核酸扩增反应用盒的制作方法

核酸扩增反应用盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种能够简单地进行核酸扩增反应用的核酸扩增反应用盒。该核酸扩增反应用盒具备：管，在内部依次具备由第一油构成的第一塞子、由清洗液构成的第二塞子、由第二油构成的第三塞子、由溶出液构成的第四塞子以及由第三油构成的第五塞子，其中，所述清洗液若与油混合则相分离，并清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体，所述溶出液若与油混合则相分离，并从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出核酸；核酸扩增反应用容器，与管的第五塞子侧连通，并包含第四油；以及柱塞，装配于管的第一塞子侧的开口部，从管的第五塞子侧向核酸扩增反应用容器推出液体，第一～第三油的比重均与第四油不同。
【专利说明】核酸扩增反应用盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸扩增反应用盒。

【背景技术】
[0002] Boom等人对使用二氧化硅粒子等核酸结合性固相载体和离液剂，从生物体材料中 更加简便地提取核酸的方法做出了报告（参照非专利文献1)。包括上述Boom等人的方法， 使用二氧化硅等核酸结合性固相载体和离液剂使核酸吸附于载体，并提取的方法主要由以 下3个工序构成：（1)在存在离液剂的情况下，使核酸吸附于核酸结合性固相载体的工序 (吸附工序）；（2)为了去除非特异性结合的杂质以及离液剂，利用清洗液清洗吸附了核酸 的载体的工序（清洗工序）；以及（3)利用水或者低盐浓度缓冲液使核酸从载体中溶出的 工序（溶出工序）。
[0003] 然而，最近，除了以往的PCR装置以外，还开发出容易控制加热时间的热循环装置 (参照专利文献1)，但至今尚未开发出能够适合这些装置的盒等。
[0004] 专利文献1 :日本特愿2010 - 268090
[0005] 非专利文献 I J. Clin. Microbiol.，νο?. 28Νο· 3, P. 495-503 (1990)


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种能够简便地进行核酸扩增反应的核酸扩增反应用盒。
[0007] 作为本发明的一实施方式的核酸扩增反应用盒具备：管，在内部依次具备由第一 油构成的第一塞子、由第一清洗液构成的第二塞子、由第二油构成的第三塞子、由溶出液构 成的第四塞子以及由第三油构成的第五塞子，其中，上述第一清洗液若与油混合则相分离， 并清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体，上述溶出液若与油混合则相分离，并从结合了 核酸的核酸结合性固相载体溶出上述核酸的；以及核酸扩增反应用容器，与上述管的第五 塞子侧连通，并在内部具备第四油，第一?第三油中的至少一个油的比重与第四油不同。另 夕卜，也可以具备柱塞，柱塞装配于上述管的第一塞子侧的开口部，从管的第五塞子侧向上述 核酸扩增反应用容器推出液体，在上述柱塞的内部收纳有第五油和第二清洗液，其中，上述 第二清洗液若与油混合则相分离，并清洗结合了核酸的上述核酸结合性固相载体。另外，上 述溶出液也可以包含进行逆转录反应的试剂。上述溶出液也可以包含进行核酸扩增反应的 试剂。上述核酸扩增反应用容器也可以具有固定上述管的密封件形成部以及液滴移动的流 路形成部。上述密封件形成部也可以具有容纳从上述流路形成部溢出的油的油容纳部。另 夕卜，也可以具备罐，该罐与上述管的第一塞子侧连通，并向上述管导入上述核酸结合性固相 载体。上述罐和上述管也可以经由上述柱塞结合。
[0008] 上述任意一个核酸扩增反应用盒，优选第四油的比重比所有的上述第一?第三油 的比重小。
[0009] 对于上述任意一个核酸扩增反应用盒，优选在将第一?第三油的比重分别设为 A1?A3，将第一清洗液以及溶出液的比重设为B2时，对于相邻的塞子，并且对于A 1?A3 中的至少一个以及B2中的至少一个，满足以下公式，式中，η是1?3的整数，m是1或 者 2, I Bm - An| 彡 0· 12。
