物素，抗体，抗原组成的组。
[0010]3.根据I所述的双链DNA “toehold交换探针”分子，其中所述双链DNA刚性端为10-50个碱基对，优选20个碱基对。
[0011]4.根据I所述的双链DNA “toehold交换探针”分子，所述自发解离端为2-20个碱基对，优选5个碱基对。
[0012]5.根据I所述的双链DNA “toehold交换探针”分子，所述粘性toehold末端为2-20个碱基，优选6个碱基。
[0013]6.一种DNA芯片，其特征在于:所述芯片由1-5任一项所述的双链DNA “toehold交换探针”分子通过芯片表面的受体接枝于芯片表面形成。
[0014]7.根据6所述的DNA芯片,其中，所述受体选自由NeutrAvidin蛋白，抗原,抗体组成的组，所述芯片为微阵列芯片，其可以包含任意数量的反应池。
[0015]8.1-5任一项所述的双链DNA “toehold交换探针”分子和/或权利要求6-7任一项所述的芯片用于检测单碱基突变的用途。
[0016]9.一种检测单碱基突变的方法，其中包括以下步骤:
[0017]I)将不同种类待检测目标链DNA，与如1-5任一项所述的或如6或7中所述的芯片上接枝的双链DNA “toehold交换探针”分子发生链替换反应；
[0018]2)进行定性和/或定量检测。
[0019]10.根据9所述的方法，所述定性和/或定量检测包括:
[0020]I)加入荧光基团标记的报告链DNA，用荧光显微镜定性检测；其中所述荧光基团优选FAM ；
[0021]2)使用双偏振干涉技术(DPI)实时定量检测。
[0022]发明详述
[0023]以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。
[0024]本发明的第一个方面是提供一种生物素修饰的双链DNA“toehold交换探针”分子以及基于其的DNA微阵列芯片。
[0025]在一个实施方案中，本发明提供一种配体修饰的双链DNA “toehold交换探针”分子，其特征在于:所述双链DNA由N端带有配体的固定链(P)与其互补链(C)杂交退火得到，从而P链和C链的互补区形成双链DNA刚性端，所述双链DNA刚性端靠近配体侧具有自发解离端，C链的N端非互补部分形成粘性toehold末端。如图1所示为当配体为生物素(b1tin)时的分子结构。
[0026]在一个优选的实施方案中，所述双链DNA刚性端为10-50个碱基对，优选10_40个，更优选10-30个，还更优选10-20个碱基对，最优选20个碱基对。
[0027]在另一个优选的实施方案中，所述自发解离端为2-20个碱基对，优选2-15个碱基对，更优选2-10个碱基对,还更优选2-5个碱基对,最优选5个碱基对。
[0028]在另一个优选的实施方案中，所述粘性toehold末端为2-20个碱基，优选2-15个碱基，更优选2-10个碱基,还更优选2-6个碱基,最优选6个碱基。
[0029]在进一步优选的实施方案中，所述双链DNA分子通过连于其上的配体与连于芯片表面的受体间的相互作用接枝到芯片表面。通过将双链DNA“toehold交换探针”分子连接于芯片，一方面实现闻通量单喊基突变检测，另一方面大幅度提闻正确DNA目标链的替换效率同时很好地抑制突变的DNA目标链的替换效率。
[0030]因此，在该进一步实施方案中，提供一种用于检测单碱基突变的DNA微阵列芯片，如图2所示，所述微阵列芯片为载玻片(75mm*25mm)通过一系列经表面化学处理过程得到的醛基表面，与含有12孔反应池的微阵列垫片对齐后加压粘在一起形成，所述芯片的反应池中的表面连接有受体，所述受体与所述双链DNA “toehold交换探针”分子上的配体相互作用，从而接枝所述双链DNA “toehold交换探针”分子。
[0031]在一个优选的实施方案中，所述配体包括但不限于生物素，抗体，抗原，相应的，所述受体包括但不限于NeutrAvidin蛋白，抗原,抗体,本领域已知的相互结合的两种分子均可以用于本发明。
[0032]在一个最优选的实施方案中，所述双链DNA由25碱基的5’端生物素修饰的固定链DNA和26个碱基的互补链DNA杂交退火得到，其中含有P链的C端20个碱基与C链的C端20个碱基形成的双链DNA刚性端以及6个碱基的DNA链引发链替换反应的粘性toehold末端以及5个碱基DNA链的自发解离端(被称为6/5toehold方案)。双链DNA分子通过生物素和NeutrAvidin蛋白特异性相互作用接枝到修饰NeutrAvidin蛋白后的芯片表面。该DNA分子通过粘性末端与多种待检测目标链碱基配对，发生链替换反应，实现单碱基突变检测。
