一种神经肽及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种神经肽及其编码基因与应用。本发明公开一种蛋白，为如下(1)-(4)任一所示：(1)SEQ ID No.4所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明证明抑制神经肽的表达使得亚洲玉米螟的体长显著缩短、体重增加量减少、取食量显著减少、生长速率和摄食速率均显著降低，证明神经肽及其编码基因在促进动物生长和动物摄食方面具有重要作用。
【专利说明】-种神经肽及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种神经肽及其编码基因与应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 亚洲玉米螟俗名钻心虫，成虫属鳞翅目螟蛾科，是我国玉米生产中的主要害虫，该 虫不仅取食玉米叶片、蛀入玉米主茎或果穗内，降低光合作用，影响养分运输，还产生各种 次级病害，致使玉米减产降质。近年来，随着气候条件的变化、耕作制度的改变、玉米种植密 度的加大、肥水条件的提高，玉米螟的危害日益加重。
[0003] 神经肽NPY (Neuropeptide Y)首先在高等动物中发现，之后相继在无脊椎动物中 发现，在昆虫中的发现相对较晚。由于最早发现的Neuropeptide Y成熟肽C-末端为酪氨 酸（Y)而被命名NPY，无脊椎动物中以苯丙氨酸（F)结尾，所以将无脊椎动物此类神经肽统 称为NPF或无脊椎动物的NPY家族。目前在昆虫中NPY命名尚未统一，以酪氨酸结尾的称 NPY (如意大利蜜蜂），以苯丙氨酸结尾的称NPF (如果蝇），昆虫NPF或者NPY总称NPY类神 经肽。目前，昆虫其他目的物种中，仅发现有NPF或者NPY，而在鳞翅目昆虫中发现同时含有 NPF和NPY。该类基因主要分布于脑和中肠中，在取食、酒精过敏、性行为、学习和记忆、生物 节律等许多方面都起着重要的调控作用。
[0004] 目前，在无脊椎动物中，对NPF基因功能的研究相对滞后，主要集中在果蝇和线虫 的NPF上。在鳞翅目昆虫中的研究较少，从烟蛾夜和棉铃虫脑组织中分别克隆出NPY家族 基因，发现其中不仅含有无脊椎动物特有的NPF神经肽，而且同时发现了类似脊椎动物的 神经肽NPY。对神经肽的研究对于害虫防治新技术的开发具有广泛的前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种神经肽及其编码基因与应用。
[0006] 本发明提供一种蛋白，为如下（1)-(4)任一所示：
[0007] (l)SEQ ID No. 4 所示的蛋白；
[0008] (2)将SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
[0009] (3) SEQ ID No. 5 所示的蛋白；
[0010] (4)将SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
[0011] 上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0012] 上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
[0013] 1) SEQ ID No. 3中自5'末端起第28位至第393位核苷酸所示的DNA分子；
[0014] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0015] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA 分子。
[0016] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于 本发明的保护范围。
[0017] 一种抑制动物生长和/或抑制动物摄食的方法也属于本发明的保护范围，是抑制 动物体内上述任一所述编码基因的表达。
[0018] 上述方法中，所述抑制动物体内上述任一所述编码基因的表达的方法为将SEQ ID No. 9所示的dsRNA分子导入所述动物体内。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述dsRNA分子导入所述动物体内的方法为如下（1)或 (2)所述的任一种方法：
[0020] (1)将所述dsRNA通过注射的方法导入所述动物体内；
[0021] (2)将所述dsRNA通过饲喂的方法导入所述动物体内；
[0022] 所述dsRNA导入所述动物体内后，dsRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正 义链和反义链；所述反义链与动物体内的蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物，即RISC ;RISC 与目的编码基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，抑制目的编码基因的表达。
[0023] -种促进动物生长和/或促进动物摄食的方法也属于本发明的保护范围，是使上 述任一所述的编码基因在动物中过表达。
[0024] 上述任一所述的方法中，所述动物为昆虫，具体为鳞翅目昆虫，再具体为亚洲玉米 螟；
[0025] 所述生长为体重增加和/或体长增长。
[0026] -种dsRNA分子也属于本发明的保护范围，该分子的序列如SEQ ID No. 9所示。
[0027] 抑制上述任一所述编码基因表达的抑制剂在制备抑制动物生长和/或抑制动物 摄食的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0028] 所述抑制剂具体为上述dsRNA分子；
[0029] 或，
[0030] 上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备促进动物生长和/或促进动物摄食的 产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0031] 所述动物具体为昆虫，再具体为鳞翅目昆虫，更具体为亚洲玉米螟；
[0032] 所述生长为体重增加和/或体长增长。