[0010] 对于上述任意一个核酸扩增反应用盒，优选在将第四油的比重设为A4时，满足 IB2 - A41 > 0· 06。
[0011] 在上述任意一个核酸扩增反应用盒中，优选第一?第三油的比重在0.88以上且 1. 10以下，第四油的比重在0.80以上且0.95以下，上述清洗液以及上述溶出液的比重在 1. 00以上且1. 20以下。
[0012] 本发明的其他的实施方式提供一种核酸扩增反应用盒试剂盒，具备上述任意一个 核酸扩增反应用盒以及向上述管导入上述核酸结合性固相载体的罐。上述罐也可以包含提 取核酸的溶解液和上述核酸结合性固相载体。上述罐也可以具有开口部，并在上述开口部 具有能够取下的盖。上述罐的开口部也可以构成为能够装配于上述管的第一塞子侧的开口 部。
[0013] 根据本发明，能够提供一种可简便地进行核酸扩增反应的核酸扩增反应用盒。

【专利附图】

【附图说明】
[0014] 图IA以及图IB是盒1的说明图。
[0015] 图2A?图2C是盒1的动作说明图。
[0016] 图3A?图3D是罐3的说明图。
[0017] 图4是固定爪25以及导板26和安装部62的说明图。
[0018] 图5A以及图5B是PCR容器30的周边的说明图。
[0019] 图6A是PCR装置100的内部结构的立体图。图6B是PCR装置100的主要结构的 侧视图。
[0020] 图7是PCR装置100的框图。
[0021] 图8A是旋转体61的说明图。图8B是将盒1安装至旋转体61的安装部62的状 态的说明图。
[0022] 图9A?图9D是盒1安装时的PCR装置100的状态的说明图。
[0023] 图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的示意图。
[0024] 图IlA?图IlC是核酸溶出处理的说明图。
[0025] 图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的示意图。
[0026] 图13是表示磁铁71有无摆动的表。
[0027] 图14A?图14C是液滴形成处理的说明图。
[0028] 图15A?图15D是热循环处理的说明图。
[0029] 图16是表示在本发明的一实施例中使用的核酸提取用试剂盒及其组装后的装置 的图。
[0030] 图17是表示本发明所涉及的一实施例中的实时PCR的结果的图表。
[0031] 图18是表示在本发明的一实施例中，关于毛细管中的水溶液塞子和油塞子的比 重差，调查了与耐受离心力的关系的结果的图表。
[0032] 图19是表示在本发明的一实施例中，关于PCR容器中的水溶液塞子和油塞子的比 重差，调查了与液滴的移动时间的关系的结果的图表。

【具体实施方式】
[0033] 以下，对本发明的实施方式进行详细说明。应予说明，根据本说明书的记载，本领 域技术人员知晓本发明的目的、特征、优点及其思想，本领域技术人员能够根据本说明书的 记载容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式表示本发明的优选实施方式，是为了 例示或者说明而示出的，并不将本发明限定于这些方式。本领域技术人员知晓能够在本说 明书中公开的本发明的意图以及范围内基于本说明书的记载来进行各种改变以及修饰。
[0034] 首先，在对安装于PCR装置100的盒进行说明后，对本实施方式的PCR装置100的 结构、动作进行说明。
[0035] <盒>
[0036] 图IA以及图IB是盒1的说明图。图2A?图2C是盒1的动作说明图。图2A是 盒1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态按压柱塞10,且密封件12A与下注射筒 22接触时的侧视图。图2C是按压柱塞10后的盒1的说明图。
[0037] 盒1由罐3和盒主体9构成。盒1是进行核酸溶出处理的容器，并且是对反应液 液滴47进行聚合酶反应的热循环处理的容器，其中，核酸溶出处理是使核酸从结合了核酸 的核酸结合性固相载体7溶出至用于聚合酶反应的反应液塞子47中的处理。
