一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法
【专利摘要】本发明属于家畜分子标记育种【技术领域】，具体涉及一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法。本发明根据水牛RBP3基因的两个突变位点，其核苷酸序列分别如序列表SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示，设计出两对引物，对杂交水牛的DNA进行PCR扩增，得到两种扩增产物；最后对所得到的扩增产物进行酶切、分型，从而快速、准确地辨别杂交水牛的三种核型。本发明首次证明上述两个突变位点与杂交水牛染色体核型相关，并且可以利用这两个突变位点快速鉴别杂交水牛的染色体核型，可以作为杂交水牛的分子标记选育手段，加速杂交水牛的选育效率。
【专利说明】-种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法。
【背景技术】
[0002] 亚洲水牛包括河流型（River Buffalo)和沼泽型（Swamp Buffalo)两个亚种。河 流型水牛主要产于南亚地区，例如尼里-拉菲水牛（巴基斯坦）和摩拉水牛（印度），沼 泽型水牛则以我国为最。水牛具有较强的抗病力和耐粗饲的特点，适应湿热气候，非常适 合我国南方地区饲养，南方地区鲜奶消费的缺口也可以由水牛奶填补。水牛奶因口感独 特，奶香味浓郁，其脂肪、蛋白质和钙、磷的含量比普通牛奶高而备受到人们的青睐，从而 激起了奶水牛业的兴起和快速发展。这些年来，在国家产业政策刺激下，水牛奶业日益受 到重视，在不久的将来，奶水牛行业必将成为南方奶业的重要支柱。但是水牛属于单胎动 物，繁殖力低，与黄牛相比，水牛具有发情期晚、发情不明显、受胎率低及产后发情间隔时间 长等特点，整体繁殖力低（王根林，2006)。水牛产奶量与荷斯坦牛相比，仅为其一半，沼 泽型水牛的产奶量更低。在现代化养殖的条件下，仅靠自然繁殖是远远不能满足需要的， 因此一般都会引进河流型水牛进行杂交以提高水牛的繁殖性能和产奶量。河流型水牛染 色体数目是 50 (Dutt MK，Bhattacharya P. Chromosomes of the Indian water Buffalo. Nature，1952, 27:1129-1129)，而沼泽型水牛为 48 (Berardino DD，Iannuzzi L. Chromosome banding homologies in Swamp and Murrah Buffalo. The Journal of Heredity,1981, 72:183-188)。导致两者染色体数目不同的原因是，沼泽型水牛最大的1号染色体，基因 和形态上与河流型水牛4和9号染色体极为相似，相当于河流型水牛第4号染色体短 臂的端粒和9号染色体的着丝粒串联融合，形成一条染色体（Berardino DD，Iannuzzi L. Chromosome banding homologies in Swamp and Murrah Buffalo. The Journal of Heredity，1981，72:183-188)。两个亚种之间会杂交产生染色体为49的后代，这些后代之 间是可育的，相互杂交会产生48、49和50三种不同染色体数的后代。根据有关的研究表明， 杂交水牛的繁殖性能比纯种有所降低，主要体现在其核型数2n = 49的杂交水牛会产生异 常配子，导致胚胎发育的不正常，最终导致胚胎在早期便死亡，宏观上表现为情期配种受胎 率和年受胎率分别降低12. 3%和6. 4%，产仔间隔长达97. 6天（黄右军，尚江华，梁梦玫， 张秀芳，黄芬香.河流型水牛与沼泽型水牛杂交后代（2n = 49)染色体遗传与繁殖力的研 究.遗传，2003, 25 (2) :155-159)。若通过核型水平对水牛进行选择，那么对杂交水牛群的 整体繁殖能力将有显著的提升，辨别杂交水牛核型数也显得非常重要。
[0003] 传统鉴定核型的方法是采用取外周血淋巴细胞培养一段时间后，加入秋水仙素使 细胞分裂停留在中期，再低渗固定，制作滴片，通过染色体照片的对比分析对染色体数目进 行分组，观测和描述组内各染色体形态和特征，进而确定其染色体组型并阐明生物的染色 体组成。但是该方法较为繁琐，周期长，费时费力，成本也不低，检测大群体杂交水牛便非 常麻烦，不符合现代化大规模养殖的发展方向。然而快速检测杂交水牛核型的方法依旧没 有相关文献证明已经正在研究或者研究出来，甚至连这方面的探索也没有文献资料可供查 询。哺乳动物中，亚种间由于长时间的地理和生殖隔离，相同的基因也会有不同的突变和演 化。在水牛的亚种杂交中，不同核型的杂交水牛在特定染色体上的基因会有所区别，这些区 别会体现在碱基序列上。因此本研究依据分子标记的应用和杂交水牛核型分析，将二者联 系起来，建立利用分子标记快速检测杂交水牛核型的方法，该方法尚无相关文献发表或说 明，属于创新型研究，可快速方便大规模检测杂交水牛的核型，改良群体结构，从而提高繁 殖和泌乳性能，加快杂交水牛的品种改良速度。
