微生物发酵生产去氢表雄酮的方法
【专利摘要】本发明提出了一种微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，利用重组耻垢分枝杆菌单水相发酵转化植物甾醇生产去氢表雄酮，包括如下步骤：敲除原件5228up-kan-5228down的构建；重组菌株的构建；菌种繁殖及发酵转化。本发明利用分子生物学方法敲除3β-羟基类固醇脱氢酶编码基因MSMEG_5228，得到重组耻垢分枝杆菌，之后在单水相发酵体系中以植物甾醇为原料生产去氢表雄酮。本发明降低了生产成本，去氢表雄酮质量收率达90％以上，同时简化了提取工艺，降低了提取成本，污染小、环保压力小、极具工业生产的优势。
【专利说明】微生物发酵生产去氢表雄酮的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及留体类药物中间体的生产方法，特别是利用重组耻垢分枝杆菌的微生 物发酵生产去氢表雄酮的方法。
【背景技术】
[0002] 去氢表雄酮（dehyroepiandrosterone，DHEA)是一种C19类固醇载体化合物，化学 名称为3 β -羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式C19H2802，结构式为：
[0003]
【权利要求】
1. 一种微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：利用重组耻垢分枝杆菌单水 相发酵转化植物留醇生产去氢表雄酮，包括如下步骤： 第一步，敲除原件5228up-kan_5228down的构建； 第二步，重组菌株的构建； 第三步，菌种繁殖及发酵转化。
2. 根据权利要求1所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：第一步 中： 首先，通过PCR技术获得来源于耻垢分枝杆菌mc2155带有酶切位点EcoRI及Hindlll 的MSMEG_5228全基因片段；以带有EcoRI及Hindlll的MSMEG_5228全基因片段为模板， PCR扩增出带有EcoRI及Acc65I位点的MSMEG_5228上游片段；将其连接于克隆载体pUC18 上构建质粒pUC-5228up ; 其次，以耻垢分枝杆菌表达载体PMV261作为模板，通过PCR技术获得带有Acc65I及 Xbal位点的kan基因片段，将其连接于pUC-5228up构建质粒pUC-5228up-kan ; 接着，以带有EcoRI及Hindlll的MSMEG_5228全基因片段为模板，PCR扩增出带 有Xbal及Hindlll位点的MSMEG_5228下游片段，将其连接于pUC-5228up-kan构建 pUC-5228up-kan-5228down ； 最后，通过PCR技术获得大量敲除原件5228up-kan-5228down。
3. 根据权利要求2所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：所述 MSMEG_5228上游片段全长540bp，MSMEG_5228下游片段全长575bp。
4. 根据权利要求1所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：第二步中， 先制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，再将第一步获得的敲除原件5228up-kan-5228down电转 入到耻垢分枝杆菌感受态细胞中。
5. 根据权利要求4所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于： 耻垢分枝杆菌感受态细胞的制备方法为： 将浓度1〇7_1〇9个/ml的耻垢分枝杆菌以10 %的接种量接种于LB液体培养基中，LB液 体培养基中含有重量百分比0. 05%的吐温80,在30°C下培养至0D6QQ = 0. 4-0. 5时，添加终 浓度为1 %的甘氨酸继续培养，当〇D6(?达到0. 8-1. 0时开始制备感受态； 首先，将菌悬液以ll〇〇〇g、4°C离心20min后，弃去上层清液；接着，以培养基体积1/6 量添加含有重量百分比0.05%吐温80的甘油吐温溶液重悬菌体，甘油溶液的质量百分比 为10%，400(^、41：离心101^11，离心完毕后弃去上层清液 ；以上述方法再次洗菌2次，使用 的甘油吐温溶液体积分别为培养基体积的1/15及1/30 ;最后，以2mL、重量百分比10%的 甘油重悬菌体，分装于50μ 1/1. 5mLEP管内-70°C保藏备用。
6. 根据权利要求1所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：第三步中， 先在种子培养基中进行菌种繁殖，待种子培养基〇D 6(15时，以30-50%的接种量将其接 入装有发酵培养基和植物留醇的发酵罐中进行发酵转化。
7. 根据权利要求6所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：第三步中 发酵转化的条件为：温度29-31°C、罐压0. 05MPa、搅拌转速150-200rpm、培养周期4-5day。
8. 根据权利要求6所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：所述 种子培养基的组分为：葡萄糖 8-15g/L、Κ2ΗΡ040· 3-0. 8g/L、MgS04 · 7Η200· 3-0. 8g/L、 (NH4)2Fe(S04)2 · 6Η200· 02-0. 06g/L、CaC034. 5-5. 5g/L 和柠檬酸 1· 0-3. Og/L，所述种子培养 基的 pH 为 6. 0-8.0。
9. 根据权利要求6所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：所述发酵 培养基的组分为：葡萄糖15_30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆饼粉10-25g/L，K 2HP040 . 5-1. 0g/ L，MgS04 · 7Η200· 5-1. Og/L，（NH4)2Fe(S04)2 · 6Η200· 02-0. 06g/L，CaC034. 5-5 . 5g/L，柠檬酸 1. 0-3. Og/L 和 NH4N030. 5-1. 5g/L，所述发酵培养基的 pH 为 6. 0-8. 0。
10. 根据权利要求6所述的微生物发酵生产9 α -羟基雄烯二酮的方法，其特征在于： 植物甾醇与发酵培养基的重量百分比为1-2. 5%。
【文档编号】C12N15/66GK104232673SQ201410414313
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】宋浩雷, 刘倩, 孟祥雷, 张亚朋 申请人:宋浩雷