使用肺癌特异性甲基化标记基因检测肺癌的方法

使用肺癌特异性甲基化标记基因检测肺癌的方法
【专利摘要】本发明涉及使用肺癌特异性生物标记物检测肺癌的方法，尤其是肺癌诊断的生物标记物，其可检测其5’UTR或者外显子1区域是在肺癌细胞中特异性甲基化的PCDHGA12基因的甲基化；和使用所述生物标记物检测肺癌和它的发展阶段的方法。根据本发明的诊断试剂盒使得相比于传统方法，在早期以准确和快速的方式诊断肺癌成为可能，可用于肺癌和它的发展阶段的预后和监测。
【专利说明】使用肺癌特异性甲基化标记基因检测肺癌的方法
[0001] 本申请是发明专利申请200980108952. 2的分案申请。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及一种使用肺癌特异性生物标记物检测肺癌的方法，尤其是用于肺癌诊 断的生物标记物，其可检测PCDHGA12的甲基化作用，它的5, UTR或外显子1区域在转化的 肺癌细胞内特异性地甲基化；和使用该生物标记物检测肺癌和其发展阶段的方法。

【背景技术】
[0003]在20世纪抽烟变得普遍之前，肺癌是一个非常稀有的疾病。肺癌的发生率快速增 长，在西方国家，肺癌在男性和女性中均是最多发的癌症。在韩国，肺癌通常发生在男性中， 它的发病率在女性中也惊人得增长。肺癌发病率的这种增长是归根于抽烟、空气污染和工 业污染等等。
[0004]即使在药物科学发达的现代，肺癌病人的5年生存率，尤其是实体瘤患者（除了血 癌患者）小于50%，所有癌症患者中的大约2/3在晚期被诊断，大多数是在癌症诊断后两年 内死亡。癌症治疗中的这种拙劣的结果不仅是治疗方法的问题，还因为在早期诊断癌症和 精确地确诊晚期癌症，和在癌症治疗后实施癌症患者的跟踪（follow-up)并不容易。
[0005]最近，基因检测方法被积极地用于诊断癌症的尝试。在它们中，典型的方法是使 用PCR技术确定是不是ABL :BCR(AbelS〇n鼠科白血病病毒致癌基因同源体：断裂点丛集 区）的融合基因，其是存在于血液中的白血病的基因指示物。此外，已尝试另一个方法，由 癌细胞表达的基因的存在性通过RT-PCR检测和印迹检测，由此诊断血液细胞中癌细胞的 存在。然而，这个方法具有缺点：它只能运用于某些癌症，包括前列腺癌和恶性黑色素瘤，具 有较高的错误阳性率。而且，它难于在这种方法中的检测和读取的标准化，它的应用也受到 限制（Kopreski，M. S.等人，Clin. Cancer Res.，5:1961，1999 ;Miyashiro, L 等人，Clin. Chem.，47:505, 2001)。另外，最近已积极地尝试使用在血清或血浆中的DNA的基因检测。 使用从癌症中分离的DNA以分析癌症特异性基因异常，比如致癌基因和肿瘤抑制基因的突 变、缺失和功能丧失，允许癌症的诊断。
[0006] 同时，正在尝试通过基因或者抗体测试来检测在肺癌患者的痰或者支气管 肺泡灌洗液中癌细胞或者致癌基因的存在的方法（Palmisano, W. A.等人，Cancer Res·，6〇:5954,2000;Sueoka，E.等人，Cancer Res·,59:1404, 1999)。然而，为了准确地诊 断涉及大量的基因异常和显示不同突变的癌症，需要能够以准确和自动的方式同步分析大 量基因的方法，但这样的方法仍未建立。
[0007] 因此，最近提出通过测量DNA甲基化的诊断癌症的方法。DNA甲基化主要发生在特 异性基因的启动子区域的CpG岛的胞嘧啶上，因此阻断了转录因子的结合，从而特异性基 因的表达被沉默。如此，肿瘤抑制基因的启动子CpG岛的甲基化的分析是非常有助于癌症 研究的。活跃的尝试已经用于分析启动子CpG岛的甲基化，通过比如甲基化特异性PCR(此 后，称为"MSP"）的方法或者自动的碱基配对和使用分析结果诊断和筛选癌症的方法。
[0008] 虽然存在启动子CpG岛的甲基化是否直接诱导致癌基因或是在致癌基因中导致 二级反应的争论，已肯定在不同癌症中的肿瘤抑制基因、DNA修复基因、细胞循环调控基因 和类似物是高度甲基化的（hyper-methylationed)，从而这些基因的表达被沉默。尤其是， 众所周知特异性基因的启动子区域的高甲基化发生在致癌基因的早期。
[0009] 因此，肿瘤相关的基因的启动子甲基化是癌症的重要指标，可以用于许多应用中， 包括癌症的诊断和早期检测，致癌基因的风险预测，癌症预后的预测，治疗后的随诊，抗癌 治疗的反应的预测。事实上，最近已经活跃地尝试检查血液、痰、唾液、粪便或者尿液中的 肿瘤相关基因的启动子甲基化，和利用检测结果诊断和治疗不同的癌症（Esteller，M.等 人，Cancer Res·，59:67,1999 ;Sanchez_Cespedez，M.等人，Cancer Res·, 60:892, 2000; Ahlquist, D_ Α·等人，Gastroenterol.，119:1219, 2000)。