[0004] 分子标记技术应用非常广泛，尤其在亚种的鉴别上，亚种间由于长时间的地理和 生殖隔离，相同的基因也会有不同的突变和演化通过分子标记便可找出这些差异，加以辨 另IJ。敖光辉等人利用SSR对籼粳稻亚种之间进行标记差异，发现差异明显（敖光辉，王丽，魏 琴，周黎军.釉粳稻亚种间分子标记差异分析.安徽农业科学，2008, 36 (5) :1778-1780);张 晓璐利用分子标记在虎亚种识别中达到极高的准确率（张晓璐.虎亚种识别的分子遗传学 技术的研究.[硕士学位].哈尔滨：东北林业大学图书馆，2005)，可见分子标记在鉴别亚种 方面是非常方便准确，具有极大的优势。不同核型的杂交水牛在特定染色体（河流型4和9 号染色体，沼泽型1号染色体）的数量上有所区别，2n = 48核型的水牛拥有两条沼泽型1号 染色体，无河流型4和9号染色体；2n = 49核型的水牛拥有一条沼泽型1号染色体，河流型 4和9号染色体个一条；2n = 50核型的水牛无沼泽型1号染色体，拥有两条河流型4和9号 染色体。这些区别会导致位于这些染色体上的基因序列，在不同核型杂交水牛上会有差异， 利用分子标记方法，可以找到不同核型之间基因序列的稳定性差异，从而辨别核型。经过大 量的文献查找，有如下基因位于以上3条染色体中：AC02、ACTA1、CSF1R、CSF2、CGN1、GAPDH、 GLI、IFNG、IGF1、RBP3、LDHB、LYZ、TPI1、LDLR、EEF2。其中，后两个在河流型水牛9号染色体 上（Iannuzzi L,Cnriabbam,Via A. A genetic physical map in river Buffalo (Bubalus bubalis,2n = 50). Caryologia,1998, 5:311-318 ；Nahas SE, Hondt HA, Soussa SF, Ghor AE, Hanssan AA. Assignment of new loci to river Buffalo chromosomes confirms the Nature of chromosomes4and5.J.Anim. Breed. Genet, 1999,116:21-28)。通过大量的试验 最终从RBP3基因上找到符合条件的突变位点，可以较为准确快速地辨别不同核型的杂交 水牛。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于建立一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的新方法。
[0006] 通过优化外周血淋巴细胞培养方法获得杂交水牛的染色体数目，选取定位于沼泽 型水牛1号染色体上的RBP3基因进行扩增测序，找到特异性突变位点，与染色体数目进行 对比，通过凝胶的条带的区别来鉴别染色体数量的多少。
[0007] 以黄牛的DNA为模板设计引物，得到可辨别核型的水牛RBP3基因的两个突变位 点，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。RBP3-1的365bp处有一 个A365-T365的碱基突变；在RBP3-2的442bp处有一个G442-A442的碱基突变，两者可以 辨别杂交水牛的三种核型。
[0008] 设计了可以辨别核型的RBP3基因的两段DNA片段的引物对，所述的RBP3-1引物 对的正向引物为 5'-GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3'（SEQ ID NO :3)，反向引物为 5'-TCCTTA CCTATGTGACGCTTGACG-3 (SEQ ID NO :4);所述的 RBP3-2 引物对的正向引物为 5' -AACACCTAT CCACGACCTTTATCAT-3'（SEQ ID NO :5)，反向引物为 5'-AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3'（ SEQ ID NO ：6)〇
[0009] -种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法，包括以下步骤：
[0010] 1)提取杂交水牛的总DNA ;
[0011] 2)根据水牛RBP3基因的两个突变位点的核苷酸序列，设计两组引物对-- RBP3-1引物对和RBP3-2引物对，其中：
[0012] RBP3-1 的正向引物为 5' -GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3'，
[0013] RBP3-1 的反向引物为 5' -TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3' ；
[0014] RBP3-2 的正向引物为 5' -AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3'，
