一种竹节参法呢基焦磷酸合酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种竹节参法呢基焦磷酸合酶基因及其应用，利用引物P1:5’ATGAGCGATCTGAAGACGAG3’；P2:5’TCACTTTTGCCGCTTATATATC3’，以竹节参cDNA为模板，进行PCR扩增，可获得竹节参法呢基焦磷酸合酶基因，其序列为SEQIDN0.1所示。将获得的竹节参法呢基焦磷酸合酶蛋白基因通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高总皂苷含量的的转基因植株。为竹节参三萜皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。
【专利说明】一种竹节参法呢基焦磷酸合酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，主要涉及竹节参中法呢基焦磷酸合酶（Farnesyl diphosphate synthase，PjFPS)基因的克隆和应用。
【背景技术】
[0002] 竹节参（Panax japonicus C. A. Mey)属于五加科人参属（Panax L.)植物，是传统 的名贵药材之一，具有较高的药用价值，如增强人体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳以及保 护心肌等作用，主要的有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主， 同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。
[0003] 竹节参是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值。目前，中国 竹节参的野生资源近于濒危，人工栽培药材生长周期长，造成市场供不应求的现状，通过研 究竹节参中活性成分三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶， 实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控，进 一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。
[0004] 法呢基焦憐酸合酶（Farnesyl diphosphate synthase，FPS)基因在三廠类阜苷的 生物合成途径中起着重要的作用。FPS是一种异戊烯基转移酶，是类异戊二烯途径的一个关 键酶，它催化五碳原子的异戊烯基焦磷酸（IPP)和二甲基丙烯焦磷酸（DMPP)以1-4头尾 连续缩合反应，先形成10个碳的栊牛儿基焦磷酸（GGPP)，然后与另一分子异戊烯焦磷酸缩 合，形成15碳的法呢基焦磷酸（FPP)。FPP是植物体内留体、皂苷、多萜醇、倍半萜等许多萜 类衍生物质的合成前体，其合成直接关系竹节参中三萜类皂苷的含量，目前，FPS被公认为 是三萜类化合物生物合成途径中的关键酶之一。
[0005] 本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行竹节参全株的转录组测序及De novo拼接。分析找到竹节参中编码法呢基焦磷酸合酶的候选基因并进行体外克隆表达，验 证其功能。为竹节参三萜皂苷化合物的生物合成提供理论基础。
[0006] 在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的竹节参法呢 基焦磷酸合酶基因及其氨基酸序列，此基因编码的酶在竹节参中三萜皂苷化合物的生物合 成的过程中有重要的作用，本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来调控 竹节参中三萜皂苷化合物生物合成的关键点。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因，其序列为 SEQ ID NO. 1所示。该基因在三萜类皂苷的生物合成途径中起着重要的作用，是类异戊二 烯途径的一个关键酶，能催化IPP和DMPP缩合形成GGPP，然后再与异戊烯焦磷酸缩合形 成FPP，而FPP是植物体内留体、皂苷、多萜醇、倍半萜等许多萜类衍生物质的合成前体，其 合成直接关系竹节参中三萜类皂苷化合物的含量。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因编码的 蛋白质。，其序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本发明的最后一个目的在于提供一种竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因提 高竹节参总皂苷含量中的的应用。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，可提 高三萜皂苷化合物含量，从而调高竹节参的总皂苷含量。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0011] 一种竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因（以下称为PjFPS基因），其制备方法 如下：
[0012] 以正向引物 Pl: 5'ATGAGCGATCTGAAGACGAG3' ；反向引物 P2:5' TCACTTTTGCCGCTTATATATC3'，以竹节参cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系如下： IOXbuffer 2. 5ul，dNTP lul，引物 Pl 和 P2 各 lul，Taq 酶 0· 5ul，模版 lul，其余用水补足， 总体积共25111。941：预变性51^11，941：变性3〇8,561：退火3〇8,721：延伸458,721：保存 5min，35个循环。
[0013] 最终获得了 PjFPS基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO. 2 所示。
[0014] 一种竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因在提高竹节参总皂苷含量中的应用， 其应用过程如下：
