Araf基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因【技术领域】，具体涉及一种ARAF基因在制备诊断特发性矮小症的产品中的应用。本发明所述的ARAF基因可以作为诊断特发性矮小症的特异性标记基因，使特发性矮小症的诊断更加准确、快速。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于基因【技术领域】，具体涉及一种ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产 品中的应用。 ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用 【背景技术】
[0002] 人ARAF基因 （Genbank No. NC_000023. 11)为原癌基因，编码的蛋白质属于RAF丝 氨酸/苏氨酸蛋白的亚家族，在细胞生长和发展中发挥重要作用。研究表明，其参与细胞信 号转导和肿瘤转移，但未见其关于影响身高的报道。
[0003] 矮小症不仅是影响儿童生长的重要疾病，而且也将成为影响患儿成人后社会心理 状态的重要因素，包括其自信心、受教育水平、就业、社交能力、与异性接触等多方面。特发 性矮小症是指在相似的生活环境下，身高低于同种群、同性别和同年龄的正常人群平均身 高2个标准差者（-2SD)，或低于第3百分位数，并且除外生长激素缺乏症、Turner综合征、 宫内发育迟缓、甲状腺功能减退、慢性器质性疾病及心理社会剥夺等一系列原因所致的矮 小。由于其在疾病发展过程中除了身材矮小，并无其他异常的症状、体征及实验室检查，在 临床工作中，往往容易被人忽视。但研究数据表明，特发性矮小症占矮小症病因的80%左 右。
[0004] 生长是一个受多因素影响的复杂过程，主要包括遗传因素和环境因素两方 面。在大多数导致矮小症的疾病中，生长激素释放激素-生长激素-胰岛素生长因子 (GHRH-GH-IGF-1)内分泌轴的异常成为致病的重要环节，如生长激素缺乏症（growth hormone deficiency，GHD)。IGF-1是GH发挥生物学作用的有效成分，IGFBP-3是IGF-1在 血液循环中的主要载体，可延长IGF-1在循环中的半衰期，稳定IGF-1生物学活性。在特发 性矮小症中，其GH、IGF-1、IGFBP-3均正常，其真正的致病机制就需要我们进一步的探索。 由于特发性矮小症患者在诊断过程中基本排除了后天环境所致的生长障碍，如：摄食困难、 慢性器质性疾病、心理疾患或严重情感障碍，遗传因素并成为其可能致病的关键因素。
[0005] 关于特发性矮小症的致病机理，现研究发现主要与三类基因有关：第一类 基因为与身高有直接关系的基因，这些基因的突变、缺失将会直接导致一定程度的生 长缺陷。这类基因主要集中在内分泌生长激素释放激素-生长激素-胰岛素样生长 因子（GHRH-GH-IGF-1)内分泌轴上的靶基因，包括生长激素释放激素受体（Growth hormone-releasing hormone receptor, GHRHR)基因，生长激素受体（Growth hormone receptor，GHR)基因，膜岛素样生长因子-1 (Insulin-like growth factor-1，IGF-1)基 因，生长激素与其受体结合后活化的信号通路中的关键基因 STAT5b基因以及参与IGF-1生 物学效应的不稳定亚基（Acid-labile subunit，ALS)基因等，这些基因的变异使得IGF-1 生成、利用障碍，从而引起生长落后。由于这些基因上的变异会引起明显的生长缺陷，所 以其在正常人群中的发生率很低，只能通过对患者或患者亲属的基因检测研究中发现。 第二类基因为与身高关联稍小的基因，范围较广，是通过全基因组关联分析（Genomewide association study，GWAS)以单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP) 为标记而进行的病例-对照关联分析而找到的可能影响身高的相关基因。第三类基因为影 响干骺端成熟的相关基因。其中，以第一类基因，即GHRH-GH-IGF-1内分泌轴上的靶基因的 变异为主要机制。目前，关于ARAF基因与特发性矮小症发生的关系尚不清楚，有待进一步 研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种ARAF基因在制备诊断 特发性矮小症产品中的应用，该ARAF基因的变异可作为特发性矮小症诊断的标记分子。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用；
[0009] 所述的ARAF基因的突变模式符合X染色体隐性遗传模式，其变异位点为 47430769,序号：rs55852926 ;若变异位点为碱基C，则为野生型；若为碱基G，则为突变型； 其中，男性含一条X染色体，检测出突变XaY即可确定为特发性矮小症；女性含两条X染色 体，需检测出纯合突变XaXa才确定为特发性矮小症；
[0010] 所述的诊断特发性矮小症产品包括：通过以基因组DNA为模板的PCR、RT-PCR、实 时定量PCR、DNA -代测序、DNA二代测序、免疫检测、蛋白芯片、原位杂交或基因芯片诊断特 发性矮小症的产品。