[0015] RBP3-2 的反向引物为 5' -AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3' ；
[0016] 3)分别用步骤2)中的两组引物对杂交水牛的DNA进行PCR扩增，得到两种扩增产 物；
[0017] 4)分别对步骤3)所得到的两种扩增产物进行酶切、分型：RBP3_1引物对的扩增产 物选用Ecil内切酶，酶切条带中出现2条带确认为2N = 50核型；RBP3-2引物对的扩增产 物选用Drdl内切酶，酶切条带中出现1条带确认为2N = 48核型，酶切条带中出现3条带 确认为2N = 49核型。
[0018] 步骤3)中的PCR扩增体系为：双蒸水8μ L、Mixl0y L、正向引物0. 5μ L、反向引物 0. 5yL、杂交水牛 DNAlyL。
[0019] 步骤4)中所述的酶切，是将两种扩增产物5 μ L分别与双蒸水3. 5 μ L、 lOXBufferl μ L、10U/ μ L的内切酶0· 5 μ L混匀后离心，37°C培养箱放置2-4h。
[0020] 本发明的效果是：本发明可以快速、准确地鉴别杂交水牛染色体核型数，可以作为 杂交水牛的分子标记选育手段，加速杂交水牛的选育效率。
[0021] 更详细的技术方案见《【具体实施方式】》。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1 :是本发明的技术流程示意图。
[0023] 图2 :是水牛RBP3基因一个片段RBP3-1的DNA序列、突变位点及引物。
[0024] 图3 :是水牛RBP3基因另一个片段RBP3-2的DNA序列、突变位点及引物。
[0025] 图 4 :是 RBP3-1 的 365bp 处 A365-T365 的碱基突变。
[0026] 图5 :是三种核型的RBP3-1酶切电泳图谱。
[0027] 图 6 :是 RBP3-2 的 442bp 处 G442-A442 的碱基突变。
[0028] 图7 :是三种核型的RBP3-2酶切电泳图谱。
[0029] 图8 :是2N = 48杂交水牛染色体核型。
[0030] 图9 :是2N = 49杂交水牛染色体核型。
[0031] 图10 :是2N = 50杂交水牛染色体核型。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1
[0033] (一）RBP3基因两段DNA序列PCR扩增
[0034] 1.引物设计
[0035] 用黄牛RBP3基因作模板序列，设计引物对，根据SEQ ID NO :1所述RBP3-1的正向 引物为 5' -GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3'，反向引物为 5' -TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3 ; 根据 SEQ ID N0 :2 所述 RBP3-2 的正向引物为 5'-AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3'，反向引 物为5' -AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3'。用普通PCR方法扩增杂交水牛RBP3基因的 两段DNA片段，PCR产物纯化和测序，通过序列分析获得如序列表SEQ ID N0 :1和SEQ ID NO :2所述的序列；在RBP3-1的365bp处有一个A365-T365的碱基突变；在RBP3-2的442bp 处有一个G442-A442的碱基突变。可辨别杂交水牛的不同核型。
[0036] 2. PCR产物的纯化和测序
[0037] PCR 扩增：
[0038] 1)SEQ ID N0:1
[0039] 20 μ L体系：双蒸水8 μ L、MixlO μ L、正向引物0· 5 μ L、反向引物0· 5 μ L、杂交水 牛 DNA1 μ L。扩增条件：94°C预变性 5min，94°C变性 40s，55. 2°C退火 40s，72°C延伸 40s，35 个循环，72°C再延伸5min，16°C保持5min。共51个样本，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检 测。
[0040] 2)SEQ ID NO :2
[0041] 20μ L体系：双蒸水8μ L、Mixl0y L、正向引物0. 5μ L、反向引物0. 5μ L、杂交水牛 DNA1 μ L。扩增条件：94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，35个循 环，72°C再延伸5min，16°C保持5min。共51个样本，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。 送公司测序。
[0042] (二）PCR-RFLP诊断方法建立
[0043] RFLP 检测：