[0010] 最近，通过不同检查诊断肺癌是可能的，如果疑似肺癌的症状存在，实施胸部 X-射线的检测、显微检测、视频成像检测、活组织切片检查、转移的检测或类似的检查确定 是否症状是肺癌或确定肺癌的发展阶段。然而，这种检查方法需要昂贵的系统，是花费大 的，具有难度的，不适于肺癌早期诊断，另外，存在取样的困难。这样，考虑到具有小于3cm 的肿瘤尺寸的一期肺癌患者的5年存活率大于70%，在病变的尺寸是小的时候，早期诊断 肺癌是最好的办法。因此，迫切得需要发展比各种现有肺癌检查方法更有效的检查方法。也 就是，需要开发新的肺癌特异性生物标记物，其可诊断早期的肺癌，处理大量的样品和具有 高度敏感性和特异性。
[0011] 因此，本申请的发明人已申请并获得了用于癌症诊断的微阵列和试剂盒的专利， 包括克隆癌症特异性表达降低的基因 LAMA2 (层粘连蛋白分区蛋白a 2 (laminin merosin alpha 2))、FABP4 (脂肪酸结合蛋白4)、GSTA2 (谷胱苷肽S-转移酶A2)、STMN2 (类微管去 稳蛋白2(stathmin-like 2))、NR4A2(核受体亚族4、组A、成员2)、DSCR1L1 (类唐氏综合 症关键区域基因-11 (down syndrome critical region gene Ι-like 1))、Α2Μ(α-2-巨球 蛋白）和SEPP1(硒蛋白P、原生质血浆1 (selenopr〇tein P，plasma, 1))(韩国专利注册号 10-0617649)。
[0012]本申请的发明人已作出许多努力开发能够有效诊断肺癌的诊断试剂盒，结果发现 肺癌和它的进展阶段可通过利用PCDHGA12的（GenBank NM_032094)基因的甲基化的5，UTR 或者甲基化的外显子1的区域检测甲基化程度来诊断，其在肺癌细胞中特异性甲基化，作 为癌症特异性标记物，由此完成了本发明。
[0013] 发明概述
[00M]本发明的目的是提供一种包括基因甲基化区域的用于肺癌诊断的生物标记物，所 述基因在肺癌中特异性甲基化。
[0015]本发明的另一个目的是提供一种利用肺癌诊断生物标记物来检测肺癌和它的进 展阶段的方法。
[0016]为达到上述目的，本发明提供用于肺癌诊断的生物标记物，其包括癌症特异性表 达降低基因 PCDHGA12(GenBank NM-032094、原粘钙蛋白Y亚族A，12)的甲基化的5，UTR 或外显子1区域。
[0017]本发明还提供用于肺癌诊断的生物标记物，其包括一个或多个甲基化CpG岛，且 由SEQ ID N0:2到4的任一碱基序列表示。
[0018] 本发明还提供检测肺癌和它的进展阶段的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从 临床样品中分离DNA ;和（b)在分离的DNA中检测肺癌特异性基因 PCDHGA12 (GenBank NM_032094,原粘钙蛋白Y亚族A，12)的5' UTR或外显子1区域的甲基化作用。
[0019] 本发明还提供一种检测肺癌的试剂盒，包括用于检测在从生物样品中分离的基因 组中，原粘钙蛋白Y亚族A，12,也就是PCDHGA12基因的5'UTR(非翻译区域）和外显子1 区域中一个或多个区域的CpG甲基化的工具，其中CpG甲基化的存在表示肺癌的存在。
[0020] 本发明的其它特征和实施例将从以下描述和所附权利要求中更为明确。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图1是发现用于肺癌诊断的甲基化生物标记物PCDHGA12的过程的示意图。
[0022] 图2显示通过亚硫酸盐测序法测量基因区域㈧的甲基化程度、和UTR和外显子 区域（B)的甲基化程度，以确定在正常细胞和肺细胞株中PCDHGA12的甲基化程度的结果。 [0023]图3显示在正常细胞中和四种肺细胞中通过焦磷酸测序法测量p⑶ HGA12基因的 甲基化程度的结果。
[0024]图4显示通过焦磷酸测序法测量PCDHGA12基因在五种正常组织和四十种成对的 肺癌组织中的甲基化程度的结果。
[0025]图5显示测量正常人（η = 51)和肺癌患者（η = 81)的痰细胞的基因组DNA的甲 基化作用的结果。
[0026]图6显示利用正常和肺癌细胞株以及正常和肺癌患者的每个的痰DNA测量 PCDHGA12基因的启动子甲基化程度的结果。

【具体实施方式】
[0027] -方面，本发明涉及肺癌诊断的生物标记物，其包括肺癌特异性表达降低的基因 PCDHGA12(GenBank丽一032094,原粘钙蛋白γ亚族A，12的甲基化的5'UTR或者甲基化的 外显子1区域。
[0028]在本发明中，甲基化的5'UTR(非编译区）或者甲基化的外显子！区域优选包括至 少一个甲基化CpG二核苷酸，且5'UTR和外显子1区域优选由SEQ ID NO: 1表示。
