抗肿瘤的特异性剪接因子及制备方法
【专利摘要】本发明公开一种抗肿瘤的特异性剪接因子，以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.ID.No3和SEQ.ID.No.4所示序列为引物，得到PCR产物A；以人类细胞cDNA为模板，SEQ.ID.No5和SEQ.ID.No.6所示序列为引物，得到PCR产物B；以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.ID.No7和SEQ.ID.No.8所示序列为引物进行，得到PCR产物C；以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.ID.No.9和SEQ.ID.No.10所示序列为引物进行，得到PCR产物D；PCR产物A与PCR产物B融合得到如SEQ.ID.No.1所示特异性剪接因子Ⅰ；PCR产物C与PCR产物D相融合得到、如SEQ.ID.No.2所示特异性剪接因子Ⅱ。
【专利说明】抗肿瘤的特异性剪接因子及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗肿瘤药物及制备方法，尤其是一种可以用来控制肿瘤中血管内皮生长因子的异常选择性剪接，达到抑制肿瘤血管生成及进一步抑制肿瘤进展的抗肿瘤的特异性剪接因子及制备方法。
【背景技术】
[0002]目前人们发现，肿瘤细胞除了基因组序列突变以外，还具有一个显著的生物学特征，即大量的基因被剪接成与正常功能相反的亚型(异常选择性剪接)，这也是肿瘤表观遗传学改变导致细胞表型改变的关键环节。现有用来调控恶性肿瘤中基因的异常选择性剪接事件主要是通过反义核苷酸技术来实现的，即将反义核苷酸输送至人体内，抑制而非促进目的基因mRNA前体的选择性剪接，从而控制某些基因mRNA前体中发生的异常剪接事件，但其应用具有一定的局限性。
[0003]肿瘤转移的一个重要基础是为肿瘤转移提供养分的肿瘤中远端血管的生成，是由肿瘤细胞分泌多种蛋白因子激活周围的一系列相关蛋白表达，促进新生血管生成，而血管内皮生长因子(VEGF-A)是肿瘤细胞分泌的一种重要刺激血管生成因子。最近研究表明VEGF-A基因的不同剪接体在血管生成过程中具有相反功能，一种剪接体(VEGF-Axxx)促进血管生成，而另一种新鉴定的剪接体(VEGF-Axxxb)却能够抑制血管发生。在正常人类组织中，除胎盘以外，VEGF-A主要是以VEGF-Axxxb亚型存在，这样VEGF-A在成人组织中抑制血管生成。然而在肿瘤细胞中，VEGF-A主要是以VEGF-Axxx亚型存在，诱导血管生成，增加血管通透性，促进肿瘤发展，并形成远端的肿瘤转移灶，所以通过抑制VEGF-Axxx亚型的生成能够提供一种阻遏血管生成的肿瘤治疗手段。
[0004]然而，如果采用现有的反义核苷酸技术等抑制手段，就会不加区分地对促进血管生成和抑制血管生成的两种剪接体均进行抑制，而如VEGF-A的功能被全部抑制后，体内其他信号传导通路会发挥代偿功能而促进肿瘤进展。
[0005]迄今为止，尚未见有利用特异性剪接因子通过靶向性调控VEGF两种剪接体，以实现抑制肿瘤血管生成并进一步阻遏恶性肿瘤进展的报道。
【发明内容】
[0006]本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可以用来控制肿瘤中血管内皮生长因子的异常选择性剪接，达到抑制肿瘤血管生成及进一步抑制肿瘤进展的抗肿瘤的特异性剪接因子及制备方法。
[0007]本发明的技术解决方案是:一种抗肿瘤的特异性剪接因子，其特征在于:由特异性剪接因子I和特异性剪接因子II构成，所述特异性剪接因子I的序列如SEQ.1D.N0.1所示；所述特异性剪接因子II的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0008]一种上述抗肿瘤的特异性剪接因子的制备方法，其特征在于按如下步骤进行:
a.以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.3所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.4所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物A ;以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.5所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.6所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物B。
[0009]b.以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.7所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.8所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物C ；以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.9所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.10所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物D。
[0010]C.将所得到的PCR产物A与PCR产物B相融合，得到特异性剪接因子I ;将所得到的PCR产物C与PCR产物D相融合，得到特异性剪接因子II。