[0011] 所述的通过以基因组DNA为模板的PCR诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特 异性扩增ARAF基因的引物；
[0012] 所述的特异性扩增ARAF基因的引物优选为引物ARAF-F和引物ARAF-R，具体序列 如下：
[0013] ARAF-F :5, -CCTCAGATCCTGGCCACAAT-3,；
[0014] ARAF-R :5' -GACAGGGGGCTCAGTCTTTG-3' ；
[0015] 所述的通过RT-PCR诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性扩增ARAF基因 的引物；
[0016] 所述的通过实时定量PCR诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性扩增 ARAF基因的引物；
[0017] 所述的通过DNA-代测序诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性扩增 ARAF基因的引物；
[0018] 所述的通过DNA二代测序诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性扩增 ARAF基因的引物；
[0019] 所述的通过免疫检测诊断特发性矮小症的产品包括：与ARAF基因编码的蛋白特 异性结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；
[0020] 所述的通过蛋白芯片诊断特发性矮小症的产品包括：与ARAF基因编码的蛋白特 异性结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体；
[0021] 所述的通过原位杂交诊断特发性矮小症的产品包括：与ARAF基因的核酸序列杂 交的探针；
[0022] 所述的通过基因芯片诊断特发性矮小症的产品包括：与ARAF基因的核酸序列杂 交的探针；
[0023] 在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对ARAF蛋白特异性的 抗体。例如：将提纯的人ARAF基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗 体。同样，表达人ARAF蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。 根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备（例 如：Kohler et al. Nature256:495, 1975 ；Kohler et al. , Eur. J. Immunol. 6:511, 1976 ； Kohler et al. Eur. J. Immunol. 6:292, 1976)。本发明的抗体包括可以阻抑或增强ARAF功 能的抗体，也可以是不影响人ARAF功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人ARAF基因产 物的片段或功能域致免疫而产生，而人ARAF基因产物及其片段可以用重组方法产生或用 多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的ARAF基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞例 如大肠杆菌（Escherichia coli)中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形 式如：甲基化、糖基化或磷酸化ARAF蛋白或多肽结合的抗体，可以利用各种真核细胞如：酵 母、蠕虫或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到的抗体。
[0024] 在本发明中，所述探针可以是RNA、DNA、RNA-DNA嵌合体、PNA及其他衍生物。一般 涉及的探针没有长度的限制，只要能够完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任 何长度都可以。所述探针的长度可以短至1〇、15、20、25个碱基对，同样，所述的探针长度也 可以长至50、60、100、150、260个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对于 杂交效率、信号特异性有不同的影响，所以一般而言探针的长度至少有12个碱基对，最多 一般不超过28个碱基对，与目标氨基酸序列互补的长度以12?22个碱基对为最佳。所述 探针互补序列最好少于5个碱基对，以免影响杂交效率。