[0038] 核酸提取处理在罐3中进行，在通过管20的期间被精制。对管20的材质没有特 别限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。若特别地选择透明的玻璃、树脂作为管20 的材质，则能够从管20的外部观察空腔内，所以更为优选。另外，对于管20的材质，若选择 透过磁力的物质或非磁性体，则在使磁性珠通过管20的情况下等，通过从管20的外部赋予 磁力容易地使磁性珠通过管20,所以优选。此外，管20的材质也可以与罐的材质相同。
[0039] 管20具有由第一油构成的第一塞子（第一油塞子）44、由第一清洗液构成的第二 塞子（清洗液塞子）45、由第二油构成的第三塞子（第二油塞子）46、由反应液构成的第三 塞子（反应液塞子）47以及由第三油构成的第五塞子（第三油塞子）48。由于结合了核酸 的磁珠7被外部的磁铁吸引，所以通过使磁铁在外部沿管20移动，磁珠7在管20内移动， 并通过清洗液塞子45到达反应液塞子47。与磁珠7结合的核酸在清洗液塞子45中被清 洗液清洗，并在反应液塞子47中溶出。这里，所谓的"塞子"指特定的液体在管20内占据 一区域的情况下的液体。例如，在图2A?图2C中将在毛细管23内保持为柱状的液体称为 "塞子"。"油"指不与水混和的液体，包括上述的第一油、第二油、第三油、以及后述的第四 油、第五油。因此，由第二油构成的第三塞子具有防止其两侧的水溶性的塞子相互混合的功 能。优选在塞子中、塞子间没有气泡、其他的液体，但只要磁珠7能够通过塞子，也可以存在 气泡、其他的液体。
[0040] 对油的种类没有特别限定，能够使用矿物油、硅油（2CS硅油等）以及植物油等， 但通过使油为更高粘度的油，在使核酸结合性固相载体在与上侧的塞子的界面移动的情况 下，能够提高油所带来的"拭去效果"。由此，在使核酸结合性固相载体从上侧的塞子向由油 构成的塞子移动的情况下，能够更加不易将附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分带 入油内。
[0041] 热循环处理在盒1的PCR容器30内进行。PCR容器30被第四油填满，由于若反 应液与第四油混合则相分离，所以反应液塞子47 -旦被从管20推出至PCR容器30中则成 为液滴状，另外，由于反应液液滴47的比重比第四油的大，所以沉降。通过外部的加热器在 PCR容器30形成高温区域36A和低温区域36B，若使盒1整体与加热器一起反复上下反转， 则反应液液滴47在高温区域36A和低温区域36B之间交替地移动，对反应液液滴47实施 两个阶段的温度处理。
[0042] 对PCR容器30的材质没有特别限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。另 夕卜，由于在PCR容器30的附近存在高温侧加热器65B，所以优选PCR容器30的材质具有至 少KKTC以上的耐热性。对于PCR容器30的材质，若选择透明或者半透明的材质，则能够容 易地进行荧光测定（亮度测定），所以优选。但无需PCR容器30的全部区域是透明或者半 透明，至少与荧光测定器55对置的部位（例如PCR容器30的底35A)是透明或者半透明即 可。此外，管20的材质也可以与罐3、柱塞10的材质相同。
[0043] 盒1由罐3和盒主体9构成。在构成盒1的试剂盒中与罐3以及盒主体9 一起预 先准备有接合器5。通过借助接合器5连接罐3和盒主体9来组装盒1。但也可以以将罐 3直接装配于盒主体9的方式构成盒1。
[0044] 在以下的盒1的结构要素的说明中，如图2A所示，将沿长条的盒1的方向设为"长 边方向"，将罐3侧设为"上游侧"，将PCR容器30侧设为"下游侧"。应予说明，也有时将上 游侧仅表示为"上"、将下游侧仅表示为"下"。
[0045] (1)罐
[0046] 图3A?图3D是罐3的说明图。
[0047] 在试剂盒中预先准备的罐3中收纳有溶解液41和核酸结合性固相载体例如磁珠 7。在罐3的开口装配有能够取下的盖3A(参照图3A)。作为溶解液41使用5M硫氰酸胍、 2% Triton X - 100以及50mMTris - HCl(pH7. 2)。作业者取下盖3A释放罐3的开口（参 照图3B)，并将附着了病毒的棉棒浸入至罐3内的溶解液41，将病毒采集到溶解液41中（参 照图3C)。也可以在搅拌罐3内的液体时在图3C的状态下摇动罐3,但这样溶解液41容易 溢出，所以如图3D所示，优选在罐3的开口装配带有盖5A的接合器5后摇动罐3。由此罐 3内的物质被搅拌，病毒粒子被溶解液41溶解，核酸游离，并且涂覆于磁珠7的二氧化硅吸 附核酸。然后，作业者取下装配于罐3的开口的接合器5的盖5A，借助接合器5将罐3装配 于盒主体9(参照图2A)。