[0029]筛选甲基化标记基因的方法的一个例子可以是包括以下步骤的方法：（丨）仅从转 化细胞株和非转化细胞株中的转化细胞株中选择DNA-高度甲基化的基因；(2)包括转化的 肺癌细胞和邻近那些的非转化的细胞的基因表达谱，产生一份在非转化的细胞中更高表达 的基因的列表；( 3)用甲基化抑制剂处理转化的肺癌（细胞）株，产生一份与非处理的转化 的肺癌细胞系比较，在用甲基化抑制剂处理的转化的肺癌细胞株中更高程度表达的基因的 列表；和⑷比较从上述步骤（1)、（2)、⑶中获取的基因列表，观察在上述三个列表中都 存在的基因，作为由从非转化状态转变到转化的肺癌细胞形式的细胞的基因组中由甲基化 调控的标记基因。
[0030]在本发明中，通过上述筛选方法从肺癌细胞株的基因组DNA中筛选而来的肺癌特 异性表达降低基因 PCDHGA12在5' UTR和外显子1区域中具有甲基化CpG岛。
[0031]在另一方面，本发明涉及生物标记物，其包括一个或多个甲基化CpG岛，且由SEQ ID N0:2和3的任何一个碱基序列表示。
[0032] 在本发明中，DNA片段优选分离自肺癌特异性表达降低的基因 PCDHGA12(GenBank NM_032〇94,原粘钙蛋白γ亚族A，12)。
[0033] 在本发明中，肺癌特异性表达降低的基因 PCDHGA12的5' UTR和外显子1区域在 肺癌细胞株中的R1(SEQ ID N0:2)、R2(SEQ ID N0:3)和R3(SEQ ID N0:4)区域中具有甲基 化。
[0034] 在本发明的一个实施例中，来自肺癌患者的肺癌组织中的PCDHGA12基因的R1、R2 和R3显示高甲基化水平，在成对的肺癌组织和在其附近的正常组织中的R1区域的甲基化 在40个临床样品中的：34个（g卩，临床样品的85% )中显示，且在36个临床样品，这些组 织中的R3区域的甲基化高（g卩，临床样品的90% )。这个表示肺癌可以有效地通过测量 P⑶HGA12基因的R1、R2和R3区域的高度甲基化作用来诊断。
[0035]在另一方面，本发明涉及检测肺癌或其发展阶段的方法，该方法包括以下步骤： (a)从临床样品中分离DNA ;和（b)在分离的DNA中检测PCDHGA12(GenBank NM_032094,原 粘钙蛋白Y亚族A，12)基因的5' UTR或外显子1区域的甲基化程度。
[0036] 在本发明中，甲基化的检测优选在具有从由下组中选择的序列的DNA区域中实 施，该组由 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID N0:4 组成。
[0037] 在本发明中，甲基化的检测优选使用选自下组中的一种方法，该组由PCR、甲基化 特异性PCR、实时甲基化特异性PCR、利用甲基化DNA特异性结合蛋白质的PCR、定量PCR、基 于DNA芯片的检测方法、焦磷酸测序法和亚硫酸盐测序法组成，且所述临床样品是来自疑 似癌症的患者或将被诊断的对象中的组织、细胞、血液或尿液。
[0038] 通过在本发明的实施例中使用的筛选甲基化作用的生物标记基因的方法，不仅可 以筛选肺癌，还可以筛选向癌症发展的组织的各种混合体型阶段差异性地甲基化的基因。 筛选的基因可用于肺癌筛选、风险评估、预后、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的 选择。
[0039]在肺癌中的甲基化的基因和在肺癌不同阶段的异常的识别，使得肺癌的准确和有 效地早期诊断成为可能，允许多重基因的甲基化图谱和治疗性干预的新靶标的识别。此外， 根据本发明的甲基化数据可与其它非甲基化相关的生物标记物检测方法结合以获取肺癌 诊断的更为精确的系统。
[0040] 根据本发明的方法，肺癌在不同阶段或时期的进展可通过从样品中获取的一个或 多个核酸生物标记物的甲基化程度的测量进行诊断。通过比较从肺癌的每个阶段的样品中 分离出的核酸的甲基化程度与从没有细胞增殖性异常的肺部组织中的样品中分离出的一 个或多个核酸的甲基化程度，可检测样品中肺癌的具体阶段。这里，甲基化程度可以为高度 甲基化。
[0041] 在本发明的一个实施方式中，核酸可以在基因的调控区域中被甲基化。在另一个 实施方式中，涉及细胞转化的基因可通过检测基因的调控区域外部的甲基化来诊断，因为 甲基化作用由基因的外部向内部发展。
[0042] 在本发明的另一个实施方式中，样品中的肺部组织细胞的异常生长（发育异常） 可以使用试剂盒通过对于PCDHGA12(NM_032094,原粘钙蛋白γ亚族A,12基因的5，UTR和 外显子1区域的甲基化程度检测来诊断的。
[0043]本发明的诊断性试剂盒的使用可确定样品中肺部组织细胞的异常生长（发育异 常的进展）。本发明的诊断性方法包括确定一个或多个从样品中分离的核酸的甲基化状态， 其中所述一个或多个核酸的甲基化程度是与从肺部组织细胞的没有异常生长（发育异常） 的样品中分离的核酸的甲基化程度进行比较。