[0015] 将竹节参法呢基焦磷酸合酶蛋白（SEQ ID NO. 2所示）对应的PjFPS基因（优选 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列）通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参，可获得高总皂苷 含量的的转基因植株。
[0016] 本发明的所要保护的内容还包括：
[0017] 编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列。
[0018] 含有本发明的竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因全序列或其ORF序列的重组 载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围。包括但不限 于植物表达载体PBI101，pCAMBIA1300。
[0019] 含有本发明的竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因全序列或其ORF序列的宿主 细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。包括但不限于大肠杆 菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、竹节参发根细胞。
[0020] 本发明的竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因的应用，包括用所述的重组载 体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得 到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的竹节参法呢基焦 磷酸合酶（PjFPS)基因全序列或其ORF序列的转化获得转基因生物体。包括但不限于烟草， 拟南芥，酵母，竹节参发根等。
[0021] 本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆 菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
[0022] 利用本发明的竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)，通过各种常规筛选方法，可筛选 出与竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂 等。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0024] 本发明所提供的竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因是首次从竹节参植物中 克隆制备所得，利用本发明的技术可以对竹节参等含有同类化合物的药用植物进行基因工 程改造，通过转基因来提高植物体内的三萜皂苷化合物的含量。竹节参法呢基焦磷酸合酶 (PjFPS)基因可参与竹节参三萜皂苷化合物的生物合成，本发明利用转基因技术得到了总 皂苷的高产植株。因此本发明为竹节参三萜皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供 理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为竹节参RNA凝胶电泳图。
[0026] 图2为PjFPS功能域预测分析。
[0027] 图3为PjFPS系统进化树。
[0028] 图4为表达载体pET28-P jFPS构建示意图。
[0029] 图5为酶促反应产物薄层色谱分析示意图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明， 均购自生物技术公司。
[0031] 实施例1 :
[0032] 竹节参转录组测序及数据分析
[0033] 1、样品采集
[0034] 竹节参植株来源于湖北恩施Panax japonicus C. A. Mey,分别取根莖，叶，花，果实 置液氮中速冻后，在_80°C冰箱中冷冻保存备用。
[0035] 2、竹节参总RNA的分离和检测
[0036] 对_80°C保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的Trizol法对样本进 行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行，加入一定浓度的PVP溶液（聚乙烯吡咯烷 酮），并适当加大β -巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和β -巯基乙醇后，采用高浓度NaAc 溶液析出RNA，DNase去除残留DNA完成RNA的纯化。用1. 0%琼脂糖电泳检测RNA的完整 性（图1)，用Nanodrop2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度，RNA样本置于-80°C 冰箱备用。
[0037] 3、转录组测序（RNA-Seq)
[0038] 用 oligo (dT)的磁珠从总 RNA 中富集 mRNA，接加入 fragmentation buffer 将 mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers)合成第一条 cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经 过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly (A)并连接测 序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代Solexa HiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。
[0039] 4、候选基因初步筛选