[0048] 罐3由具有可挠性的树脂构成，罐3能够膨胀。在柱塞10滑动而从图2A的状态 变为图2B的状态时罐3膨胀，从而抑制管20内的液体的压力过渡上升，并抑制管20内的 液体被向下游侧推出。优选在罐3形成变形部3B，以使罐3容易膨胀。
[0049] 此外，提取、扩增核酸的试样并不局限于病毒，也可以是细胞。对细胞的来源也没 有特别限定，可以是微生物，也可以是高等生物的组织切片、血液等。
[0050] 另外，溶解液只要含有离液物质则对其没有特别限定，但出于破坏细胞膜或者 使在细胞中所含有的蛋白质变性的目的，也可以使溶解液含有表面活性剂。作为该表面 活性剂，只要通常被用于从细胞等的核酸提取，则对其没有特别限定，具体而言，列举像 Triton - X等Triton系表面活性剂、Tween20等Tween系表面活性剂这样的非离子性表面 活性剂、N-月桂酰肌氨酸钠（SDS)等阴离子性表面活性剂，但特别优选在0. 1?2%的范围 内使用非离子性表面活性剂。并且，优选使溶解液含有2-巯基乙醇或者二硫苏糖醇等还原 齐U。溶解液也可以是缓冲液，但优选是PH6?8的中性。考虑这些因素，具体而言，优选含 有3?7M的胍盐、O?5%的非离子性表面活性剂、O?0. 2mM的EDTA、0?0. 2M的还原剂 等。
[0051] 离液物质只要在水溶液中产生离液离子（离子半径大的一价阴离子），具有使疏 水性分子的水溶性增加的作用，并有助于核酸向固相载体的吸附，则对其没有特别限定。具 体而言，列举硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，但优选它们中蛋白质变性作 用强的硫氰酸胍或者盐酸胍。这些离液物质的使用浓度因各物质而不同，例如，在使用硫氰 酸胍的情况下，优选在3?5. 5M的范围内使用，在使用盐酸胍的情况下，优选使用5M以上。
[0052] 另外，对采集试样的器具没有特别限定，结合用途选择刮铲、棒、刮刀等代替棉棒 即可。
[0053] 对罐3的内容积没有特别限定，例如能够为0. ImL以上且IOOmL以下。对罐3的材 质没有特别限定，例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。若作为罐的材质特别地选择透明 的玻璃、树脂，则能够从罐3的外部观察内部，所以更为优选。此外，罐3和各管20既可以 一体成型，也可以以可拆装的方式形成。若对罐3的材质利用橡胶、弹性体、高分子等的具 有可挠性的材料，则通过在罐3上装配了盖的状态下使罐3变形，能够对罐3的内部加压。 由此，能够从管的前端侧将管20的内容物从管的内部向外部推出。
[0054] (2)盒主体
[0055] 盒主体9具有柱塞10、管20以及PCR容器30。
[0056] (2 - 1)柱塞
[0057] 以下参照图2A?图2C对柱塞10进行说明。
[0058] 柱塞10是作为注射筒发挥作用的从管20的下游侧推出液体的可动式的推杆。柱 塞10具有将管20内的规定量的液体从管20的末端向PCR容器30推出的功能。另外，柱 塞10也具有借助接合器5装配罐3的功能。
[0059] 柱塞10具有筒状部11以及棒状部12。筒状部11被设置于罐3侧（上游侧），棒 状部12被设置于管20侧（下游侧）。棒状部12从筒状部11的下游侧的内壁被两个板状 的加强肋13支承。棒状部12的下游侧从筒状部11向下游侧突出。
[0060] 筒状部11在上游侧以及下游侧开口，筒状部11的内壁为液体的通路。在筒状部 11的上游侧（罐3侧）的开口处嵌合接合器5。也可以在试剂盒中预先准备的盒主体9的 柱塞10的筒状部11的上游侧的开口处装配能够取下的盖。筒状部11的下游侧的开口位 于管20的上注射筒21的内部。从筒状部11的上游侧的开口导入的磁珠7通过筒状部11 的内部，并穿过加强肋13的正面和背面从筒状部11的下游侧的开口出来，被导入至管20 的上注射筒21。