[0033] 本发明证明抑制神经肽的表达使得亚洲玉米螟的体长显著缩短、体重增加量减 少、取食量显著减少、生长速率和摄食速率均显著降低，证明神经肽及其编码基因在促进动 物生长和动物摄食方面具有重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳。
[0035] 图2为NPF2成熟肽的形成过程。
[0036] 图3为亚洲玉米螟NPF2的dsNPF2和dsGFP的琼脂糖凝胶电泳。
[0037] 图4为取食前饲料和取食后饲料的示意图。
[0038] 图5为亚洲玉米螟的体重增长量测定。
[0039] 图6为亚洲玉米螟的取食量检测。
[0040] 图7为亚洲玉米螟的生长速率检测。
[0041] 图8为亚洲玉米螟的摄食速率检测。
[0042] 图9为亚洲玉米螟的中肠和脑的NPF2基因相对表达量检测。
[0043] 图10为亚洲玉米螟的形态比较。
[0044] 图11为亚洲玉米螟的体长比较。
[0045] 图12为亚洲玉米螟的体重比较。
[0046] 图13为亚洲玉米螟的中肠的NPF2基因相对表达量检测。
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049] 亚洲玉米螟（英文名称为asian corn borers，拉丁名为Ostrinia furnacalis (guenee),简写为 0. fg)在文献 "Physiological significance of alternatively spliced exon combinations of the single-copy gene class A chitin synthase in the insect Ostrinia furnacalis(Lepidoptera). Qu, M. and Q. Yang (2012). Insect Molecular Biology.21(4):395-404. "中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0050] 亚洲玉米螟用人工饲料饲养，人工饲料的成分如下：玉米粉150克、大豆粉150g、 酵母粉90g、葡萄糖75g、琼脂22g、维生素 C 4g、山梨酸5g、水1400ml和丙酸2ml ;饲养条件 为：温度25±1°C，光周期为16L:8D，相对湿度控制在65%;饲养容器为塑料食品盒，塑料盒 长 20cm、宽 14cm、高 8cm。
[0051] T7 RiboMAX?expression RNAi system 购自 Promega。
[0052] 实施例1、亚洲玉米螟的NPF2蛋白及其编码基因的获得
[0053] 提取5龄亚洲玉米螟幼虫的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，以NPFpf和 NPFpr为引物，采用2XTaq PCR MasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司）作为DNA 聚合酶，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0054] 引物如下：
[0055] NPFpf :5, -CGTTCCGCACATCTATC-3, ；（SEQ ID No. 1)
[0056] NPFpr :5, -CGCCCCTCATCTCCTT-3，。（SEQ ID No. 2)
[0057] PCR 扩增体系：2XTaq PCR MasterMix 10μ L、浓度为 10ymol/L 的 NPFpf 0· 5 μ L、浓度为 10 μ mol/L 的 NPFpr 0· 5 μ L、cDNA 1 μ L、ddH20 8 μ L。
[0058] PCR 扩增程序：94°C 4min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 45s，35 个循环；72°C lOmin ; 4°C保存。
[0059] 将PCR扩增产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
[0060] 图1中，NPF1和NPF2分别代表含有NPF1的PCR扩增片段和含有NPF2的PCR扩 增片段。
[0061] 含有NPF2的PCR扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，NPF2蛋白的编码 基因序列如SEQ ID No. 3中自5'末端起第28位至第393位核苷酸所示，NPF2蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0062] 利用在线软件 SignalP3. 0 :http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/ 分析 信号肽剪切位点，依据在线软件 http://neuroproteomics. scs. illinois. edu/cgi-bin/ neuropred. py分析预测前体前导神经肽的切割位点。结合已知节肢动物神经肽前体加工 过程或者已经纯化出的神经肽同源性进行人工分析，亚洲玉米螟NPF神经肽前体蛋白NPF2 经过一系列的加工剪切，预测获得成熟肽，加工过程如图2所示，NPF2蛋白的成熟肽序列如 SEQ ID No. 5 所示。
[0063] 实施例2、亚洲玉米螟NPF2的dsNPF2的体外合成以及dsGFP的合成
[0064] 一、亚洲玉米螟NPF2的dsNPF2的体外合成 [0065](一）设计并合成如下引物 ：
[0066] dsNPFtf ：5, ~TAATACGACTCACTATAGGCGTTCCGCACATCTATC~3, ； (SEQ ID No. 6)
[0067] dsNPFtr ：5, ~TAATACGACTCACTATAGGCGCCCCTCATCTCCTT~3, ； (SEQ ID No. 7)
[0068] dsNPFtf和dsNPFtr中，下划线所示的序列为19bp的T7启动子序列。
[0069] (二）以SEQ ID No. 3所示的DNA分子为模板，用dsNPFtf和dsNPFtr组成的引物 对为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（如SEQ ID No. 8所示）。