[0025] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0026] 本发明证明ARAF基因在特发性矮小症患者家系的患者中，其变异发生的频率明 显高于家系的非患者以及非矮小的正常中国人中，且其突变模式符合X染色体隐性遗传模 式，因此，在研究中所发现的ARAF基因（c. 1954C>G ;p. Glu578Asp)可以作为诊断特发性矮 小症的特异性标记基因，使特发性矮小症诊断更加准确、快速。 【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是实施例1中先证者垂体MRI增强扫描结果图。
[0028] 图2是实施例1中先证者骨龄摄片结果图。
[0029] 图3是实施例1中特发性矮小症家系图。
[0030] 图4是实施例1中10名矮小家系核心成员特发性矮小症家系分型（DXS1226)胶 电泳结果图。
[0031] 图5是实施例1中10名矮小家系核心成员特发性矮小症家系分型（DXS1214)胶 电泳结果图。
[0032] 图6是实施例1中10名矮小家系核心成员特发性矮小症家系分型（DXS1068)胶 电泳结果图。
[0033] 图7是实施例1中10名矮小家系核心成员特发性矮小症家系分型（DXS993)胶电 泳结果图。
[0034] 图8是实施例1中10名矮小家系核心成员特发性矮小症家系分型（DXS991)胶电 泳结果图。
[0035] 图9是实施例1中10名矮小家系核心成员特发性矮小症家系分型（DXS990)胶电 泳结果图。
[0036] 图10是实施例1中10名矮小家系核心成员特发性矮小症家系分型（DXS1106)胶 电泳结果图。
[0037] 图11是实施例1中10名矮小家系核心成员特发性矮小症家系分型（DXS8055)胶 电泳结果图。
[0038] 图12是实施例1中8个STR分型在家系中的分布示意图。
[0039] 图13是实施例1中家系连锁分析图。
[0040] 图14是实施例1中外显子建库流程图。
[0041] 图15是实施例1中候选基因（ARAF基因）翻译蛋白变异前（ARAF) 2级结构重建 图。
[0042] 图16是实施例1中候选基因（ARAF基因）翻译蛋白变异后（ARAF) 2级结构重建 图。
[0043] 图17是实施例1中候选基因（ARAF基因）翻译蛋白（ARAF) 3级结构的3D重建图。
[0044] 图18是实施例2中候选基因（ARAF基因）在特发性矮小症家系中的变异图。 【具体实施方式】
[0045] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0046] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制 造厂商所建议的实验条件。
[0047] 实施例1
[0048] (一）特发性矮小症家系先证者临床资料收集
[0049] (1)追问先证者病史，予以全身体格检查，测量身高、体重、上部量、下部量,计算体 重指数（BMI)。
[0050] (2)予以抽血检测以下项目：
[0051] 1)生长激素、胰岛素生长因子-1、胰岛素生长因子结合蛋白_3 ;
[0052] 2)总甲状腺素、总三碘甲状原氨酸、游离甲状腺素、游离三碘甲状原氨酸、促甲状 腺激素、甲状旁腺素、降钙素；
[0053] 3)皮质醇（8:00)、促肾上腺皮质激素（8:00)、尿游离皮质醇（24小时）；
[0054] 4)性激素；
[0055] 5)骨代谢相关检查：血清钙、血清磷、尿钙（24小时）、尿磷（24小时）、碱性磷酸 酶、25-羟维生素 D;
[0056] 6)电解质（恥1+、1(1+、1%2+)肝功能仏1^451')、肾功能出^、(^ &)、血脂（〇101^6、 HDL-C.LDL-C)；
[0057] (3)对其进行精氨酸试验、左旋多巴与吡啶斯的明联合激发试验，观察其生长激素 变化：
[0058] 精氨酸试验：予以25%精氨酸0.58/1^在30分钟内静脉注射，于〇111；[11、3〇111；[11、 60min、90min、120min静脉采血测其生长激素。在试验过程中，需监测其心率、血压、消化道 不良反应及局部不良反应。
[0059] 左旋多巴与批陡斯的明联合激发试验：予以左旋多巴10mg/kg,批陡斯的明lmg/ kg同时口服，于0min、30min、60min、90min静脉采血测生长激素。在试验过程中，需监测其 心率、血压、消化道不良反应及局部不良反应。
[0060] (4)予以下丘脑垂体MRI影像学，骨龄射片检查；
[0061] 检测检查结果：
[0062] 先证者，18岁男性，因"生长迟缓11年"就诊于中山大学孙逸仙纪念医院内分泌 内科。患者于11年前（7?8岁）觉身高较同龄人矮小，成绩良好，无腹泻、发热，未予重 视。9年前（9?10岁），身高114. 3cm(同龄正常身高-2SD :123. 9cm)，广州市儿童医院就 诊，予以生长激素治疗1月，自觉无明显长高，未继续使用。至今身高139. 5cm(同龄正常身 高-2SD :160. 5cm)，每年长高1?2cm，已变声，无实物模糊、头晕、头痛、恶心等不适。足月 顺产，母孕期无特殊，出生体重2. 8kg，身长49cm (同龄正常身高-2SD :46. 9cm)。