[0061] 筒状部11的下游侧与管20的上注射筒21的内壁嵌合。筒状部11与管20的上 注射筒21内接，并且能够相对于上注射筒21向长边方向滑动。
[0062] 在筒状部11的上游侧的开口的周围形成有装配接合器5的装配台11A。另外，装 配台IlA也是按压柱塞10时被按压的部位。通过按压装配台11A，柱塞10相对于管20滑 动，从图2A的状态变为图2C的状态。若柱塞10向下游侧移动，则装配台IlA与管20的上 缘接触（参照图2C)。换句话说，柱塞10的装配台IlA和管20的上缘的间隔为柱塞10的 滑动长度。
[0063] 棒状部12在初始状态下位于管20的上注射筒21的内部，与下注射筒22分离（参 照图2A)。若柱塞10相对于管20滑动，则棒状部12被插入至管20的下注射筒22,棒状部 12与下注射筒22内接，并且相对于下注射筒22向下游方向滑动（参照图2B以及图2C)。 [0064] 与棒状部12的长边方向正交的剖面的形状是圆形。但只要能够与管20的下注射 筒22的内壁嵌合，则棒状部12的剖面形状可以为圆、椭圆、多边形，对其没有特别限定。 [0065] 在棒状部12的下游侧的端部形成有密封件12A。一旦密封件12A与下注射筒22 嵌合，则防止下游侧的管20内的液体向上注射筒21逆流。而且，若将柱塞10从图2B的状 态按压到图2C的状态，则与在此期间密封件12A在下注射筒22内滑动的体积相当量对应 地，管20内的液体被从下游侧推出。
[0066] 此外，密封件12A在下注射筒22内滑动的体积（管20内的液体被从下游侧推出 的量）比管20内的反应液塞子47以及第三油塞子48的合计多。由此，能够以在管20中 不残留反应液的方式推出管20内的液体。
[0067] 对柱塞10的材质没有特别限定，例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，柱 塞10的筒状部11以及棒状部12可以由相同的材质一体地形成，也可以由不同的材质形 成。这里，分别利用树脂成型筒状部11以及棒状部12,通过借助加强肋13使筒状部11和 棒状部12接合来形成柱塞10。
[0068] 在柱塞10的内部预先收纳有油42和第二清洗液43。由于柱塞10内的油42的比 重比第二清洗液43的小，所以若在盒主体9上安装罐3时使柱塞10的装配台IlA朝上地 坚起盒主体9,则图2A所示，在罐3内的液体和盒主体9的第二清洗液43之间配置油42。 作为油42使用2CS硅油，作为第二清洗液43使用8M盐酸胍、0.7% Triton X - 100。 [0069] 此外，第二清洗液43是与油42以及构成第一油塞子的油44的任意一种油混合均 相分离的液体即可。优选第二清洗液43是水或者低盐浓度水溶液，在低盐浓度水溶液的情 况下，优选是缓冲液。优选低盐浓度水溶液的盐浓度在IOOmM以下，更为优选在50mM以下， 最为优选在IOmM以下。另外，虽然对低盐浓度水溶液的下限没有特别限定，但优选在0. ImM 以上，更为优选在〇. 5mM以上，最为优选在ImM以上。另外，该溶液也可以含有Triton、 Tween、SDS等表面活性剂，对pH没有特别限定。对用于制成缓冲液的盐没有特别限定，但 优选使用三羟甲基氨基甲烷（Tris)、4_羟乙基哌嗪乙磺酸（h印es)、哌嗪-1，4-二乙磺酸 (PIPES)、磷酸等盐。并且，优选该清洗液含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反 应等的量的乙醇。在该情况下，对乙醇浓度没有特别限定，可以在70%以下，也可以在60% 以下，也可以在50%以下，也可以在40%以下，也可以在30%以下，也可以在20%以下，还 可以是10%以下，但优选在5%以下或者2%以下，更为优选在1%以下或者0. 5%以下，更 为优选在0.2%以下或者0. 1 %以下。
[0070] 此外，也可以使第二清洗液43含有离液剂。例如，若使第二清洗液43含有盐酸 胍，则能够维持或者强化吸附于粒子等的核酸的吸附并且能够清洗粒子等。作为含有盐酸 胍时的浓度，例如可以在3mol/L以上且10mol/L以下，优选在为5mol/L以上且8mol/L以 下。若盐酸胍的浓度在该范围内，则能够使吸附于粒子等的核酸更加稳定地吸附，并且能够 清洗其他的杂质等。