[0033]本发明的第二个方面提供一种基于本发明的第一个方面的DNA微阵列芯片用于检测单碱基突变的方法。
[0034]在一个优选的实施方案中，所述方法使用突光基团的报告链DNA通过突光显微镜获得定性结果，所述荧光基团优选FAM。
[0035]在一个更优选的实施方案中，所述方法中使用双偏振干涉技术(DPI)获得定量结果O
[0036]在一个更优选的实施方案中，所述方法将所述双链DNA “toehold交换探针”接枝到芯片表面，利用双偏振干涉技术(DPI)和DNA微阵列技术，借助toehold协助下的DNA链替换反应原理实现单碱基突变在芯片表面的检测。该光刻技术无需严格的操作条件，操作简单。
[0037]本发明的单碱基突变检测方法中首次利用双链DNA “toehold交换探针”接枝到芯片表面，利用双偏振干涉技术(DPI)和DNA微阵列技术，借助toehold协助下的DNA链替换反应原理，最终实现单碱基突变在芯片表面的检测。其原理见图3，首先将NeutrAvidin蛋白接枝到醛基芯片表面。接着通过生物素与NeutrAvidin蛋白特异性相互作用，将生物素修饰的双链DNA “toehold交换探针”固定到表面。紧接着通入待检测目标链(正确目标链或者突变目标链)与双链DNA “toehold交换探针”分子发生链替换反应，实现在DPI上的实时定量研究单碱基突变。在随后的DNA微阵列实验中，重复以上步骤，最后加入荧光修饰的DNA报告链，从而实现了荧光显微镜下的高通量单碱基突变检测。
[0038]在更优选的实施方案中，本发明的界面单碱基突变检测技术包括如下步骤:
[0039]I)根据被检DNA寡核苷酸的实际长度设计所需要的各种单链DNA序列，所述单链DNA序列的设计按照实际的需要可以进行调整；
[0040]2)氨基芯片表面通入戊二醛溶液孵育，得到醛基芯片表面；
[0041]3)通入NeutrAvidin蛋白溶液孵育使蛋白接枝到醒基表面；
[0042]4)将退火后的双链DNA “toehold交换探针”分子固定到修饰了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面；
[0043]5)通入待检测目标链DNA (正确目标链DNA或突变目标链DNA)溶液，在toehold协助下，与双链DNA发生链替换反应，实现在DPI上实时定量的研究单碱基突变进程；
[0044]6)在食人鱼洗液清洗后的玻璃表面进行氨基化修饰以及醛基化修饰；
[0045]7)将12孔反应池的微阵列垫片固定到醛基玻璃表面得到DNA微阵列；
[0046]8)在DNA微阵列芯片的12个反应池里均加入NeutrAvidin蛋白溶液,使蛋白接枝到芯片表面；
[0047]9)在DNA微阵列芯片的12个反应池里均加入生物素修饰的双链DNA“toehold交换探针”分子，使之固定到修饰了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面；
[0048]10)在DNA微阵列芯片的12个反应池里分别同时加入不同种类待检测目标链DNA (正确目标链DNA和多种突变目标链DNA)溶液以及缓冲液对照组溶液，在toehold协助下，与双链DNA发生链替换反应，替换掉大部分或极少量的互补链DNA(C)；
[0049]11)在DNA微阵列芯片的12个反应池里均加入荧光素FAM修饰的报告链DNA，通过碱基互补配对连接到固定链DNA上，最后用荧光显微镜进行拍照，最终实现在DNA微阵列上的高通量单碱基突变检测；
[0050]在一个优选的实施方案中，步骤中所述DNA浓度可根据实际要求在1nM-1 μ M进行调节。
[0051]在一个优选的实施方案中，步骤2)中所述氨基芯片通入戊二醛溶液孵育时间为6分钟。
[0052]在一个优选的实施方案中，步骤3)中通入NeutrAvidin蛋白溶液孵育时间为6分钟。
[0053]在一个优选的实施方案中，步骤4)中双链DNA “toehold交换探针”分子固定到修饰了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面反应时间为15分钟。
[0054]在一个优选的实施方案中，步骤5)中通入待检测的目标链DNA溶液孵育时间为15分钟。
[0055]在一个优选的实施方案中，步骤6)中氨基化时间为2小时。
[0056]在一个优选的实施方案中，步骤6)中氨基化时间为4小时，然后放入120°C烘箱半小时。
[0057]在一个优选的实施方案中，步骤8)中涉及的NeutrAvidin蛋白接枝到醒基表面反应时间为I小时。
[0058]在一个优选的实施方案中，步骤9)中生物素修饰的双链DNA “toehold交换探针”分子与接枝了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面的反应条件是室温下孵育I小时。
