一种制备紫花白及原生质体的方法及其专用试剂的制作方法
【专利摘要】一种制备紫花白及原生质体的方法，包括如下步骤：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体活力率的测定；用于该方法的专用试剂包括酶溶液A、B；酶溶液A包括MES、KCl、Mannitol、CellulaseR10、PectolyaseY-23、BSA、CaCl2和ddH2O，酶溶液B包括MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl2和ddH2O。本发明简单易行，实验成本低，可重复性高；利用紫花白及叶片得到的原生质体产量可达4.8×106个/g，活力率为92.26%，可为紫花白及体细胞杂交、突变体诱导、细胞器分离、原生质体转化、生物反应器构建提供良好材料基础。
【专利说明】一种制备紫花白及原生质体的方法及其专用试剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备紫花白及原生质体的方法及其专用试剂，具体为用紫花白及的组培苗叶片获取原生质体的方法，属于植物细胞工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]紫花白及striata (Thunb.) Reichb.f.具有收敛止血、消肿生肌等功效，用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症，也具有抗菌镇痛、抗肿瘤活性、强身健体、增加机体免疫力，具有药用功能和保健作用。同时，紫花白及也是工业、化妆品和园林园艺的重要原材料，在国内外均有广阔市场。通过细胞工程方法对紫花白及进行遗传改良具有重要的经济价值和社会意义。
[0003]植物原生质体是指除去了全部细胞壁后质膜包裹的细胞，是用作生物反应器和基础研究的理想材料。分离纯化的原生质体，可以用于开展植物细胞信息传递、能量转换、细胞壁合成机理、膜的结构与功能、核质关系、突变体诱导、杂交或自交不亲和的机理、细胞间的相互作用、植物激素的作用机理、分离各种细胞器、引入细胞器、原生质体转化导入外源基因、生物反应器构建等方面的研究。
[0004]本发明人首先搜集了全国多个紫花白及种源地的种质资源，用叶片为研究材料进行酶解，释放得到原生质体，纯化后获得了纯度高、活力强的原生质体，为紫花白及的的种质资源拓展、商业化遗传育种、基因改良、生物反应器制备药用成分等后续研究奠定了一定的物质基础。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:利用紫花白及的叶片获取纯度高、活力强、密度大的原生质体的方法以及用于该方法的专用试剂。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:
一种制备紫花白及原生质体的方法，包括如下步骤:原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体活力率的测定；
(1)原生质体的分离:选取紫花白及组培再生苗或野生植株大而饱满的叶片，在超净工作台中将其横向切割为Irnm的片段，放入60mm培养皿中，将酶溶液A倒入培养皿里，用镊子将所取材料浸泡入酶溶液A中，pH值为5.7，根据材料的多少来决定酶溶液A的使用量，酶溶液A与材料比例为10ml: lg，然后用封口胶封口，置于恒温摇床上黑暗处理4 h，震荡条件为26-28°C、120rpm，即终止酶解，此时原生质体已充分分离出来，用吸头轻轻吹打叶片，以释放出全部原生质体,获得原生质体酶溶液；
(2)原生质体的纯化:将原生质体酶溶液用200目的细胞筛过滤，再将滤液置于2ml离心管中，在100g/min下离心3min,使原生质体沉降,然后弃上清夜,将沉降物缓慢加入酶溶液B中，在100 g/min的转速下离心3_5次，每次3min，最终得到纯化的原生质体；
(3)原生质体产量的测定:将纯化的原生质体转入2ml酶溶液B中，轻轻吹打，使原生质体分布均匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液A中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体的产量，计算结果以每克叶片原生质体数表示(个/g);
(4)原生质体活力率的测定:利用FDA (荧光素双醋酸酯)透过原生质体后，在酯酶的作用下迅速分解，放出荧光素，使有活力的原生质体发出黄绿色的荧光从而来鉴定原生质体的活力；计算原生质体活力时需在明视野下观察原生质体总数，然后再转到荧光下记录有活力的原生质体数，最后计算原生质体活力率。
[0007]所述培养皿为直径60 _、高15 mm的玻璃培养皿。
[0008]一种用于制备紫花白及原生质体的方法的专用试剂，包括酶溶液A和酶溶液B ； 所述酶溶液A配比如下:
成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
Cellulase RlO 150.0mg
Pectolyase Y-23 50.0mg
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul
所述酶溶液 A 中成分浓度为:Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml ；
所述酶溶液B配比如下:
成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul
所述酶溶液 B 中成分浓度为:Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml。
[0009]与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果: 1.本发明提供的紫花白及原生质体诱导与纯化技术体系简单易行，实验成本低，可重复性闻;
2.本发明首次对紫花白及进行原生质体的分离纯化后，将为紫花白及的种质资源拓展、遗传育种、基因工程等后续研究奠定一定的物质基础；
3.本发明利用紫花白及叶片得到的原生质体产量可达4.8X 16个/g，活力率为92.26%，可为紫花白及体细胞杂交和遗传转化等生物技术育种提供良好的受体系统。
[0010]【专利附图】
【附图说明】:图1是本发明所述紫花白及原生质体(10X40)；
图2是本发明所述紫花白及经4小时酶解后未纯化的原生质体(10X20)；
图3是本发明纯化后的紫花白及原生质体(10X20)；
图4是本发明纯化后经FDA染色后的紫花白及原生质体(10X20)。
[0011]【具体实施方式】:
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0012]一种制备紫花白及原生质体的方法，包括如下步骤:原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体活力率的测定；
(1)原生质体的分离:取紫花白及的组培再生苗或野生植株，选取大而饱满的叶片，升汞灭菌后用镊子撕去表皮，将其横向切割为Irnm的片段，放入洁净的培养皿中，将准备好的酶溶液A倒入培养皿里，混合均匀，根据所取材料的多少来决定需要多少酶溶液A的使用量，以刚好淹没所取材料为宜，然后用封口胶封口，置于恒温摇床上黑暗处理4 h，震荡条件为26-28°C、120 rmp。酶解停止后，用吸管轻吹打叶片，以释放出全部原生质体(附图1、2)，获得原生质体酶溶液；
(2)原生质体的纯化:将原生质体酶溶液用200目的细胞筛过滤，以除去酶解后留下的残余碎片，再将过滤好的滤液置于2ml离心管中，在100g/min下离心3min，使原生质体沉降，弃上清液后加入酶溶液B,在100g/min下离心3min,漂洗3_5次,最终得到纯化的原生质体(附图3)。
[0013](3)原生质体产量的测定:向纯化的原生质体中加入2ml酶溶液B中，轻轻吹打，使原生质体分布均匀，将盖玻片盖在血球计数板上的计数室上面，用移液枪吸取一滴酶溶液B滴在盖玻片的一侧边缘，使其沿着盖玻片和计数板间的缝隙慢慢深入计数室内，直至酶溶液B充满计数室为止；然后将计数板置于倒置显微镜下计数，计数时保持显微镜载物台水平，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液A中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体的产量，计算结果以每克叶片细胞数表示(个/g)。
[0014](4)原生质体活力率的测定:利用FDA (荧光素双醋酸酯)透过原生质体后，在酯酶的作用下迅速分解，放出荧光素，使有活力的原生质体发出黄绿色的荧光从而来鉴定原生质体的活力(附图4)。计算原生质体活力时先在明视野下观察原生质体总数，然后再转到荧光下记录发出黄绿色荧光的原生质体数，最后计算原生质体活力率。
[0015]所述培养皿为直径60 mm、高15 mm玻璃培养皿。
[0016]一种用于制备紫花白及原生质体方法的专用试剂，包括酶溶液A和酶溶液B ； 所述酶溶液A配比如下:
成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
Cellulase RlO 150.0mg
Pectolyase Y-23 50.0mg
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)ddH20 100.0ul
所述酶溶液 A 中成分浓度为:Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml。
[0017]所述酶溶液B配比如下:
成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul
所述酶溶液 B 中成分浓度为:Mannitol 0.16 mol/ml，MES 0.2 mol/ml，KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml。
[0018]所述原生质体活力计算方法为:以有活力的原生质体占全部观察原生质体的百分数来表示，即原生质体的活力率=(被染色的原生质体数/原生质体总数)X 100%。计数测量三次，取平均值。
[0019]本发明为获取纯度高、活力强、密度大的紫花白及原生质体提供了行之有效的技术手段，为白及的种质资源拓展、商业育种、基因改良等后续研究以及以该原生质体作为生物反应器奠定了物质基础。
尽管上文所述已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，对之作一些修改或改进，可以使这项发明更具可操作性。因此，在不偏离本发明的基础上所做的这些修改或改进，均属本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种制备紫花白及原生质体的方法，其特征是，该方法包括如下步骤:原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体活力率的测定； (1)原生质体的分离:选取紫花白及组培再生苗或野生植株大而饱满的叶片，在超净工作台中将其横向切割为Irnm的片段，放入60mm培养皿中，将酶溶液A倒入培养皿里，用镊子将所取材料浸泡入酶溶液A中，pH值为5.7，根据材料的多少来决定酶溶液A的使用量，酶溶液A与材料比例为10ml: lg，然后用封口胶封口，置于恒温摇床上黑暗处理4 h，震荡条件为26-28°C、120rpm，即终止酶解，此时原生质体已充分分离出来，用吸头轻轻吹打叶片，以释放出全部原生质体,获得原生质体酶溶液； (2)原生质体的纯化:将原生质体酶溶液用200目的细胞筛过滤，再将滤液置于2ml离心管中，在100g/min下离心3min,使原生质体沉降,然后弃上清夜,将沉降物缓慢加入酶溶液B中，在100 g/min的转速下离心3_5次，每次3min，最终得到纯化的原生质体； (3)原生质体产量的测定:将纯化的原生质体转入2ml酶溶液B中，轻轻吹打，使原生质体分布均匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液A中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体的产量，计算结果以每克叶片原生质体数表示(个/g); (4)原生质体活力率的测定:利用FDA(荧光素双醋酸酯)透过原生质体后，在酯酶的作用下迅速分解，放出荧光素，使有活力的原生质体发出黄绿色的荧光从而来鉴定原生质体的活力；计算原生质体活力时需在明视野下观察原生质体总数，然后再转到荧光下记录有活力的原生质体数，最后计算原生质体活力率。
2.根据权利要求1所 述的制备紫花白及原生质体的方法，其特征是:所述培养皿为直径60 mm、高15 mm的玻璃培养皿。
3.一种用于权利要求1所述的制备紫花白及原生质体的方法的专用试剂，包括酶溶液A和酶溶液B ； 所述酶溶液A配比如下: 成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)
Mannitol 5.0ml (0.8 mol)
Cellulase RlO 150.0mg
Pectolyase Y-23 50.0mg
BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul 所述酶溶液 A 中成分浓度为:Mannitol 0.16 mo I/ml, MES 0.2 mol/ml, KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml ； 所述酶溶液B配比如下: 成分加入量
MES 1.0ml (200 mmol)
KCl 2.5ml (80 mmol)Mannitol 5.0ml (0.8 mol) BSA 1.0ml (10 mg)
CaCl2 400.0ul (250 mmol)
ddH20 100.0ul
所述酶溶液 B 中成分浓度为:Mannitol 0.16 mo I/ml, MES 0.2 mol/ml, KCl 0.032mol/ml, CaCl2 0.625 mol/ml。
【文档编号】C12N5/04GK104130970SQ201410371645
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】徐德林, 钱刚, 张 林, 杨璐萍, 储士润, 沈访 申请人:遵义医学院