[0071] (2 - 2)管
[0072] 以下参照图2A?图2C对管20进行说明。
[0073] 管20是能够使液体向长边方向流通的筒状的形状。管20具有上注射筒21、下注 射筒22以及毛细管23,各部的内径阶段性地不同。
[0074] 上注射筒21是能够使液体向长边方向流通的筒状的形状。在上注射筒21的内壁 以可滑动的方式内接有柱塞10的筒状部11，上注射筒21作为针对柱塞10的筒状部11的 注射筒发挥作用。
[0075] 下注射筒22是能够使液体向长边方向流通的筒状的形状。下注射筒22的内壁被 柱塞10的棒状部12的密封件12A以能够滑动的方式嵌合，下注射筒22作为针对柱塞10 的棒状部12的注射筒发挥作用。
[0076] 毛细管23是能够使液体向长边方向流通的细管状的形状。毛细管23的内径是液 体能够维持塞子的形状的大小，这里是I. 〇mm。在毛细管23的末端（管20的下游侧的一 端），内径与此相比变小，这里是0. 5mm。毛细管23的末端的内径被设定为比后述的液滴状 的反应液的直径（1. 5?2. Omm)小。由此，能够避免在反应液塞子47被从毛细管23的末 端推出时，液滴状的反应液附着于毛细管23的末端，或倒流至毛细管内。
[0077] 此外，毛细管23在内部具有空腔，并具有能够使液体向长边方向流通的筒状的形 状即可，也可以在长边方向上弯曲，但优选是直线状。若管的内部的空腔能够使液体在管内 维持塞子的形状，则对其大小、形状没有特别限定。另外，管内的空腔的大小、与长边方向垂 直的剖面的形状也可以沿管的长边方向变化。
[0078] 对管的外形的与长边方向垂直的剖面的形状也没有限定。并且对管的壁厚（从 内部的空腔的侧面到外部的表面的长度）也没有特别限定。在管是圆筒状的情况下，其内 径（内部的空腔的与长边方向垂直的剖面中的圆的直径）例如可以在0. 5mm以上且2mm以 下。若管的内径在该范围内，则对于管的材质、液体的种类，容易以广泛的范围形成液体的 塞子。优选前端进一步变细为锥状，可以在〇.2mm以上且Imm以下。而且，通过减小毛细管 23的末端的内径（毛细管23的开口直径），能够抑制反应液液滴47在PCR容器30内吸附 于毛细管23的开口而不分离。但若过渡减小毛细管23的末端的内径，则形成很多小的反 应液液滴47。此外，若连毛细管23的末端以外的部分也与末端同样地细径化，则由于确保 各塞子的体积的必要性，盒1变长，所以不优选。
[0079] 毛细管23从上游侧在内部依次具备第一油塞子44、清洗液塞子45、第二油塞子 46、反应液塞子47以及第三油塞子48。换句话说，在水溶性的塞子（清洗液塞子45或者反 应液塞子47)的两侧配置有油塞子。
[0080] 此外，在比第一油塞子44靠上游侧的上注射筒21以及下注射筒22预先收纳有油 42以及清洗液43(参照图2A)。上注射筒21以及下注射筒22的内径比毛细管23的内径 大，上注射筒21以及下注射筒22不能够将液体（油42以及清洗液43)维持成像塞子那样 的柱状，但为了将第一油塞子44通过毛细管23保持为塞子的形状，抑制构成第一油塞子44 的油向上游侧移动。
[0081] 清洗液塞子45可以由5mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液构成，但清洗液基本上 是与在第二清洗液中叙述的构成相同的构成即可，可以与第二清洗液相同或也可以与第二 清洗液不同，但优选是事实上不含有离液物质的溶液。是为了不向后面的溶液带入离液物 质。如上所述，优选该清洗液也含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的 量的乙醇。在该情况下，对乙醇浓度没有特别限定，可以在70%以下，也可以在60%以下， 也可以在50%以下，也可以在40%以下，也可以在30%以下，也可以在20%以下，也可以在 10%以下，但优选在5%以下或者2%以下，更为优选在I %以下或者0. 5%以下，最为优选 在0. 2%以下或者0. 1 %以下。