[0044] 本发明的另一个实施方式中，甲基化基因标记物的使用允许可能形成肺癌的细胞 的早期诊断。当确定在癌症细胞中甲基化的基因在临床上或形态学上正常表象的细胞中甲 基化时，这就表明该正常表象的细胞向癌症发展。这样，肺癌可在早期通过在正常表象的细 胞中的肺癌特异性基因的5' UTR和外显子1区域的甲基化作用而诊断。
[0045]本发明的甲基化标记基因的使用允许样品中肺部组织细胞的异常生长（发育异 常的进展）的检测。本发明的检测方法包括将含有至少一个从临床样品中分离出来的核酸 的样品与至少一种能够确定核酸甲基化状态的试剂接触，其中该核酸的甲基化作用不同于 没有异常生长（发育异常的进展）的样品中存在的核酸的相同区域的甲基化状态。
[0046] 在本发明的另一个实施方式中，肺癌的进展的可能性可通过使用上面描述过的试 剂盒检查显示正常的显型的样品中的标记基因的5, UTR和外显子1区域的甲基化来诊断。 样品可以是固体或液体组织、细胞、尿液、血清或者血浆。
[0047] 本发明中，检测PCDHGA12基因的5'UTR和外显子1区域的甲基化的方法包括以下 步骤：(a)从临床样品中分离样品DNA ; (b)用重亚硫酸盐处理分离的DNA ; (c)利用能够扩 增包括PCDHGA12基因的5'UTR和外显子1区域的CpG的片段的引物扩增经处理的DNA ;和 (d)对步骤（c)中扩增的产物进行焦磷酸测序以测定pCDHGA12基因的甲基化作用。
[0048]^在本发明的一个实施例方式中，将侧检测方法可通过使用试剂盒实施该检测方法 来进行。用于本发明中的试剂盒包括：划分区域从而在其内部容纳样品的载体工具；和一 个或多个容器，包括第一容器，其包含灵敏地割裂未甲基化的胞嘧啶的试剂；第二容器，其 包含扩增包含CpG的核酸的引物；第三容器，其包含用于检测断裂的或非未断裂的核酸的 存在的工具。用于本发明中的引物包括在SEQ ID N0:5至21的序列中提出的序列，和它们 的任何功能性组合和片段。载体的工具适用于包含一个或多个容器的工具，比如小瓶、管、 和类似物，每个容器的工具包含一个用于本发明的方法的独立的要素。根据本发明说明书， 本领域技术人员可容易确定在容器工具中必要试剂的分配。例如，容器工具中的一个可包 括包含了甲基化敏感性限制酶的容器。一个或多个容器工具还可以包含与目的核酸位点互 补的引物。另外，一个或多个容器工具还可以包含所述甲基化敏感性限制酶的同裂酶。 [00 49]本发明p另一个实施方式中，使用所述试剂盒检测肺癌的方法包括以下步骤：（D 从临床样品中分离基因组DNA ; (2)用甲基化敏感性限制酶处理分离出来的基因组DNA ; (3) 使用能够扩增用于本发明的肺癌诊断的生物标记物的引物扩增经处理的基因组DNA;和 (4)确定经扩增的产物中用于肺癌诊断的生物标记物的存在与否。在这个方法中，存在该生 物标记物片段的样品可诊断为肺癌或肺癌进展阶段。为了确定PCR扩增产物的存在与否， 试剂盒可额外包含能够与在严格条件下用于肺癌诊断的生物标记物杂交的片段。
[0050]可用于本发明中确定用于肺癌诊断的生物标记物的存在与否的方法还可以包括 重亚硫酸盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性PCR、甲基化荧光检测、使用甲基化DNA结 合蛋白的PCR和DNA芯片阵列。
[0051]如在此所用的，术语"细胞转化"指的是细胞的特征从一个形式向另一个形式的变 化，比如正常向异常变化、非肿瘤向肿瘤变化、未分化向分化变化、干细胞向非干细胞变化。 此外，转化作用可通过细胞的形态学、表现型、生物化学表征和类似性质而识别。
[0052]如在此所用的，术语癌症的"早期检测"指的是在转移之前发现癌症的可能性，优 选在可观察到组织或者细胞的形态学变化之前。此外，术语细胞转化的"早期检测，，指的是 细胞在其形态学上显示已转化之前的早期阶段经受转化的高度可能性。
[0053]如在此所用的，术语"高度甲基化"指的是CpG岛的甲基化。如在此所用的，术语 "样品"或者"临床样品"指的是其广义，包括任何从个体、体液、细胞株、组织培养获取的生 物样品，取决于实施检测的类型。从哺乳动物中获取组织活检和体液的方法在本领域是公 知的。肺部组织活检是优选的来源。
[0054] 甲基化生物标记的筛选
[0055] 在本发明中，筛选在细胞或组织转化时或细胞形态学上改变时的甲基化的生物标 记基因。如在此所用的，术语"转化"指的是细胞或组织在形态学上从一个形式向另一个形 式的变化，比如正常状态向异常状态变化、非肿瘤状态向肿瘤状态变化、或者未分化状态向 分化状态变化。
[0056]依照本发明，向肺癌细胞转化中的甲基化的生物标记物基因被系统地筛选。例 如，筛选生物标记基因的方法可为包含以下步骤的方法：（1)使用甲基化特异性结合蛋白 MBD2bt从转化细胞株和非转化细胞株中仅仅选择性地分离甲基化的DNA ; (2)扩增每个 DNA,用荧光染料标记扩增的DNAs ; (3)将每个标记的DNAs杂交到能够测量甲基化的微阵列 上；(4)基于杂交的结果，筛选在转化细胞中筛选高度甲基化的基因；（ 5)比较转化的肺癌 细胞和其附近非转化细胞的基因表达谱，产生一份在非转化细胞中更高度表达的一系列基 因的列表；(6)用甲基化抑制剂处理转化肺癌细胞株，产生相比于未处理的转化的肺癌（细 胞）株，在经处理的转化的肺癌中具有更高表达的一系列基因的列表；和（7)比较从步骤 (5)和（6)中获取的基因谱，观察所有三个基因列表中都存在的基因作为标记基因，其是通 过在从非转化状态转换成转化的肺癌细胞形式的细胞基因组中的甲基化调控的。