[0070] (三）体外转录
[0071] 体外转录体系（T7RiboMax 反应体系）：RiboMax?Express T7 2XbufferlO μ L， 步骤（二）得到的PCR扩增产物1 μ g、Enzyme Mix 2 μ L，用RNase Free水将体系定容至 20 μ L〇
[0072] RiboMax?Express T72Xbuffer、Enzyme Mix 都是 T7 RiboMAX?expression RNAi system试剂盒所带。
[0073] 按照T7 RiboMAX?expression RNAi system试剂盒说明书进行体外转录，转录产 物的序列如SEQ ID No. 9所示，并将其命名为dsNPF2。
[0074] 二、dsGFP的体外合成
[0075] ( -）绿色荧光蛋白GFP的编码基因序列如SEQ ID No. 10所示，以其为模板，以 dsGFPtf和dsGFPtr为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（如SEQ ID No. 13所示）。
[0076] dsGFPtf:5, ~TAATACGACTCACTATAGGCAGCGTGTCCGGCGAGG~3, ； (SEQ ID No. 11)
[0077] dsGFPtr:5' -TAATACGACTCACTATAGGGTTCACCTTGATGCCGT-3'。(SEQ ID No. 12)
[0078] dsGFPtf和dsGFPtr中，下划线所示的序列为19bp的T7启动子序列。
[0079] (二）按照步骤一中（三）的方法进行dsGFP的转录，转录产物如SEQ ID No. 14 所示，并将其命名为dsGFP。
[0080] 三、dsNPF2和dsGFP的琼脂糖凝胶电泳如图3所示。
[0081] 实施例3、注射dsNPF2对亚洲玉米螟幼虫取食的影响
[0082] 一、设立如下各组
[0083] dsNPF组：取蜕皮当天的亚洲玉米螟5龄幼虫，应用10 μ L量进样器通过体腔注射 的方法（先将亚洲玉米螟用co2麻醉，然后从腹部倒数第二第三节的节间膜进行注射）将 实施例2制备的亚洲玉米螟NPF2的dsNPF2按照10 μ g/头的剂量导入亚洲玉米螟体内。 [0084] 体腔注射后将亚洲玉米螟放入装有新鲜饲料的养虫管中进行饲养（每支养虫管 加入5g长方形饼状的饲料），每24小时取出饲料，去除饲料中的粪便（粪便为颗粒状，可以 较为容易的从饼状饲料中去除，取食前饲料和取食后饲料的示意图如图4所示，图4中饼状 的为饲料，颗粒状的为粪便），然后将饲料称重后放回养虫管。
[0085] 同时设置dsGFP和DEPC H20组作为对照，各组的处理方法均与dsNPF2组相同， dsGFP和DEPC H20组仅将亚洲玉米螟NPF2的dsNPF2替换为等质量的dsGFP或等体积的 DEPC H20。
[0086] 二、将上述各组的亚洲玉米螟进行各个营养指标的测定
[0087] 下述方法及涉及的计算公式可参见文献"陈志辉.昆虫营养指标的定量测量与计 算·昆虫知识· 1987 (5) : 299-301. "
[0088] (一）体重增长量测定
[0089] 每天定点用电子天平称量并记录每只虫子的体重，记为Ln (以注射当天为第0天， 此时η即为0)，L(n+1)-L(n)，作为第n+1天的体重增长量。
[0090] 实验第1天（24h)、2天（48h)、3天（72h)的体重增长量测定结果如图5所示。
[0091] 图5表明，与其余两组相比，dsNPF组的亚洲玉米螟的体重增长量显著降低。
[0092] (二）取食量测定
[0093] 测量试验期间饲料因含水量改变而发生重量变化，因此设饲料对照组，取相同体 积和质量的饲料3块分别放到3个相同的养虫管里（不放亚洲玉米螟），将其放置在与上述 各组的养虫管相同的环境下；饲料对照组放置和取出饲料的时间与各组相同；首先称量饲 料对照组最初的饲料重量，每24小时取出饲料并称取重量。
[0094] 幼虫取食量的计算公式如下：
[0095]
【权利要求】
1. 一种蛋白，为如下（1)-(4)任一所不： (1) SEQIDNo·4所示的蛋白； (2) 将SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白质； (3) SEQ ID No. 5所示的蛋白； (4) 将SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种： 1. SEQ ID No. 3中自5'末端起第28位至第393位核苷酸所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质 的DNA分子。
4. 含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5. -种抑制动物生长和/或抑制动物摄食的方法，是抑制动物体内权利要求2或3所 述编码基因的表达。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述抑制动物体内权利要求2或3所述 基因的表达的方法为将SEQ ID No. 9所示的dsRNA分子导入所述动物体内。
7. -种促进动物生长和/或促进动物摄食的方法，是使权利要求2或3所述的编码基 因在动物中过表达。
8. 根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述动物为昆虫，具体为鳞翅目昆 虫，再具体为亚洲玉米螟。
9. 一种dsRNA分子，该分子的序列如SEQ ID No. 9所不。
10. 抑制权利要求2或3所述编码基因表达的抑制剂在制备抑制动物生长和/或抑制 动物摄食的产品中的应用； 或， 权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因在制备促进动物生长和/或 促进动物摄食的产品中的应用； 所述动物具体为昆虫，再具体为鳞翅目昆虫，更具体为亚洲玉米螟。
【文档编号】C12N15/12GK104250296SQ201410448514
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】赵章武, 岳臻 申请人:中国农业大学