囊胚培养液及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种囊胚培养液及其制备方法，囊胚培养液，包含对受精卵进行处理培养的组合物、杀菌剂及选择性添加的指示剂和选择性添加人血清白蛋白。本发明的囊胚培养液各项指标达到体外培养液的标准使用安全且易于判断培养液是否变质，为辅助生殖技术提供有力保证。
【专利说明】囊胚培养液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人工辅助生殖技术，尤其涉及一种囊胚培养液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 囊胚培养液对胚胎的发育培养已广泛应用于试管婴儿技术中。囊胚培养液的目的 是：一是提供胚胎存活并发育的营养物质；二是为胚胎的生存提供必要的环境。囊胚培养 液的用途：实验室或临床在二氧化碳环境下对体外囊胚提供分裂发育的营养物质及必要环 境。
[0003] 目前，我国辅助生殖技术中的囊胚培养液依赖进口成品，成本高且溶液的有效性 的好坏不能很好的表现，如果在培养液变质后仍继续使用将对实验或临床操作造成不可逆 转的结果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种各项指标达到体外培养液的标准使用安全，易于判断 培养液是否变质的囊胚培养液，为辅助生殖技术提供有力保证。
[0005] 本发明的囊胚培养液，包含对受精卵进行处理培养的组合物、杀菌剂。
[0006] 所述杀菌剂为庆大霉素，浓度9. 5-10. 5mg/L。
[0007] 所述组合物中包含氯化钠90. 25-99. 75mmol/L，氯化钾2. 375-2. 625 mmol/L，磷 酸二氢钾 〇· 333-0. 368mmol/L，硫酸镁 0· 19-0. 21mmol/L，葡萄糖 3. 04-3. 36mmol/L，氯化 钙 1. 615-1. 785 mmol/L，乳酸钠 1. 418-1. 567g/L，丙酮酸钠 0· 095-0. 105mmol/L，碳酸氢钠 23. 75-26. 25mmol/L，丙氨酰谷氨酰胺 0. 95-1. 05mmol/L，牛磺酸 0. 38-0. 42mmol/L，4-羟乙 基哌嗪乙磺酸HEPES 2. 375-2. 625mmol/L，非必需氨基酸0. 95-1. 05% (v/v)，必需氨基酸 1. 9-2. 1% (v/v)，维生素 0· 95-1. 05% (v/v)，庆大霉素 9. 5-10. 5mg/L。
[0008] 所述非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨 酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几种。
[0009] 所述必需氨基酸为L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖 氨酸、L-蛋氨酸、苯L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的一种或者 几种。
[0010] 所述维生素为氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫 氨酸中的一种或者几种。
[0011] 囊胚培养液的溶剂采用超纯水。
[0012] 本发明所述囊胚培养液中可以选择性加入指示剂为酚红，浓度4. 75-5. 25mg/L。
[0013] 本发明囊胚培养液中含有人血清白蛋白9. 5-10. 5%，v/v，可在使用时添加或分装 前添加。
[0014] 本发明的囊胚培养液的ρΗ=7· 20-7. 50,渗透压260-290m0sm/Kg。
[0015] 本发明囊胚培养液的制备方法，包括下面步骤： (1) 基础液的配制 a、 先按照比例称量各组分，并分开放置； b、 先将称量好的组分（除杀菌剂、选择性添加指示剂、碳酸氢钠以及人血清白蛋白）溶 于超纯水中，溶解过程中遵循先固体后液体，NaHC0 3最后加入的原则； c、 向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、选择性添加指示剂和碳酸氢钠； d、 将配置好的基础液放置37°C、5. 5%的C02培养箱中平衡6-12小时，此步骤用来调节 PH在7. 20-7. 50范围内； (2) 囊胚培养液的原液配制 a、 将囊胚培养液的基础液在超净工作台下利用0. 2 μ m的滤膜过滤除菌，得到滤液A ; b、 在滤液A中加入人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得到囊胚培养液的原液；或者 省略该步骤，将滤液A作为囊胚培养液的原液，医生使用时添加人血清白蛋白； (3) 囊胚培养液原液的处理 在无菌环境下对囊胚培养液原液进行分装封口，得到囊胚培养液，将其放置冰箱或冷 库内保存； (4) 囊胚培养液的检测 检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠 胚试验来判断囊胚培养液是否合格。