[0057]这里所用的术语"核酸"或者"核酸序列"指的是寡核苷酸、核苷或者聚核苷酸，或 它们的片段，基因组或合成的单链或双链DNA或RNA、基因组或合成的有义链或反义链DNA 或RNA、肽核酸（PNA)、天然的或者合成的任何类似DNA或类似RNA材料。对于本领域技术 人员明确的是，当核酸是RNA时，脱氧核糖核苷A、G、C和T分别被核苷酸A、G、C和U替换。 [0058]只要有可检测差异性甲基化CpG岛，任何的核酸可以用于本发明。 CpG岛是核酸序 列中CpG富集区域。
[0059] 甲基化作用
[0060]在本发明中，可以使用任何纯化或非纯化形式的核酸样品，只要其包含或推测包 含具有靶位点的核酸序列（例如含有CpG的核酸）。一个能够被差异性甲基化的核酸区域 是CpG岛，一个相对于其它二核苷酸CpG的核酸区域具有增强密度的核酸序列。 CpG双联 体在脊椎动物DNA中以仅约20%的频度发生，其可从G*C配对的比例中预期。在特定区域 中，CpG双联体的密度达到预期值，相对于剩余的基因组增加了十倍； CpG岛具有平均G*c 配对的含量大约60%，相比于在大量DNA中40%的平均值。该岛具有大约一千到两千碱基 对-DNA典型的长度。在人类基因中有大约45, 000这种岛。
[0061]在许多基因中，CpG岛开始于启动子的上游，向下游延伸至转录区域。在启动子上 的CpG岛的甲基化通常抑制基因的表达。该岛还可以环绕基因编码区域的5,区域和编码 区域的3'区域。这样，CpG岛可在包括含有启动子区域的调控区域中的编码序列的上游的 核酸序列的多重区域、在编码区域中（例如，外显子）、编码区域的下游，例如，在增强冈城 和在内含子中内找到。 ~
[0062]通常，含CpG的核酸是DNA。然而，本发明的方法可适用，例如，包含DNA、或者DNA 和含有mRNA的RNA的样品，其中DNA或者RNA可以是单链的或者双链的，或者0嫩-_杂 交链也可能包括在样品中。 。
[0063] 还可以使用核酸的混合物。待测的特异性核酸序列可以是更大分子的片段，或者 初始就以离散的分子存在，从而特异序列构成整个核酸。待研究的序列不必初始就以纯化 的形式存在；核酸可以是复合混合物的较小的一部分，例如含在整个人类DNA的核酸中。包 含在样品中用于甲基化CpG岛的检测的核酸可以通过多种技术，如Sambrook等人描述的技 术（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Ν·Υ·，1989)提取。
[0064] 核酸可包含调控区域，其是编码核酸的信息或者控制核酸的转录的DNA区域。调 控区域包括至少一个启动子。"启动子"是足以指引转录的最小序列，且调控启动子-依赖 型基因表达中的细胞型特异性、组织特异性，或者经外部信号或者试剂诱导。启动子可定位 于基因5'或3'区域。启动子的全部或部分内的核酸的数量可以是用于测量 CG岛的甲基 化作用。而且，通常认为靶标基因启动子的甲基化天然地从外边界向内发展。因此,细胞转 化的早期阶段可通过分析启动子区域的这些外部区域的甲基化来检测。
[0065] 从实验对象中分离的核酸是从实验对象中取得的生物样品中获取的。如果想要检 测肺癌或肺癌发展的阶段，核酸可以通过刮取或活组织检查从肺部组织中分离出来。这样 的样品可以通过本领域技术人员己知的各种医学程序获取。
[0066]如这里所用的，术语"高度甲基化"指的是在肿瘤细胞的特异性CpG位点或在由 CpG岛组成的特异性碱基序列区域的甲基化是高于在正常细胞中的。
[0067] 样品
[0068] 本发明描述肺癌的早期诊断和采用肺癌特异性基因甲基化。本发明的发明人已 经发现肺癌特异性基因甲基化还发生在邻近肿瘤区域的组织中。因此，在肺癌的早期诊断 方法中，任何样品，包括液体或固体组织，可以被用于检查肺癌特异性基因的甲基化的存在 性。这样的样品包括，但不限于，痰、血清或者血浆。
[0069] 甲基化检测的方法
[0070] 差异性甲基化-甲基化-特异性PCR的检测
[0071] 当基因组DNA经重亚硫酸盐处理时，如果被甲基化，在5'-CpG_3'区域内的胞嘧啶 保持完整，但是，如果没有被甲基化，胞嘧啶变成尿嘧啶。因此，基于经重亚硫酸盐处理之后 转变的碱基序列，对应于具有5'-CpG-3'碱基序列的区域的PCR引物组被构建。这里，构建 的引物组是两种引物组：对应于甲基化碱基序列的引物组，和对应于非甲基化碱基序列的 引物组。当基因组DNA经重亚硫酸盐转化，然后使用上述两种引物组通过PCR扩增时，若基 因组DNA被甲基化，PCR产物是采用对应于甲基化碱基序列的引物在PCR混合物中检测，但 若基因组DNA未甲基化，基因组DNA在采用对应于非甲基化的碱基序列的引物在PCR混合 物中检测。这种甲基化可以通过琼脂糖凝胶电泳定量分析。