[0082] 清洗液塞子45也可以由被油的塞子隔开的多个塞子构成。在清洗液塞子45由多 个塞子构成的情况下，各塞子的液体可以相同也可以不同。在它们中只要有至少一个清洗 液的塞子，则对其他塞子的液体没有特别限定，但优选所有的塞子都是清洗液。对于清洗液 塞子45被分割的数量，例如能够考虑管20的长度、清洗的对象等来适当地设定。
[0083] 反应液塞子47由反应液构成。所谓反应液指使吸附于核酸结合性固相载体的核 酸从载体溶出至溶液中，并进行逆转录反应以及聚合酶反应的液体。因此，预先对反应液进 行调制，以使其成为核酸溶出后的反应液直接被用于逆转录反应以及聚合酶反应的缓冲溶 液。
[0084] 为了逆转录反应，反应液包含逆转录酶、dNTP以及逆转录酶用引物（寡核苷酸）， 并且为了聚合酶反应，反应液包含DNA聚合酶以及DNA聚合酶用引物（寡核苷酸），也可以 包含TaqMan探针、分子信标（Molecular Beacon)、环状探针（Cycling probe)等实时PCR用 探针、SYBR绿色等嵌入剂用荧光色素。并且，优选作为反应阻碍防止剂含有BSA(牛血清白 蛋白）或者明胶。优选溶剂为水，更为优选事实上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂以及离液 物质。另外，优选含有盐，以成为逆转录酶用缓冲液和/或DNA聚合酶用缓冲液。只要不阻 碍酶反应，对用于制成缓冲液的盐没有特别限定，优选使用三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌 嗪乙磺酸、哌嗪-1，4-二乙磺酸（PIPES)、磷酸等盐。对逆转录酶没有特别限定，例如可以使 用来源禽类成髓细胞病毒（Avian Myeloblast Virus)、Ras相关病毒2型（Ras Associated Virus2型）、莫洛尼鼠白血病病毒（Mouse Molony Murine Leukemia Virus)、人类免疫缺 陷病毒1型（Human Immunodefficiency Virusl型）的逆转录酶等，但优选耐热性的酶。对 DNA聚合酶也没有特别限定，但优选耐热性的酶、PCR用酶，例如有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、 Tth聚合酶、或者它们的改进型酶等大量的市售产品，但优选进行热启动的DNA聚合酶。
[0085] 使反应液所包含的dNTP、盐的浓度为适于所使用的酶的浓度即可，通常，使dNTP 为10?1000 μ M，优选为100?500 μ M，使Mg2+为1?IOOmM,优选为5?10mM，使Cl 一为 1?2000mM，优选为200?700mM即可，对总离子浓度没有特别限定，可以是比50mM高的浓 度，优选是比IOOmM高的浓度，更为优选是比120mM高的浓度，进一步优选是比150mM高的 浓度，更进一步优选是比200mM高的浓度。优选上限在500mM以下，更为优选在300mM以下， 进一步优选在200mM以下。使用0. 1?10 μΜ引物用寡核苷酸，优选使用0. 1?ΙμΜ引物 用寡核苷酸。若BSA或者明胶的浓度在lmg/mL以下，则反应阻碍防止效果小，若在IOmg/ mL以上，则有阻碍逆转录反应、之后的酶反应的可能性，所以优选1?10mg/mL。在使用明 胶的情况下，其来源能够例示牛皮、猪皮、牛骨，但对其没有特别限定。在明胶难以溶解时， 也可以加热使其溶解。
[0086] 例如作为反应液能够使用以下的溶液。
[0087]

【权利要求】
1. 一种核酸扩增反应用盒，其特征在于，具备： 管，在内部依次具备由第一油构成的第一塞子、由第一清洗液构成的第二塞子、由第二 油构成的第三塞子、由溶出液构成的第四塞子、以及由第三油构成的第五塞子，其中，所述 第一清洗液若与所述第一油或者所述第二油混合则相分离，并清洗结合了核酸的核酸结合 性固相载体，所述溶出液若与所述第二油或者所述第三油混合则相分离，并从结合了核酸 的核酸结合性固相载体溶出所述核酸；以及 核酸扩增反应用容器，与所述管的第五塞子侧连通，并在内部具备第四油， 第一?第三油中的至少一个油的比重与第四油不同。