[0040] 通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5. 0构建系统发育树（图3)等软件分析 初步筛选到竹节参中编码法呢基焦磷酸合酶的候选基因。
[0041] 实施例2:
[0042] 竹节参法呢基焦磷酸合酶基因的克隆
[0043] 分析候选基因读码框范围，利用正向引物Pl: 5' ATGAGCGATCTGAAGACGAG3' ；反向 引物P2:5' TCACTTTTGCCGCTTATATATC3'，以竹节参的根茎cDNA为文库为模板，克隆候选基 因全长序列，链接到克隆载体pMD 18-T上并转化到大肠杆菌感受态细胞E. coli DH5a中， 步骤如下：
[0044] a)从_80°C超低温冰箱中取100 μ L感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；
[0045] b)加入5 μ L连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min ;
[0046] c) 42°C热激90s，迅速置冰上5min ;
[0047] d)向EP管中加入ImL LB液体培养基（不含抗生素），37°C 200rpm 45min ;
[0048] e)摇菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培养箱过夜；
[0049] f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养过夜选 取阳性克隆送样测序。
[0050] 至此获得了竹节参法呢基焦磷酸合酶基因，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0051] 实施例3:
[0052] PjFPS基因的生物信息学分析
[0053] 本发明涉及的竹节参法呢基焦磷酸合酶（PjFPS)基因全长为1029bp，其序列为 SEQ ID NO. 1所示，其中开放读码框位于1?1029bp，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO. 2所 示。将拼接分析好的法呢基焦磷酸合酶全长序列在NCBI数据库中进行Blast。该基因具有 典型的SE superfamily结构域，如图2。
[0054] 实施例4 :
[0055] PjFPS基因功能的研究
[0056] 1、表达载体的构建
[0057] 依据竹节参FPS基因全长序列（SEQ ID NO. 1)的0RF，设计扩增完整开放阅读框 的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点NcoI和NdeI，利用正向引物Pl : 5' CCATGGATGAGCGATCTGAAGACGAG3' ;反向引物 P2 :5' CATATGTCACTTTTGCCGCTTATATATC3' 进 行PCR反应，进行琼脂糖凝胶电泳，30min后照相，观察胶图，扩增片段为KMlbp左右，TA克 隆，提取质粒。
[0058] 用NcoI和NdeI双酶切含目的基因序列PjFPS和原核表达载体质粒pET_28a，酶切 产物经琼脂糖电泳后回收相应的片段，pET-28a载体与PjFPS目的基因片段经T4DNA连接 酶在16°C下进行连接反应16h，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，用50ug/mL卡那霉素筛 选，挑取阳性单克隆菌落扩大培养，提取质粒并进行酶切鉴定，选酶切鉴定正确的质粒命名 为 pET-28a/PjFPS。（图 4)
[0059] 2、蛋白的诱导表达
[0060] 将以上鉴定正确转化pET-28a/PjFPS质粒的BL21 (DE3)菌液5mL转入250mL含 50mg/L卡那霉素的细菌培养基中，37°C振摇至对数生长中期（0D_0. 5-0. 7)，加入终浓度为 lmmol/L的IPTG，37°C继续培养8h。将诱导表达的菌液离心，沉淀菌体用ImL裂解缓冲液 (50mM pH7. 5的M0PS，蛋白酶抑制剂）重悬沉淀，用超声破碎仪在冰浴下裂解细菌12次，每 次l〇s，间隔30s。14, 000Xg离心，收集沉淀，-80°C保存备用。
[0061] 3、酶促反应鉴定
[0062] 体外酶促反应体系总体积为500uL，其中包括12ug的纯化表达蛋白，50mM MOPS， 5mM MgCl2,6mM DTT，100,000dpm 14C-IPP(56.6mCi/mmol ;0.81nmol)，20.2uM IPP 和饱和的 含烯丙基的底物（20. 2uM DMAPP，16. 4uM GPP或 13. 8uM FPP)。置于 22°C孵育 lh，加入 500uL 己烷终止反应，以提取其含14C异戊二烯基磷酸酶产物。去除有机相，水相用HCl酸化，浓缩 后37°C孵育lh，有机相保存在-20°C，用于TLC法定量检测。60mm的薄层硅胶色谱板用展 开剂丙酮：水=9 : 1的流动相展开，醋酐-浓硫酸喷雾显色。以每分钟得到Iumol的产 物定义为一个酶活性单位。
[0063] TLC薄层板显色后，可以清楚地看到BL21+pET28在40kDa处没有条带，而 BL21+FPS则有清晰条带。
[0064] 实施例5 :
[0065] 竹节参法呢基焦磷酸合酶或多肽在提高竹节参总皂苷含量中的应用：
[0066] 转基因用的受体材料竹节参采自湖北恩施市Panax japonicus C. A. Mey。
[0067] 含目的基因（竹节参法呢基焦磷酸合酶基因）的表达载体的构建：根据竹节参法 呢基焦磷酸合酶基因的全长cDNA序列（SEQ ID NO. 1)，在扩增编码区的正反方向引物上引 入限制性内切酶位点（视选用的载体而定），以便构建植物表达载体，通过农杆菌介导遗传 转化转入竹节参，筛选转基因植株检测其总皂苷的含量。
[0068] 具体步骤如下：
[0069] 以实施例2中获得的含有PjFPS基因编码区的pMD18-T simple的质粒为模 版，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点KpnI和Sail，利用正向引物Pl : 5, CCATGGATGAGCGATCTGAAGACGAG3,;反向引物 P2 :5' CATATGTCACTTTTGCCGCTTATATATC3' 进 行PCR反应，TA克隆，提取质粒。