[0011]本发明提供的特异性剪接因子，包含可以结合RNA的特异性识别序列、能够抑制异常选择性剪接体VEGF-Axxx的功能序列和促进选择性剪接体VEGF-Axxxb的功能结构域序列，可以控制肿瘤中血管内皮生长因子的异常选择性剪接，促进选择性剪接体VEGF-Axxxb的合成，从而达到抑制肿瘤血管生成及进一步抑制肿瘤进展的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是特异性剪接因子I促进VEGF-Axxxb剪接体合成的效果图。
[0013]图2是特异性剪接因子I抑制体外培养肿瘤细胞生长的效果图。
[0014]图3是特异性剪接因子I抑制体外培养肿瘤细胞克隆形成的效果图。
[0015]图4是特异性剪接因子I抑制体外培养肿瘤细胞非锚式依赖性集落形成能力效果图。
[0016]图5是特异性剪接因子I抑制肿瘤细胞迁移效果图。
[0017]图6是特异性剪接因子I抑制体外血管内皮细胞微管形成效果图。
[0018]图7是特异性剪接因子I对荷瘤裸鼠体内抑瘤效果图。
【具体实施方式】
[0019]实施例1:
a.利用聚合酶链扩增反应(PCR)，以从人类细胞中提取的RNA逆转录后得到的cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.3所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.4所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物A，即得到抑制VEGF-Axxx剪接体合成的功能结构域序列；再以获得的人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.5所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.6所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物B，即得到特异性RNA识别结构域序列；
b.以所得到的人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.7所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.8所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物C，即得到促进VEGF-Axxxb剪接体合成的功能结构域序列；再以获得的人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.9所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.10所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物，即得到特异性RNA识别结构域序列；
c.将所得到的PCR产物A与PCR产物B相融合，得到特异性剪接因子I，序列如SEQ.1D.N0.1所示；将所得到的PCR产物C与PCR产物D相融合，得到特异性剪接因子II，序列如 SEQ.1D.N0.2 所示。
[0020]实验:实验例I本发明实施例的特异性剪接因子I对血管内皮生长因子VEGF-A的剪接调控实验
作用原理如图1A所示:特异性剪接因子I可以通过抑制使用近端3’剪接位点来促进VEGF-Axxxb剪接体的合成；特异性剪接因子II则是通过促进远端3’剪接位点的使用来增加VEGF-Axxxb剪接体的生成。
[0021]利用人肺腺癌细胞系A549来建立特异性剪接因子瞬时表达的细胞系，并进一步检测特异性剪接因子I对肿瘤细胞中血管内皮生长因子的选择性剪接调控。
[0022]将肺癌细胞按1.2xl05/well接种于24孔板，培养12hr后，用不同浓度(lug, 2ug, 5ug)本发明实施例的特异性剪接因子I ,与Iipofectamine 2000相混合并瞬时转染细胞；然后继续培养48hr，收集细胞，并分为两份。其中一份利用TRizol试剂来提取总RNA，并利用逆转录试剂盒(RTIII，Invitrogen)获得cDNA，之后以2ul cDNA作为模板扩增VEGF-A的两种功能完全相反的剪接体(VEGF-Axxx和VEGF-Axxxb),最后通过Typhoon机器进行扫描分析并对两种剪接体的含量进行定量。结果如图1B所示，VEGF-Axxxb剪接体的含量明显大于阴性对照组，尤其是浓度为5ug时，VEGF-Axxxb剪接体的含量可达阴性对照组的10倍。另外一部分细胞则利用蛋白质裂解液来提取总蛋白，之后利用Western Blot来检测血管内皮生长因子抑制血管生成剪接体VEGF-Axxxb的含量，结果如图1C所示:含本发明特异性剪接因子I的实验组中VEGF-A165b的含量明显大于阴性对照组。
[0023]阴性对照组与实验组一样，是以人肺腺癌细胞系A549来建立特异性剪接因子瞬时表达的细胞系。所用特异性剪接因子也由两部分组成，其中一部分为与实验组的特异性剪接因子I具有识别不同序列的RNA结合结构域，另外一个结构域则是与特异性剪接因子I的功能结构域相一致的序列。该阴性对照组所用特异性剪接因子序列如SEQ.1D.N0.11所
/Jn ο
[0024]结果显示:虽然该阴性对照也具有调控剪接的功能结构域，但是其RNA识别结构域却不能结合VEGF基因，因而不具有功能。
[0025]特异性剪接因子I是通过特异性结合来发挥功能的，具有很好的靶向性，能显著性地促进VEGF-Axxxb剪接体的合生成。
[0026]实验例2:特异性剪接因子I抑制体外培养肿瘤细胞生长的实验