[0059]在一个优选的实施方案中，步骤10)中同时分别加入的不同待检测目标链DNA溶液和缓冲液对照组溶液孵育时间为I小时。
[0060]在一个优选的实施方案中，步骤11)中加入的荧光素FAM修饰的报告链DNA溶液孵育时间为I小时。
[0061]在一个最优选的实施方案中，步骤11)中不加入报告链DNA，从而通过DPI进行检测，即用Farfield软件和Oringinlab软件进行数据分析处理,分析界面绝对质量的变化情况从而实现实时定量的研究单碱基突变的进程。
[0062]本发明的第三个方面是提供一种基于本发明的第一个方面的DNA微阵列芯片，利用双偏振干涉技术(DPI)在检测碱基错配、碱基缺失或碱基插入中的应用。
[0063]本发明的有益效果如下:
[0064]本发明提供了一种芯片表面toehold协助下的增强单碱基突变检测的方法。首次将双链DNA“ toehold交换探针”接枝到芯片表面，利用双偏振干涉技术(DPI)，借助toehold协助下的DNA链替换反应原理实现了在芯片表面实时定量的研究单碱基突变进程。一方面，该发明不仅检测种类全面的碱基突变，包括了所有的碱基突变形式:碱基错配、碱基缺失以及碱基插入，并且待检测目标链DNA存在突变位置可以在任意位置。另一方面，克服了溶液中正确的目标链DNA替换效率低的缺点，大幅度提高了正确的目标单链DNA的替换效率(达到86.1% )同时又能很好的抑制有突变的目标单链DNA的替换效率(约14% )，大大提高了单碱基突变检测信号。同时，我们设计了一种简单实用的DNA微阵列芯片，借助普通荧光显微镜，在玻璃芯片表面实现了高通量的单碱基突变检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]图1生物素修饰的双链DNA “toehold交换探针”分子结构图。
[0066]图2DNA微阵列芯片结构图。
[0067]图3 (a) DPI技术实时定量研究toehold协助下的芯片表面单碱基突变进程的原理图；(b)DNA微阵列技术实现在toehold协助下的芯片表面高通量单碱基基突变检测的原理图。
[0068]图4DPI技术实时定量的研究toehold协助下的芯片表面单碱基突变进程(曲线表示质量mass随时间t的变化图)。其中和“i”分别表示碱基错配、碱基缺失以及碱基插入等不同突变类型，比如mlT表示目标单链DNA分子I号位置发生碱基错配，错配成T碱基。illT表示目标单链DNA分子11号位置发生碱基插入，插入的是T碱基，以及dl9表示目标单链DNA分子19号位置发生碱基缺失(其它以此类推)。a)表示芯片表面toehold协助下不同位置(mlT~ml9T)的单碱基突变进程的定量研究；b)表示芯片表面toehold协助下11号位置不同突变类型(错配，缺失和插入)的单碱基突变进程定量研究；c)表示芯片表面toehold协助下19号位置不同突变类型的单碱基突变进程定量研究；d)另一种toehold方案(6/6方案)下的单碱基突变检测研究。
[0069]图OTNA微阵列技术实现在toehold协助下的芯片表面高通量单碱基突变检测的结果。
【具体实施方式】
[0070]以下结合附图和具体实施例对本发明的具体技术方案进行具体说明。
[0071]本实例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了比较详细的实施方式和过程。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于本发明保护的范围。实施例中采用的实施条件可以根据需要做进一步的调整，未注明的实验条件通常按照常规实验中的条件。
[0072]本实施例主要通过实验验证基于芯片表面toehold协助下的增强单碱基突变检测的可行性，并进一步在自行设计的简易实用DNA微阵列上实现高通量单碱基突变检测。以下实例进一步验证基于芯片表面toehold协助下的增强单碱基突变检测的可行性。
[0073]实施例1:
[0074]利用双偏振干涉技术(DPI)，在toehold协助下实时定量研究不同位置的单碱基突变进程。
[0075]第一步，氨基芯片表面醒基化以及将NeutrAvidin蛋白(31000，Thermo FisherScientific, Massachusetts, USA)接枝到醒基表面:
[0076]在DPI 实验中，氨基芯片(FBlOOAmine, FarfieldGroup, Ltd., Stockholm, Sweden)表面以25 μ L miiT1流速通入戊二醛溶液(4mg mL—1溶于PBS缓冲液)6分钟，利用氨基与醛基的共价结合反应完成芯片表面醛基化过程。