[0072] 差异性甲基化-实时甲基化特异性PCR的检测
[0073] 实时甲基化特异性PCR是从甲基化特异性PCR方法改良的实时测量方法，包括用 重亚硫酸盐处理基因组DNA，设计对应于甲基化碱基序列的PCR引物，和利用引物进行实时 PCR。检测基因组DNA的甲基化的方法包括以下两种方法：一种使用与扩增的碱基序列互补 的TanMan探针的检测方法；和使用Sybergreen的检测方法。这样，实时甲基化特异性PCR 允许甲基化的DNA的选择性的定量分析。这里，标准曲线是使用体外甲基化DNA样品绘制， 在碱基序列中未包含5' -CpG-3'序列的基因还扩增为用于标准化的阴性对照组，以定量分 析甲基化的程度。
[0074] 差异性甲基化-焦磷酸测序法的检测
[0075] 焦磷酸测序法是从重亚硫酸盐测序法改良而来的定量的实时测序法。类似于 重亚硫酸测序法，基因组DNA是经重亚硫酸盐测序法转化的，然后，构建对应于未包含 5' -CpG-3'碱基序列的区域的PCR引物。特定地，基因组DNA是经重亚硫酸盐处理，使用 PCR引物扩增，然后使用测序引物作用于实时碱基序列分析。甲基化的程度是通过分析 5' -CpG-3'区域内的胞嘧啶和胸腺嘧啶的数量来作为甲基化指标来表达。
[0076] 差异性甲基化-PCR的检测-使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、定量PCR、和 DNA芯片阵列
[0077] 当仅仅特异性地结合到甲基化的DNA的蛋白与DNA混合时，蛋白仅特异性地结合 甲基化DNA。这样，不管是使用甲基化特异性结合蛋白的PCR还是DNA芯片阵列都允许选择 性地仅分离甲基化的DNA。基因组DNA与甲基化特异性结合蛋白混合，然后仅选择性地分离 甲基化DNA。分离的DNA是使用对应于启动子区域的PCR引物扩增的，然后DNA的甲基化是 通过琼脂糖凝胶电泳测量。
[0078] 另外，DNA的甲基化还可以通过定量PCR法进行测量，用甲基化DNA特异性结合蛋 白分离的甲基化DNA可通过荧光探针标记，杂交到含互补探针的DNA芯片上，从而测量DNA 甲基化。这里，甲基化DNA特异性结合蛋白可以是，但不限于，McrBt。
[0079] 差异性甲基化检测-甲基化敏感性限制酶
[0080] 差异性甲基化的检测可通过将核酸样品与仅剪切非甲基化CpG位点的甲基化敏 感性限制内切酶接触来完成。
[0081] 在单独的反应中，样品进一步接触甲基化敏感性限制酶的同裂酶，其均剪切甲基 化的和非甲基化CpG位点，从而剪切甲基化核酸。
[0082] 特异性引物加入到核酸样品中，核酸是经通过任何传统方法扩增。在经甲基化敏 感性限制酶处理的样品中扩增的产物是存在的，但经与甲基化敏感性限制酶的同裂酶处理 的样品中扩增的产物是不存在的，说明甲基化已发生在被经分析的核酸区域。然而，在经甲 基化敏感性限制酶处理的样品中扩增的产物的不存在，与同经甲基化敏感性限制酶的同裂 酶处理的样品中的扩增的产物的不存在一起表明在被分析的核酸区域没有发生甲基化。 [00 83] 如用于此处的，术语"甲基化敏感性限制酶"是指限制酶（例如，SamI)，其包括CG 作为它的识别位点的部分，当C被甲基化时与当C未被甲基化时相比，具有活性。甲基化敏 感性限制酶的非限制性例子包括MspI、Hpall、BssHII、BstUI和Notl。这样的酶可以单独 或者联合使用。其它甲基化敏感性限制酶的例子包括，但不限于SacII和EagI。
[0084]甲基化敏感性限制酶的同裂酶是限制酶，其与甲基化敏感性限制酶识别相同的识 别位点，但均剪切甲基化的和非甲基化的CGs。其例子包括MspI。
[0085] 本发明的引物设计成"充分地"互补于将扩增的位点的每个链，包括如上所述的适 当的G或者C核苷酸。这意味着引物在聚合反应条件下必须充分互补地与它们各自的链杂 交。本发明的引物可用于扩增反应中，其是酶链反应（例如，PCR)在其中靶位点经过许多 反应步骤呈现指数级增长。典型地，一个引物与位点的阴性（-）链（反义引物）具有同源 性，另一个引物与阳性（+)链（有义引物）具有同源性。在引物退火到变性的核酸之后，核 酸链通过例如DNA聚合酶I (Klenow)的酶和如核苷酸的反应物延伸，结果，合成了新的包括 靶位点序列的+和-链。当新合成靶位点用作模版并进行变性、引物退火和延伸的重复循 环时，发生靶位点序列的指数级合成。结果反应产物是离散的核酸二聚体，具有对应于采用 的特异性引物的末端的终端（termini)。
[0086] 扩增反应是本领域中常用的PCR。然而，还可以使用可选的方法比如实时PCR或者 使用等温酶的线性扩增。另外，还可以使用多重扩增反应。
