一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法。本发明经过噬斑克隆纯化筛选出的中国仓鼠肺细胞适应毒能够稳定产生细胞病变，毒价稳定在107?。?108_°TCID50/mL，免疫原性稳定。利用仓鼠肺细胞系繁殖猪流行性乙型脑炎病毒，病毒适应性好、制苗毒液效价高。本发明采用先分离后浓缩的浓缩病毒工艺技术，利用中空纤维膜澄清纯化系统，实现了病毒液和细胞碎片的分离，解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚集的难题，还有效降低了灭活疫苗成品副反应性，提高了灭活疫苗安全性。本发明灭活剂选用二乙烯亚胺取代甲醛，其对病毒抗原的破坏作用小，保证了抗原中有效免疫原的完整性。
【专利说明】一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗【技术领域】，具体涉及一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪流行性乙型脑炎是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种人畜共患传染病。猪感染 后表现为高热、流产、产死胎及公猪睾丸炎。本病由蚊虫传播，常于夏末初秋流行，有明显的 季节性。从1871年首次在日本发现至1934年在日本分离出乙脑病毒，已有过十几次大流 行。本病分布很广，主要在亚洲各国发生，我国较多地区都有发生，人畜共患，危害甚大，被 世界卫生组织列为需要重点控制的传染病。也是我国重点防制的传染病之一。
[0003] 目前，国内猪乙型脑炎疫苗有活疫苗和灭活疫苗两大类。灭活疫苗主要是鼠脑组 织灭活疫苗（HW1株），该疫苗含有较多的鼠脑组织成分，疫苗的副反应和免疫性让人担心； 仓鼠肾原代细胞培养弱毒（JEVSA14-14-2株）制备的活疫苗副反应小，效果好，但仓鼠原代 细胞来自于清洁型实验动物活体组织，动物的复杂性影响了细胞的安全性，增加了外源病 毒污染的机会，而且每个生产周期都要购入大量实验动物，实验动物批间差异严重影响了 生产疫苗的仓鼠原代细胞的质量批间稳定性。上述两种生产方式都具有生产成本较高，产 品稳定性较差，产品安全性不完全保证，规模化生产受制约等缺点。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备 方法，以实现利用仓鼠肺细胞系培养该病毒制备疫苗，同时保证更高水平、更稳定的毒价， 从而提升疫苗质量。
[0005] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] -种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
[0007] 1)取中国仓鼠肺细胞CHL株或V79株经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，而后继 续培养，形成良好单层时，用于接种病毒；
[0008] 2)采用噬斑纯化法以与步骤1)选用的同种细胞株为宿主对猪流行性乙型脑炎病 毒进行克隆纯化，筛选适应性克隆毒株，待用；
[0009] 3)取步骤1)中得到的细胞株，弃去培养液，按MOI = 0. 1?0.001接入步骤2)得 到的适应性克隆毒株，先行吸附30min?lh，然后补加细胞维持液继续培养72?96h，细胞 病变达到80 %以上时收获，得到收获液；
[0010] 4)先用中空纤维分离膜对步骤3)得到的收获液进行分离，再将滤液用超滤膜进 行浓缩纯化，浓缩2?10倍，即为浓缩毒液；
[0011] 5)以0. 1?0. 5% (v/v)的比例向步骤4)得到的浓缩毒液中加入二乙烯亚胺，混 合均匀，于25?35°C条件下灭活2?3d，得到灭活毒液；
[0012] 6)利用凝胶层析柱，以S印harose 4FF作为层析介质、pH7?7. 5的PBS为洗脱液 对步骤5)得到的灭活毒液进行层析纯化；
[0013] 7)取步骤6)纯化后的病毒液与疫苗油佐剂按照I: I. 5?l:3(v:v)的比例混匀， 而后乳化得到猪流行性乙型脑炎灭活疫苗。
[0014] 优选的，细胞培养在以下培养液中进行：90?92%的DMEM培养基或RMPI1640培 养基，8?10%犊牛血清；此外还包括100?500IU的抗生素；该培养液pH值为7. 1?7. 4。
[0015] 优选的，步骤3)所述的细胞维持液配方是：94?96. 5% DMEM培养基或RMPI1640 培养基，3?4%犊牛血清，0. 5?2%精氨酸；此外还包括100?500IU的抗生素；该培养液 pH值为7. 1?7.4。
[0016] 优选的，步骤4)收获的浓缩毒液病毒滴度彡107_°TCID5(l/mL。
[0017] 优选的，步骤4)所述中空纤维分离膜的孔径为0.45 ym。
[0018] 优选的，步骤4)所述超滤膜的孔径为30万分子量。
[0019] 优选的，步骤1)用于接种病毒的细胞培养液中细胞密度为40?50万/mL。
[0020] 优选的，步骤1)继续培养的时间为48?72小时。
[0021] 优选的，步骤1)所述的EDTA-胰酶细胞分散液中胰蛋白酶的质量浓度为0. 05%。
[0022] 优选的，步骤3)所述的吸附是在无血清的DMEM培养基或RPMI1640培养基环境下 进行的。
[0023] 本发明具有如下优越性：
[0024] (1)本发明经过噬斑克隆纯化筛选出的中国仓鼠肺细胞（CHL株或V79株）适 应毒能够稳定产生细胞病变，在进行的20代左右的传代中，病毒的毒价稳定在10 7_°? 108_ °TCID50/mL，免疫原性稳定。