[0077]将NeutrAvidin蛋白溶液(0.5mg ml/1溶于PBS缓冲液)以25 μ L mirf1流速通入到醛基化芯片表面6分钟，利用NeutrAvidin蛋白上的氨基与醛基发生共价结合反应，从而将NeutrAvidin蛋白到固定醒基表面上。
[0078]第二步，将退火后的双链DNA“toehold交换探针”分子固定到修饰了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面:
[0079]2 μ Μ5’生物素修饰的固定链DNA⑵与3 μ M互补链DNA(C)等体积混合得到600 μ L溶液后退火使其杂交，退火条件为95°C下保持10分钟然后缓慢降温到室温，整个退火过程持续2.5-3小时，杂交过程中使用到的缓冲液为TE缓冲液(1mM Tris-HCl, 12.5mMMgC12, pH = 8)，杂交后得到的双链DNA溶液浓度为I μ Μ。
[0080]a.将退火后的生物素修饰的双链DNA溶液以1yL mirT1流速通入到接枝了NeutrAvidin蛋白的芯片表面室温下孵育15分钟,利用生物素与NeutrAvidin蛋白的特异性相互作用将双链DNA固定到芯片表面。
[0081]b.以50 μ L mirT1流速通入TE缓冲液10分钟，清洗掉未接枝到表面的多余双链DNA分子。
[0082]第三步，通入待检测目标链DNA溶液，实现在DPI上实时定量的研究单碱基突变进程:
[0083]I μ M的待检测目标链以10 μ L mirT1流速通入到固定了双链DNA分子的芯片表面15分钟,在toehold协助下,与双链DNA分子发生链替换反应,替换掉大部分或极少量的保护链DNA (C)，在DPI上实现了实时定量的研究单碱基突变进程，其中待检测目标链为正确目标链DNA或突变目标链DNA。
[0084]以50 μ L mirT1流速通入TE缓冲液10分钟，清洗掉多余的待检测目标链DNA。
[0085]用Farfield软件进行数据分析和处理。
[0086]生物素修饰固定链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0087]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0088]互补链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0089]ACXiTACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0090]正确目标链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0091]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0092]存在单碱基突变目标链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0093]mlT: T ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:4)
[0094]m6T: CACTC T TTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO: 5)
[0095]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0096]ml6T: CACTCATTCAATACC T TACGT (SEQ ID NO:7)
[0097]m!9T:CACTCATTCAATACCCTA -T' GT(SEQ ID NO:8)
[0098]其中斜体并下划线的部分为形成双链DNA后的toehold端，只下划线的部分为目标单链DNA与双链DNA的toehold端反应的部分，加粗的字体表示发生单碱基突变。通过Farfield软件和originlab软件数据处理可以得到验证。如图4a所示,通过本发明的方法可以清楚的区分待检测目标单链是否发生了单碱基突变，从而实现单碱基突变检测。
[0099]实施例2:
[0100]利用双偏振干涉技术(DPI)，在toehold协助下实时定量研究分支迁移端不同类型的单碱基突变进程。
[0101]采用同实施例1相同的操作步骤，只是突变目标链DNA为分支迁移端11号位置存在碱基突变(从左到右为5’ 一3’)，同时考虑各种不同突变类型，包括碱基错配、碱基缺失以及碱基插入.