将分别稳定表达特异性剪接因子I和阴性对照的乳腺癌细胞(?ο5)分别种于1cm细胞培养皿中，每两天收集细胞并计数，至第9天，之后根据相对于接种细胞当天(第O天)的细胞数倍数变化进行绘制生长曲线，如图2所示。结果显示特异性剪接因子I能够显著性地抑制乳腺癌肿瘤细胞生长。
[0027]实验例3:特异性剪接因子I抑制体外培养肿瘤细胞克隆形成的实验
将分别稳定表达特异性剪接因子I和阴性对照的肺癌细胞(5000个)分别种于1cm细胞培养皿中，在37°C孵育2周后，将形成的细胞克隆利用甲醛固定，并利用结晶紫染色。结果如图3所示:与阴性对照相比较，特异性剪接因子I能够明显地抑制肺癌细胞的克隆形成能力。
[0028]实验例4:特异性剪接因子I抑制体外培养肿瘤细胞非锚式依赖性集落形成能力实验
等体积的1.2%琼脂和2x DMEM混匀后平铺在6孔板里形成0.6%的底层琼脂。将分别稳定表达特异性剪接因子I和阴性对照的乳腺癌细胞与琼脂混匀形成终浓度为0.3%的细胞琼脂混合液，之后种在底层琼脂之上，将该6孔板置于37°C的潮湿孵箱中，培养3周之后利用甲醛固定细胞，并用结晶紫染色后计数，如图4所示:结果显示，特异性剪接因子I能够显著性地抑制乳腺癌细胞的非锚式依赖性集落形成能力。
[0029]实验例5:特异性剪接因子I抑制肿瘤细胞迁移的实验
分别将稳定表达特异性剪接因子I和阴性对照的乳腺癌细胞种于6孔板中，当细胞密度达到90%时，利用无菌枪头在细胞培养皿的底端划一条线，并分别于划线后的Oh和16h照像来分析肿瘤细胞的迁移能力，如图5所示。结果表明特异性剪接因子I可以抑制乳腺癌细胞的远处迁移能力。
[0030]实验例6:特异性剪接因子I抑制体外血管内皮细胞微管形成的实验
分别将稳定表达特异性剪接因子I和阴性对照的肺癌细胞产生的培养基收集，将该培养基过滤后加入到人脐带血管内皮细胞(HUVEC)中，检测条件培养基对血管内皮细胞在体外形成微管的能力，如图6所示。结果显示与阴性对照相比，稳定表达特异性剪接因子I的肺癌细胞产生的条件培养基能够显著性抑制血管内皮细胞的微管形成能力。
[0031]以上结果表明，特异性剪接因子I的应用能够真正地通过调控血管内皮生长因子的选择性剪接来促进抑制血管生成剪接体的合成，进而阻遏肿瘤的进展。
[0032]实施例7:特异性剪接因子I对荷瘤裸鼠体内抑瘤实验
取 6 只雌性 Nu/Nu (Charles River Laboratories:NU-Foxnlnu)裸鼠，合格证号:SCXK(京)2007-0001)，4周龄，体重为13~15g，每只裸鼠左侧下肢皮下注射体积为200 μ I的如实验例I经特异性剪接因子I处理过的人肺癌Α549细胞悬液(含I X 17个细胞)，而在每只裸鼠右侧下肢皮下注射体积为200 μ I的如实验例I经阴性对照处理过的人肺癌Α549细胞悬液(含IXlO7个细胞)，在注射后每天观察一次裸鼠成瘤情况；到第5天有2只明显成瘤，到第8天有6只成瘤；当至21天时，处死裸鼠，取出它们的瘤块，检测裸鼠体内所形成肿瘤的大小，结果如图7所示，表明特异性剪接因子I能够显著性地抑制裸鼠体内肿瘤的形成。
[0033]体内抑瘤实验结果显示，整个实验过程中，各个裸鼠体重间没有差异，Ρ>0.05，可认为特异性剪接因子I对裸鼠生长没有明显影响，也说明其没有明显毒副作用；特异性剪接因子I能明显延缓荷瘤裸鼠的肿瘤生长，与对照组比较，裸鼠平均瘤体积从第8天差异均有显著性，Ρ〈0.05 ;第21天处死裸鼠测瘤重也得到与瘤体积同样的结果，这与前面的体外实验结果相一致。
[0034]本发明实验组2~7所述阴性对照的建立方式均与实验例I相同。
【权利要求】
1.一种抗肿瘤的特异性剪接因子，其特征在于:由特异性剪接因子I和特异性剪接因子II构成，所述特异性剪接因子I的序列如SEQ.1D.N0.1所示；所述特异性剪接因子II的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
2.一种如权利要求1所述的抗肿瘤的特异性剪接因子的制备方法，其特征在于按如下步骤进行: a.以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.3所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.4所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物A ;以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.5所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.6所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物B ； b.以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.7所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.8所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物C ;以人类细胞cDNA为模板，以SEQ.1D.N0.9所示序列为上游引物，以SEQ.1D.N0.10所示序列为下游引物进行PCR反应，得到PCR产物D ； c.将所得到的PCR产物A与PCR产物B相融合，得到特异性剪接因子I;将所得到的PCR产物C与PCR产物D相融合，得到特异性剪接因子II。
【文档编号】C12N15/10GK104163871SQ201410393625
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】汪洋, 王泽峰, 于静, 张文静, 陈丹 申请人:大连医科大学