[0087] 差异性甲基化检测-重亚硫酸盐测序法
[0088] 检测甲基化的含CpG的核酸的另一个方法包括以下步骤：将含有核酸的样品与修 饰未甲基化的胞嘧啶的试剂接触；使用CpG特异性寡核苷酸引物扩增在样品中的含CpG的 核酸，其中寡核苷酸引物区分经修饰的甲基化核苷酸和非甲基化核苷酸，检测甲基化核苷 酸。扩增步骤是可选的和理想的，但不是必要的。该方法依赖于区分经修饰的（例如，化学 修饰的）甲基化DNA和未甲基化的DNA的PCR反应。这样的方法在美国专利号为5, 786, 14 用于甲基化核酸的检测的重亚硫酸盐测序法中有描述。
[0089] 基底
[0090] 在靶核酸区域扩增之后，核酸扩增产物可与粘附于固相支持物（基底）上的已知 的基因探针杂交，来检测核酸序列的存在。
[0091] 如用于此的，术语"基底"，当用于关于物质、结构、表面或者材料时，表示包含非 生物学的、合成的、无生命的、平坦的或圆的表面的组合物，不是迄今为止已知的包括特异 性结合、杂交或催化识别位点或大量的不同的识别位点或者超过包括表面、结构或者材料 的不同分子种类的数量的大量不同识别位点。基底的例子包括，但不限于，半导体、合成的 (有机的）金属、合成半导体、绝缘体和掺杂物；金属、合金、元素、化合物和矿物质；合成的、 分裂的、侵蚀的、平版印刷的、印刷的、机械制造的和微制作的片、设备、结构和表面；工业聚 合物、塑料、膜硅、硅酸盐、玻璃、金属和陶瓷；和木材、纸张、纸板、棉花、羊毛、布、机织织物 和非织物纤维、材料和织品；和具有双重性的表面。
[0092] 本领域已知的多种类型的膜对核酸序列具有粘附力。这些膜的特异性非限制性例 子包括硝化纤维或者其它用于检测基因表达的膜，比如聚氯乙烯、重氮化纸和其它市面上 可购买到的膜，比如GENESCREEN?、ZETAPROBE TM(Biorad)、和NYTRAN?。还可以包括珠、玻璃、 胶片和金属基底。将核酸粘附到这些物体上的方法是本领域已知的。可选地，筛选可在液 相中实施。
[0093] 杂交条件
[0094] 在核酸杂交反应中，用于达到严格的特殊水平的条件将根据所要杂交的核酸的特 性而变化。例如，核酸的杂交区域的互补的长度、程度、核苷酸序列组成（例如，GC/AT含量） 和核酸类型（例如，RNA/DNA)可被认为在所选的杂交条件下。另外的考虑是核酸中的一个 是固定的，例如，在滤器上。
[0095] 发展的更高的严格条件的例子如下：室温下的2X SSC/0. 1% SDS (杂交条件）；室 温下的〇· 2x SSC/O. 1% SDS (低严格条件）；在42°C的0· 2X SSC/O. 1% SDS(中等严格条 件）；和在大约68°C的0. IX SSC (高严格条件）。
[0096] 洗脱可以仅使用这些条件中的一个条件进行实施，例如，高严格条件，或者可用的 条件中的每一个，例如，如上所列的顺序每个10-15分钟，重复任何或全部的所列步骤。然 而，如上所述，优化的条件将根据涉及的特殊的杂交反应而变化,可以经验为主地决定。通 常，高严格条件是用于目的探针的杂交。
[0097] 标记
[0098] 目的探针可被可检测地标记，例如，放射性同位素、荧光化合物、生物发光的化合 物、化学发光化合物、金属螯合剂或者酶。这样的探针的适当的标记是本领域众所周知的， 可通过任何传统方法实施。
[0099] 试剂盒
[0100] 本发明涉及用于在实验对象中检测异常细胞生长的试剂盒。本发明的试剂盒包 括：划分成其内接收样品的载体工具，一个或多个容器，包括第一容器，其包含敏感地割裂 未甲基化的胞嘧啶的试剂；第二容器，其包含扩增含有CpG的核酸的引物；第三容器，其 包含用于检测断裂的或非断裂的核酸的存在的工具。预期用于本发明的引物包括SEQ ID NO: 5至21的表示的序列，和它们的任何功能性组合和片段。功能性组合或片段用作引物检 测是否在基因组的区域发生甲基化。
[0101] 载体工具是适于包括一个或多个容器工具，比如小瓶、管和类似物，每个容器包含 一个用于该方法的分离要素。根据本发明的的说明书，本领域技术人员可容易确定在容器 中必要试剂的分配。例如，容器工具中的一个可包括含有甲基化敏感性限制酶的容器。一 个或多个容器工具可包括互补于目的核酸位点的引物。另外，一个或多个容器工具可包含 甲基化敏感性限制酶的同裂酶。
[0102] 实施例
[0103] 在下文中，本发明将通过参考实施例将进一步详细描述。然而，可理解这些实施例 仅用于解释目的，而不是构建于限制本发明的范围。
[0104] 实施例1 :在肺癌细胞株中高度甲基化的基因的筛选
[0105] 在肺癌中高度甲基化的基因通过使用肺癌细胞株A549(Korean Cell Line Bank(KCLB) 10185)和正常肺细胞株NHBE(Cambrex cc-2541)通过以下方式选择。