[0102]生物素修饰固定链的序列(从左到右为5’ 一3’ )
[0103]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0104]互补链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0105]ACGTAG GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0106]正确目标链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0107]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0108]存在单碱基突变目标链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0109]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0110]mlIG:CACTCATTCA G TACCCTACGT(SEQ ID NO:9)
[0111]mlIC:CACTCATTCA C TACCCTACGT(SEQ ID NO:10)
[0112]iIIA:CACTCATTCA A ATACCCTACGT(SEQ ID NO:11)
[0113]iIIT:CACTCATTCA T ATACCCTACGT(SEQ ID NO:12)
[0114]iIIG:CACTCATTCA G ATACCCTACGT(SEQ ID NO:13)
[0115]iIIC:CACTCATTCA C ATACCCTACGT(SEQ ID NO:14)
[0116]dll:CACTCATTCATACCCTACGT(SEQ ID NO:15)
[0117]其中斜体并下划线的部分为形成双链DNA后的toehold端，只下划线的部分为目标单链DNA与双链DNA的toehold端反应的部分，加粗的字体表示发生单碱基突变。通过Farfield软件和originlab软件进行数据处理分析。如图4b所示,可以清楚的区分待检测目标链11号位置是否发生了单碱基突变，从而实现单碱基突变检测。
[0118]实施例3:
[0119]利用双偏振干涉技术(DPI),在toehold协助下实时定量研究目标DNA的toehold末端反应的部分存在不同类型的单碱基突变进程。
[0120]采用同实施例1相同的操作步骤，只是的19号位置存在碱基突变(从左到右为5’ 一3’)，同时考虑各种不同突变类型，包括碱基错配、碱基缺失以及碱基插入。
[0121]生物素修饰固定链的序列(从左到右为5’ 一3’ )
[0122]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0123]互补链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0124]ACCiTACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0125]正确目标链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0126]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0127]存在单碱基突变目标链的序列(从左到右为5’ 一3’ )
[0128]ml9T:CACTCATTCAATACCCTA T GT(SEQ ID NO:8)
[0129]ml9A:CACTCATTCAATACCCTA A GT(SEQ ID NO:16)
[0130]ml9G:CACTCATTCAATACCCTA G GT(SEQ ID NO:17)
[0131]?19Α:CACTCATTCAATACCCTA Al CGT (SEQ ID NO: 18)
[0132]i19T:CACTCATTCAATACCCTA T CGT(SEQ ID NO:19)
[0133]i19G:CACTCATTCAATACCCTA C CGT(SEQ ID NO:20)
[0134]i19C:CACTCATTCAATACCCTA G CGT(SEQ ID NO:21)
[0135]dl9:CACTCATTCAATACCCTAGT(SEQ ID NO:22)
[0136]其中斜体并下划线的部分为形成双链DNA后的toehold端，只下划线的部分为目标单链DNA与双链DNA的toehold端反应的部分，加粗的字体表示发生单碱基突变。通过Farfield软件和originlab软件进行数据处理分析。如图4c所示,可以清楚的区分待检测目标链19号位置是否发生了单碱基突变，从而实现单碱基突变检测。
[0137]实施例4:
[0138]利用双偏振干涉技术(DPI)，在toehold协助下实时定量研究正确目标链5’端减少一个碱基以及待检测的突变目标链I号位置发生单碱基突变进程。
[0139]采用同实施例1相同的操作步骤，只是将待检测正确目标链5’端减少一个碱基以及待检测的突变目标单链I号位置发生突变，从而自发解离端变为6个碱基，可称为6/6toehold方案。研究不同toehold方案对单碱基突变检测的影响。
[0140]生物素修饰固定链的序列(从左到右为5’ 一3’ )
[0141] B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0142]互补链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0143]ACGl'ACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO:2)
[0144]正确目标链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0145]Correct:ACTCATTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO:23)