[0025] (2)利用仓鼠肺细胞系繁殖猪流行性乙型脑炎病毒，病毒适应性好、制苗毒液（半 成品毒液）效价商。
[0026] (3)本发明采用先分离后浓缩的浓缩病毒工艺技术，利用中空纤维膜澄清纯化系 统，实现了病毒液和细胞碎片的分离，解决了病毒颗粒浓缩时易堵膜和对剪切力敏感易聚 集的难题，还有效降低了灭活疫苗成品副反应性，提高了灭活疫苗安全性。
[0027] (4)本发明灭活剂选用二乙烯亚胺取代甲醒，其对病毒抗原的破坏作用小，保证了 抗原中有效免疫原的完整性。
[0028] (5)以传代细胞系生产疫苗，可大大降低生产成本，提高批间稳定性，提升疫苗质 量，并可后续猪流行性乙型脑炎疫苗的生物反应器规模化培养工艺的开发提供一种可选的 细胞株。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1不同细胞培养猪乙型脑炎病毒的比较试验
[0030] 1、实验方法：
[0031] 细胞制备：参照《猪乙型脑炎减毒活疫苗制造及检验试行规程》方法制备原代仓鼠 肾细胞，96孔培养板，中国仓鼠肺细胞（V79株）按10?20万/mL浓度铺板。
[0032] 毒价测定：取毒液做10倍系列稀释，取10'10'10'1(T84个稀释度的病毒液，分 别接种铺板细胞，每个稀释度接种5-8孔，同时设不接毒对照细胞孔，置36-37°C培养7d，观 察细胞病变，计算TCID 5Q。
[0033] 2、试验结果：
[0034] (1)培养病毒效价比较
[0035] 结果分析：中国仓鼠肺细胞（V79株）培养JEV病毒的滴度优于仓鼠肾原代细胞培 养病毒（见表1)。
[0036] 表1繁殖病毒液滴度的比较试验
【权利要求】
1. 一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取中国仓鼠肺细胞CHL株或V79株经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，而后继续培 养，形成良好单层时，用于接种病毒； 2) 采用噬斑纯化法以与步骤1)选用的同种细胞株为宿主对猪流行性乙型脑炎病毒进 行克隆纯化，筛选适应性克隆毒株，待用； 3) 取步骤1)中得到的细胞株，弃去培养液，按MOI = 0. 1?0. OOl接入步骤2)得到的 适应性克隆毒株，先行吸附30min?lh，然后补加细胞维持液继续培养72?96h，细胞病变 达到80 %以上时收获，得到收获液； 4) 先用中空纤维分离膜对步骤3)得到的收获液进行分离，再将滤液用超滤膜进行浓 缩纯化，浓缩2?10倍，即为浓缩毒液； 5) 以0.1?0.5% (v/v)的比例向步骤4)得到的浓缩毒液中加入二乙烯亚胺，混合均 匀，于25?35°C条件下灭活2?3d，得到灭活毒液； 6) 利用凝胶层析柱，以S印harose 4FF作为层析介质、pH7?7. 5的PBS为洗脱液对步 骤5)得到的灭活毒液进行层析纯化； 7) 取步骤6)纯化后的病毒液与疫苗油佐剂按照1:1. 5?l:3(v:v)的比例混匀，而后 乳化得到猪流行性乙型脑炎灭活疫苗。
2. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于细胞 培养在以下培养液中进行：90?92 %的DMEM培养基或RMPI1640培养基，8?10 %犊牛血 清；此外还包括100?500IU的抗生素；该培养液pH值为7. 1?7. 4。
3. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤 3) 所述的细胞维持液配方是：94?96. 5% DMEM培养基或RMPI1640培养基，3?4%犊牛 血清，0. 5?2%精氨酸；此外还包括100?500IU的抗生素；该培养液pH值为7. 1?7. 4。
4. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤 4) 收获的浓缩毒液病毒滴度彡107_°TCID5(l/mL。
5. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤 4)所述中空纤维分离膜的孔径为0. 45 y m。
6. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤 4)所述超滤膜的孔径为30万分子量。
7. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤 1)用于接种病毒的细胞培养液中细胞密度为40?50万/mL。
8. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤 1)继续培养的时间为48?72小时。
9. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤 1)所述的EDTA-胰酶细胞分散液中胰蛋白酶的质量浓度为0. 05%。
10. 根据权利要求1所述的一种猪流行性乙型脑炎灭活疫苗制备方法，其特征在于步 骤3)所述的吸附是在无血清的DMEM培养基或RPMI1640培养基环境下进行的。
【文档编号】C12N7/00GK104208668SQ201410448674
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】吕茂杰, 刘涛, 杨保收, 盛长忠, 梁武 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司