[0016] 本发明的有益效果是，1、本发明囊胚培养液的原料均是已经证明其安全性的物 质，在制备过程中其溶剂采用超纯水，超纯水的总有机碳（T0C)超低，避免了因杂质过多影 响测定的结果。2、国内还没有成型的用于试管婴儿技术的培养液，此配方和制备方法为国 内的试管婴儿技术提供了有力的保证，避免了国外产品因长途运输带来的不明因素，同时 配制工艺操作简单合理，检测严密，能够提供新鲜的培养液供生殖中心或科研院所使用。3、 使用抗生素来抑制细菌的生长，如庆大霉素是一种广谱、热稳定性好的抗生素，在囊胚培养 液中添加庆大霉素可以有效抑制细菌的生长。4、囊胚培养液中选择性添加指示剂酚红，酚 红在pH变化时颜色变化明显，pH在7. 20-7. 50范围内酚红溶液为粉红色到橙红色，当pH值 小于6. 8时为黄色，当pH值大于8. 4时为红色，变色比较明显，囊胚培养液的pH7. 20-7. 50 在此范围内溶液为粉红色到橙红色，当囊胚培养液颜色与此不符时，说明该囊胚培养液变 质，不能用于实验或临床，从而避免了使用变质囊胚培养液而产生的风险。囊胚培养液中如 不含酚红指示剂，则溶液呈透明、清澈，在有效期内能保证无菌且正常使用，如变浑浊则不 能使用。
【具体实施方式】
[0017] 以下通过实施例对本发明做进一步的说明。
[0018] 一、囊胚培养液配方及制备方法 表1囊胚培养液的配方
【权利要求】
1. 囊胚培养液，其特征在于，包含对受精卵进行处理培养的组合物、杀菌剂。
2. 根据权利要求1所述的囊胚培养液，其特征在于，所述杀菌剂为庆大霉素，浓度 9. 5-10. 5mg/L〇
3. 根据权利要求1所述的囊胚培养液，其特征在于，所述组合物中包含氯化钠 90. 25-99. 75mmol/L，氯化钾 2. 375-2. 625 mmol/L，磷酸二氢钾 0· 333-0. 368mmol/L，硫 酸镁 0· 19-0. 21mmol/L，葡萄糖 3. 04-3. 36mmol/L，氯化钙 1. 615-1. 785 mmol/L，乳酸 钠 1. 418-1. 567g/L，丙酮酸钠 0. 095-0. 105mmol/L，碳酸氢钠 23. 75-26. 25mmol/L，丙氨 酰谷氨酰胺〇. 95-1. 05mmol/L，牛磺酸0. 38-0. 42mmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES 2. 375-2. 625mmol/L，非必需氨基酸 0. 95-1. 05%，v/v，必需氨基酸 1. 9-2. 1%，v/v，维生素 0.95-1.05%，v/v，庆大霉素 9. 5-10. 5mg/L。
4. 根据权利要求3所述的囊胚培养液，其特征在于，所述非必需氨基酸为L-丙氨酸、 L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几 种。
5. 根据权利要求3所述的囊胚培养液，其特征在于，所述必需氨基酸为L-精氨酸、 L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、苯L-丙氨酸、L-苏 氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的一种或者几种。
6. 根据权利要求3所述的囊胚培养液，其特征在于，所述维生素为氯化胆碱、叶酸、肌 醇、烟酰胺、D-泛酸、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫氨酸中的一种或者几种。
7. 根据权利要求1所述的囊胚培养液，其特征在于，囊胚培养液的溶剂采用超纯水。
8. 根据权利要求1-7任一项所述的囊胚培养液，其特征在于，所述培养液中选择性添 加指示剂酚红，浓度4. 75-5. 25mg/L。
9. 根据权利要求1-7任一项所述的囊胚培养液，其特征在于，所述培养液中含有人血 清白蛋白9. 5-10. 5%，v/v，可在使用时添加或分装前添加。
10. 制备权利要求1-9所述的囊胚培养液的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 基础液的配制 a、 先按照比例称量各组分，并分开放置； b、 先将除杀菌剂、选择性添加指示剂、碳酸氢钠、人血清白蛋白外的称量好的组分溶于 称量好的超纯水中； c、 向步骤b所得溶液中加入称量好的杀菌剂、选择性添加指示剂和碳酸氢钠； d、 将配置好的基础液放置37°C、5. 5%的C02培养箱中平衡6-12小时； (2) 囊胚培养液的原液配制 a、 将囊胚培养液的基础液在超净工作台下利用0. 2 μ m的滤膜过滤除菌，得到滤液A ; b、 在滤液A中加入人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得到囊胚培养液的原液；或者 省略该步骤，将滤液A作为囊胚培养液的原液，医生使用时添加人血清白蛋白； (3) 囊胚培养液原液的处理 在无菌环境下对囊胚培养液原液进行分装封口，得到囊胚培养液，将其放置冰箱或冷 库内保存； (4) 囊胚培养液的检测 检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠 胚试验来判断囊胚培养液是否合格。
【文档编号】C12N5/073GK104140949SQ201410388960
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】王维华, 吕汝举, 刘美静, 庄巍, 王英超 申请人:山东威高新生医疗器械有限公司