2. 根据权利要求1所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 具备柱塞，装配于所述管的第一塞子侧的开口部，从所述管的第五塞子侧向所述核酸 扩增反应用容器推出液体， 在所述柱塞的内部收纳有第五油以及第二清洗液，其中，该第二清洗液若与所述第一 油或者所述第五油混合则相分离，并清洗结合了核酸的所述核酸结合性固相载体。
3. 根据权利要求1或者2所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 所述溶出液包含进行逆转录反应的试剂。
4. 根据权利要求3所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 所述溶出液包含进行核酸扩增反应的试剂。
5. 根据权利要求1?4中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 所述核酸扩增反应用容器具有固定所述管的密封件形成部以及液滴移动的流路形成 部。
6. 根据权利要求5所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 所述密封件形成部具有容纳从所述流路形成部溢出的油的油容纳部。
7. 根据权利要求1?6中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 具备与所述管的第一塞子侧连通，并向所述管导入所述核酸结合性固相载体的罐。
8. 根据权利要求7所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 所述罐和所述管经由所述柱塞结合。
9. 根据权利要求1?8中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 第四油的比重比所有的所述第一?第三油的比重小。
10. 根据权利要求1?8中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 在将第一?第三油的比重分别设为Ai?A3，将第一清洗液以及溶出液的比重设为&、 B2时，对于相邻的塞子，并且对于Ai?A3中的至少一个以及BpB2中的至少一个，满足以下 公式，式中，n是1?3的整数，m是1或者2 | Bm - An | < 0. 12。
11. 根据权利要求1?8中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 在将第四油的比重设为A4、溶出液的比重设为B2时，满足以下公式， | B2 - A41 > 0? 06。
12. 根据权利要求1?11所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 第一?第三油的比重在0.88以上且1. 10以下，第四油的比重在0.80以上且0.95以 下，所述清洗液以及所述溶出液的比重在1. 〇〇以上且1. 20以下。
13. -种核酸扩增反应用盒试剂盒，其特征在于， 具备权利要求1?12所记载的核酸扩增反应用盒以及向所述管导入所述核酸结合性 固相载体的罐。
14. 一种核酸扩增反应用盒，其特征在于，具备： 管，在内部依次具备由溶出液构成的第四塞子和由第三油构成的第五塞子，其中，所述 溶出液从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸，所述第三油若与所述溶出液混 合则相分离；以及 核酸扩增反应用容器，与所述管的第五塞子侧连通，并在内部具备第四油， 第三油和第四油的比重不同。
15. 根据权利要求14所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 所述管在内部具备由第二油构成的第三塞子，该第二油若在所述第四塞子侧与所述溶 出液混合则相分离。
16. 根据权利要求15所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于， 第四油的比重比所述第二以及第三油的任意一个的比重小。
【文档编号】C12M1/00GK104419638SQ201410448505
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】齐藤祐司, 高城富美男 申请人:精工爱普生株式会社