[0106] 首先，每个细胞株中的500ug的gDNA在超声波下降解为300-400bp(Vibra Cell, S0NICS)大小，根据制造商提供的说明书使用MethylcaptureTM(Genomictree，Kore a)从每个细胞株中选择性地富集甲基化的dna。该富集的甲基化dna使用GeiiomePlex? 全基因组扩增试剂盒（Complete Whole Genome Amplification Kit) (Sigma)经扩增，然后 每个扩增的从细胞株Αδ49和NHBE中衍生而来的甲基化的DNA分别经Cy5-dUTP和Cy3-dUTP 标记，而后混合。然后，根据Agilent的说明书将DNA杂交到含有CpG探针的CpG微阵列 (Agilent)，该探针由表示存在于人类基因组中的大约27, 800CpG岛表示，随后进行扫描。 接下来，在A549中高度甲基化的候选基因通过统计技术选择（图1和表1)。
[0107] 表1 :在Αδ49肺癌细胞株中高度甲基化的基因的列表
[0108]
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【权利要求】
1. 一种检测肺癌的试剂盒，包括用于检测在从生物样品中分离的基因组中，原粘钙蛋 白Y亚族A，12,也就是TCDHGA12基因的5' UTR(非翻译区域）和外显子1区域中一个或 多个区域的CpG甲基化的工具，其中CpG甲基化的存在表示肺癌的存在。
2. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述CpG甲基化位于选自由SEQ ID NO: 2-4所示序 列组成组中的一个或多个区域。
3. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述试剂盒还包括重亚硫酸盐试剂。
4. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述用于检测PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具选 自下述中的一种或多种：（i)能够扩增包括甲基化CpG区域的片段的引物组，（ii)能够与甲 基化CpG区域杂交的探针，（iii)能够结合甲基化CpG区域的甲基化特异性结合蛋白，（iv) 甲基化敏感性限制酶和（v)测序引物。
5. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述用于检测PCDHGA12基因的CpG甲基化的工 具是引物组，该引物组能够扩增包括甲基化CpG区域的片段；并且该引物组选自SEQ ID N0s:5-6、SEQ ID N0s:7-8 和 SEQ ID N0s:9-10。
6. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述用于检测PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具 是能够扩增包括甲基化CpG区域的片段的引物组和测序引物的组合；并且所述引物组选自 SEQ ID N0s:ll-12,而所述测序引物是 SEQ ID N0:13。
7. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述用于检测PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具 是能够扩增包括甲基化CpG区域的片段的引物组和测序引物的组合；并且所述引物组选自 SEQ ID N0s:14-15,而所述测序引物是 SEQ ID N0:16。
8. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述用于检测PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具 是能够扩增包括甲基化CpG区域的片段的引物组和测序引物的组合；并且所述引物组选自 SEQ ID N0s:17-18,而所述测序引物是 SEQ ID N0:19。
9. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述用于检测PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具是 能够扩增包括甲基化CpG区域的片段以及能够结合甲基化CpG区域的甲基化特异性结合蛋 白的引物组的组合；并且所述引物组是SEQ ID N0s:20-21。
10. 根据权利要求1的试剂盒，其中所述生物样品选自组织、痰液、细胞、血清、血浆、尿 液及其组合。
【文档编号】C12Q1/68GK104232763SQ201410441729
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2009年2月18日 优先权日:2008年3月14日
【发明者】安成晥, 文永镐, 吴泰祯 申请人:基因特力株式会社