[0146]存在单碱基突变目标链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0147]mlT: Ti CTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:24)
[0148]其中斜体并下划线的部分为形成双链DNA后的toehold端，只下划线的部分为目标单链DNA与双链DNA的toehold端反应的部分，加粗的字体表示发生单碱基突变。通过Farfield软件和originlab软件进行数据处理分析。如图4d所示,不同的toehold方案下仍然可以清楚的区分待检测目标链是否发生了单碱基突变，从而实现单碱基突变检测。
[0149]实施例5:
[0150]利用荧光分光光度计分别研究溶液中单碱基突变检测的替换效率。
[0151]溶液中单碱基突变检测的研究，只是将固定链DNA⑵分子从5’端开始第5个碱基T上修饰上淬灭基团BHQ-2，互补链DNA(C)分子3’端修饰上荧光基团R0X。
[0152]淬灭基团修饰固定链的序列(从左到右为5’一3’)
[0153]TTTTT-BHQ-2- GCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:25)
[0154]荧光基团修饰互补链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0155]A( X Π? (l.GGTATTGAATGAGTGGATGC-ROX (SEQ ID NO:26)
[0156]正确目标单链的序列(从左到右为5’ 一3’)
[0157]Correct:ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0158]存在单碱基突变目标单链的序列(从左到右为5’ 一3’ )
[0159]mlT: T ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:4)
[0160]m6T: CACTC T TTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO:5)
[0161]ml6T: CACTCATTCAATACC T TACGT (SEQ ID NO:7)
[0162]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0163]iIIA: CACTCATTCA A ATACCCTACGT (SEQ ID NO: 11)
[0164]dll:CACTCATTCATACCCTACGT(SEQ ID NO:15)
[0165]ml9T:CACTCATTCAATACCCTA T GT(SEQ ID NO:8)
[0166]i19A:CACTCATTCAATACCCTA A CGT(SEQ ID NO:18)
[0167]dl9:CACTCATTCAATACCCTAGT(SEQ ID NO:22)
[0168]其中斜体并下划线的部分为形成双链DNA后的toehold端，只下划线的部分为目标单链DNA与双链DNA的toehold端反应的部分，加粗的字体表示发生单碱基突变。利用originlab数据处理，得到界面和溶液中单碱基突变检测的效率对比图，结果见下表。其中Φ表示界面或溶液的单碱基突变替换效率，Λ Φ表示正确目标链与突变链替换效率的差值。分析可知界面单碱基突变替换效率远远高于溶液中单碱基突变，采用界面单碱基突变检测方法可以大大提高检测信号。
[0169]
【权利要求】
1.一种配体修饰的双链DNA “toehold交换探针”分子，其特征在于:所述分子由N端带有配体的固定链和C端与固定链C端互补的互补链退火得到，从而固定链和互补链的互补区形成双链DNA刚性端，所述双链DNA刚性端靠近配体侧具有自发解离端，互补链的N端非互补部分形成粘性toehold末端。
2.根据权利要求1所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，其中所述配体选自由生物素，抗体，抗原组成的组。
3.根据权利要求1所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，其中所述双链DNA刚性端为10-50个碱基对，优选20个碱基对。
4.根据权利要求1所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，所述自发解离端为2_20个碱基对，优选5个碱基对。
5.根据权利要求1所述的双链DNA“toehold交换探针”分子，所述粘性toehold末端为2-20个碱基，优选6个碱基。
6.—种DNA芯片，其特征在于:所述芯片由权利要求1-5任一项所述的双链DNA “toehold交换探针”分子通过芯片表面的受体接枝于芯片表面形成。
7.根据权利要求6所述的DNA芯片,其中，所述受体选自由NeutrAvidin蛋白，抗原,抗体组成的组，所述芯片为微阵列芯片，其可以包含任意数量的反应池。
8.权利要求1-5任一项所述的双链DNA“toehold交换探针”分子和/或权利要求6_7任一项所述的芯片用于 检测单碱基突变的用途。
9.一种检测单碱基突变的方法，其中包括以下步骤: 1)将不同种类待检测目标链DNA，与如权利要求1-5任一项所述的或如权利要求6或7中所述的芯片上接枝的双链DNA “toehold交换探针”分子发生链替换反应； 2)进行定性和/或定量检测。
10.根据权利要求9所述的方法，所述定性和/或定量检测包括: 1)加入荧光基团标记的报告链DNA，用荧光显微镜定性检测；其中所述荧光基团优选FAM ； 2)使用双偏振干涉技术(DPI)实时定量检测。
【文档编号】C12N15/11GK104164487SQ201410313153
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】梁好均, 徐华国, 黄福建 申请人:中国科学技术大学