[0044] 1)SEQ ID N0:1
[0045] 10yL酶切体系：双蒸水3. 5yL、10XBufferlyL、限制性内切酶 EcilO. 5μ LdOU/μ L)、PCR产物5μ L。将样品混匀后离心，37°C培养箱放置2-4h。2%琼 脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
[0046] 扩增杂交水牛基因组DNA得到了 1008bp左右大小的特异性扩增片段，序列分析结 果表明在365bp处存在A365-T365突变。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中T是 没有形成酶切位点的等位基因，A是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三 种基因型，其中TT型为未发生酶切的纯合型（电泳检测时只有1008bp -条DNA带），AA型 为发生酶切的纯合型（电泳检测时出现642bp和365bp两条DNA带），TC为杂合型（电泳 检测时出现1008bp、642bp和365bp三条DNA带）。
[0047] 2)SEQ ID NO :2
[0048] 10yL酶切体系：双蒸水3. 5yL、10XBufferlyL、限制性内切酶 DrdlO. 5 μ L(10U/ μ L)、PCR产物5 μ L。将样品混匀后离心，37°C培养箱放置2-4h。2%琼 脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
[0049] 扩增杂交水牛基因组DNA得到了 747bp左右大小的特异性扩增片段，序列分析结 果表明在442bp处存在G442-A442突变.该基因突变位点由两个等位基因控制，其中A是 没有形成酶切位点的等位基因，G是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三 种基因型，其中AA型为未发生酶切的纯合型（电泳检测时只有747bp -条DNA带），GG型 为发生酶切的纯合型（电泳检测时出442bp和305bp两条DNA带），AG为杂合型（电泳检 测时出现747bp、442bp和305bp三条DNA带）。
[0050] 水牛RBP3基因的两个突变位点可以辨别杂交水牛的核型，对51头杂交水牛进行 酶切分型，核型数由传统的核型分析方法所得，得到的数据如下：
[0051] 表1不同核型的酶切条带统计（个体数）
[0052]
【权利要求】
1. 一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 提取杂交水牛的总DNA ; 2) 根据水牛RBP3基因的两个突变位点的核苷酸序列，设计两组引物对--RBP3-1引 物对和RBP3-2引物对，其中： RBP3-1 的正向引物为 5' -GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT-3'， RBP3-1 的反向引物为 5' -TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG-3' ； RBP3-2 的正向引物为 5' -AACACCTATCCACGACCTTTATCAT-3'， RBP3-2 的反向引物为 5' -AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC-3' ； 3) 分别用步骤2)中的两组引物对杂交水牛的DNA进行PCR扩增，得到两种扩增产物； 4) 分别对步骤3)所得到的两种扩增产物进行酶切、分型：RBP3-1引物对的扩增产物选 用Ecil内切酶，酶切条带中出现2条带确认为2N = 50核型；RBP3-2引物对的扩增产物选 用Drdl内切酶，酶切条带中出现1条带确认为2N = 48核型，酶切条带中出现3条带确认 为2N = 49核型。
2. 如权利要求1所述的快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法，其特征在于：步骤3)中 的PCR扩增体系为：双蒸水8 μ L、MixlO μ L、正向引物0. 5 μ L、反向引物0. 5 μ L、杂交水牛 DNA1μ L。
3. 如权利要求1或2所述的快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法，其特征在于：步骤 4)中所述的酶切，是将两种扩增产物5 μ L分别与双蒸水3. 5 μ L、10 X Buffer 1 μ L、10U/ μ L 的内切酶〇. 5 μ L混匀后离心，37°C培养箱放置2-4h。
【文档编号】C12Q1/68GK104152549SQ201410332529
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】熊家军, 杨利国, 苏皖中, 刘青, 刘孝然, 张华林, 张祖翔, 杨菲菲, 潘斌 申请人:华中农业大学, 湖北劲牛牧业有限公司