[0070] 用KpnI和Sail双酶切含目的基因序列PjFPS和植物表达载体质粒pBI121，酶切 产物经琼脂糖电泳后回收相应的片段，PBI121载体与PjFPS目的基因片段经T4DNA连接 酶在16°C下进行连接反应16h，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，用50ug/mL卡那霉素 筛选，挑取阳性单克隆菌落扩大培养，提取质粒并进行酶切鉴定，将酶切鉴定好的表达载体 ρΒΙ-PjFPS转入农杆菌中，遗传转化竹节参。
[0071] 利用发根农杆菌介导的竹节参的遗传转化，所需的材料和操作步骤如下：
[0072] 1)发根农杆菌A4,使用前自冰箱中取出，用YEB培养基传代2次，菌种在使用前接 种于YEB液体培养基中，28 °C培养过夜。
[0073] 2)取竹节参细嫩腋芽，洗净后置于70%酒精中浸泡lmin，弃酒精，加入2%次氯酸 钠消毒lOmin，期间摇动数次，弃去消毒液，用无菌水漂洗4?5次，置于无菌滤纸上晾干，用 无菌刀片将竹节参腋芽切成5mmX 5mm小片，置于预培养固体培养基上，在（23±1)°C暗箱 培养箱中预培养2d。
[0074] 3)经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬，置于4°C中 2h后取出。将预培养过的竹节参叶片浸泡于1/2MS重悬的菌液中5min，用无菌滤纸吸去多 余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，（23±1) °C黑暗条件下培养， 每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那 霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养，每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再转 移至不含卡那霉素的无激素1/2MS培养基中培养。
[0075] 4)把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ml无激素1/2MS液体 培养基的500ml三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条 件相同，培养25d后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮 存-80°C中备用。
[0076] 阳性株利用常规real-time PCR进行进一步的筛选验证，本发明所用方法具体如 下：
[0077] 提取具有卡那霉素抗性的转化竹节参植株的RNA，利用Takara反转录试剂盒 将RNA反转录成cDNA，进行半定量PCR。竹节参法呢基焦磷酸合酶基因特异引物Pl : 5'CCATGGATGAGCGATCTGAAGACGAG3' ；反向引物P2:5'CATATGTCACTTTTGCCGCTTATATATC3 '，反应程序采用TaKaRa两步法：95 °C预变性30s，95 °C变性5s，60°C延伸34s，40个循 环。用竹节参的actin基因做为内参基因，正向引物5' -GGAAAAGATTTGGCATC-3'，反向引 物5' -GGGCGTAACCCTCATA-3'对竹节参的野生型和转化型在相同生长状态下进行目的基因 表达水平的分析。选择相对于野生型植株，基因表达量的Fold-change值高于4倍以上 (P〈〇. 01)的转化植株作为阳性株进行后续实验。
[0078] (5)转竹节参法呢基焦磷酸合酶基因的竹节参发根中总皂苷含量测定：
[0079] 根据2010版《中华人民共和国药典》，人参属植物中的皂苷都为三萜皂苷。转基因 竹节参发根中总皂苷含量的检测可使用本领域的常规技术，本发明具体采用以下步骤：
[0080] 发根系样品的前处理：参考王小宁等（应用化工，2012,41 (5) :781-783)的方法并 进行改进，用研钵将样品研磨成粉末，过4号筛，各取0. Ig放入具塞锥形瓶中，加入10倍量 60%的乙醇在60°C下超声提取，提取液用水饱和正丁醇萃取3次，减压蒸干后用甲醇溶解， 即得待测溶液。
[0081] 参考袁丁等（华西药学杂志，2008, 23(6) :692-694)的总皂苷检测方法，采用香草 醛-高氯酸比色法，对过表达竹节参PjFPS基因的转基因发根系进行竹节参总皂苷的含量 测定，以非转基因的竹节参发根系为对照。标准品为人参皂苷Re,购自中国药品生物制品检 定所（批号：110754-200320)。
[0082] 测定结果（对照组和转基因组各检测5株）发现，在过表达竹节参PjFPS基因 的转基因竹节参发根中竹节参总皂苷平均含量比非转基因对照组平均含量提高了 2. 5倍 (P〈0. 05)。由此证明，竹节参法呢基焦磷酸合酶基因对促进竹节参总皂苷含量的提高有显 著作用，竹节参法呢基焦磷酸合酶基因可用于利用转基因技术提高竹节参总皂苷含量的研 究和产业化中，具有一定的应用前景。
【权利要求】
1. 一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
2. 编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
4. 含有权利要求2所述核苷酸序列的植物表达载体。
5. 含有权利要求4所述植物表达载体的转基因植株。
6. 权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植物总皂苷含量中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：权利要求1所述蛋白质或权利要求2所 述的基因在提高总皂苷含量中的应用。
8. 权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高竹节参三萜皂苷含量中的应 用。
【文档编号】C12N15/54GK104212777SQ201410441629
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】黄璐琦, 陈平, 张绍鹏, 宋佳, 朱闻君, 孙巧, 杨涛, 伍翀, 王如峰, 邓琛, 郑用琏, 陈超, 霍梦蕊 申请人:黄璐琦, 陈平, 张绍鹏, 宋佳, 杨涛, 朱闻君, 孙巧, 伍翀, 王如峰, 邓琛, 陈超, 霍梦蕊