[0063] 体格检查示：查体：血压 100/71mmHg，体重 33kg，身高 139. 5cm，BMI16. 4kg/m2,上 部量63cm，下部量150cm。矮小体型。毛发分布正常，皮下无水肿，胡须稀疏，可见喉结。胸 廓对称，肋软骨轻度外翻。双肺呼吸音清晰，未闻及干湿啰音。心率80次/分，心率齐，心 音有力，各瓣膜听诊区未闻及病理性杂音。腹部平软，无压痛，反跳痛，未及包块。肝、脾、胆 囊肋下未触及。肠鸣音正常，4次/天。脊柱生理性弯曲存在，四肢活动自如，无畸形。生理 反射存在，病理反射未引出。
[〇〇64] 实验室检查结果显示，先证者的甲状腺素、促肾上腺激素释放激素、皮质醇、 性腺激素、骨代谢相关检查、血电解质、肝肾功能、血脂等大致正常。胰岛素生长因 子（IGF-l)325.0ng/mL(正常参考值：163?384ng/mL);胰岛素样生长因子结合蛋白 (IGF-BP3)4. 58ug/mL (正常参考值：3. 4?7. 8ng/mL)。精氨酸试验、左旋多巴与吡啶斯的 明联合激发试验结果如表1、表2。
[0065] 表1精氨酸刺激试验结果
[0066]
【权利要求】
1. ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用。
2. 根据权利要求1所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征在 于： 所述的ARAF基因的突变模式符合X染色体隐性遗传模式，其变异位点为47430769,序 号：rs55852926 ;若变异位点为碱基C，则为野生型；若为碱基G，则为突变型；其中，男性含 一条X染色体，检测出突变XaY即可确定为特发性矮小症；女性含两条X染色体，需检测出 纯合突变XaXa才确定为特发性矮小症。
3. 根据权利要求2所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征在 于： 所述的诊断特发性矮小症产品包括：通过以基因组DNA为模板的PCR、RT-PCR、实时定 量PCR、DNA -代测序、DNA二代测序、免疫检测、蛋白芯片、原位杂交或基因芯片诊断特发性 矮小症的产品。
4. 根据权利要求3所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征在 于： 所述的通过以基因组DNA为模板的PCR诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性 扩增ARAF基因的引物。
5. 根据权利要求4所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征在 于： 所述的特异性扩增ARAF基因的引物为引物ARAF-F和引物ARAF-R，具体序列如下： ARAF-F :5' -CCTCAGATCCTGGCCACAAT-3' ； ARAF-R :5' -GACAGGGGGCTCAGTCTTTG-3'。
6. 根据权利要求3所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征在 于： 所述的通过RT-PCR诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性扩增ARAF基因的引 物。
7. 根据权利要求3所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征在 于： 所述的通过实时定量PCR诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性扩增ARAF基 因的引物。
8. 根据权利要求3所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征在 于： 所述的通过DNA -代测序诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性扩增ARAF基 因的引物； 所述的通过DNA二代测序诊断特发性矮小症的产品包括至少一对特异性扩增ARAF基 因的引物。
9. 根据权利要求3所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征在 于： 所述的通过免疫检测诊断特发性矮小症的产品包括：与ARAF基因编码的蛋白特异性 结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体； 所述的通过蛋白芯片诊断特发性矮小症的产品包括：与ARAF基因编码的蛋白特异性 结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
10.根据权利要求3所述的ARAF基因在制备诊断特发性矮小症产品中的应用，其特征 在于： 所述的通过原位杂交诊断特发性矮小症的产品包括：与ARAF基因的核酸序列杂交的 探针； 所述的通过基因芯片诊断特发性矮小症的产品包括：与ARAF基因的核酸序列杂交的 探针。
【文档编号】C12Q1/68GK104109718SQ201410345951
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】杨川, 段山, 李瑾, 李芳萍, 严励 申请人:中山大学孙逸仙纪念医院, 深圳市人口和计划生育科学研究所