一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌苗的获得、组织破碎、细胞悬浮液的获得、悬浮细胞的调控等步骤。本发明方法可以快速获得大量的秋牡丹细胞，操作简单，细胞增殖速度快，可以无限度的提供秋牡丹细胞，有助于工业化生产。
【专利说明】 一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下秋牡丹悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]秋牡丹,又名野棉花,毛茛科Anemones /apoflicae,原产于我国中部。喜温暖湿润和阳光充足环境，耐寒，怕高温，夏李宜凉爽气候，耐半阴，忌干旱，要求疏松肥沃的沙壤土。分布于日本以及中国安徽、江苏、浙江、福建、江西、广东、云南等地。喜温暖湿润和阳光充足环境，耐寒，怕高温，夏季宜凉爽气候，耐半阴，忌干旱，要求疏松肥沃的沙壤土。主治:蛔虫病，蛲虫病，体癣，肌癣，中暑发热。栽培技术:常用播种和根插繁殖，利用组培技术可以短期内获得大量的细胞，操作简单，节约成本，不受季节的限制，但目前此方面尚无研究。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供秋牡丹细胞悬浮培养的快速繁殖方法，可以快速获得大量的秋牡丹细胞，操作简单，细胞增殖速度快，可以无限度的提供秋牡丹细胞，有助于工业化生产。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取秋牡丹的种子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃和被毛，流水冲洗l-2h，超净工作台上氯化汞处理20min，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的秋牡丹种子接种到已经过灭菌处理的珍珠岩中，倾倒灭菌处理过的MS培养液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培养箱中培养15天，光强40001x，光期14h，暗期10h，湿度60%，温度26°C，培养出来的无菌苗在玻璃匀浆器中研磨使其破碎，然后将破碎组织用孔径100目的钢网过滤，除去大的组织块，筛选出来的破碎组织接入培养基配方为改良MS+NAA0.2mg/L+KT0.3mg/l+4mg/L硝普纳培养基中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，温度26°C，摇床震荡，搅拌通气式培养，每10ml三角瓶接种30mL液体，速率I1r/min,振巾畐 2-4cm。
[0005]采用本发明制备的秋牡丹细胞，增殖率高，操作简单，能耗小，次生代谢物含量高。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取秋牡丹的种子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃和被毛，流水冲洗l-2h，超净工作台上氯化汞处理20min，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的秋牡丹种子接种到已经过灭菌处理的珍珠岩中，倾倒灭菌处理过的MS培养液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培养箱中培养15天，光强40001x，光期14h，暗期10h，湿度60%，温度26°C，培养出来的无菌苗在玻璃匀浆器中研磨使其破碎，然后将破碎组织用孔径100目的钢网过滤，除去大的组织块，筛选出来的破碎组织接入培养基配方为改良MS+NAA0.1mg/L+KT0.2mg/l+3mg/L硝普纳培养基中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，温度26°C，摇床震荡，搅拌通气式培养，每10ml三角瓶接种30mL液体，速率IlOr/min,振巾畐 2-4cm。
[0008]实施例2
取秋牡丹的种子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃和被毛，流水冲洗l-2h，超净工作台上氯化汞处理20min，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的秋牡丹种子接种到已经过灭菌处理的珍珠岩中，倾倒灭菌处理过的MS培养液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培养箱中培养15天，光强40001x，光期14h，暗期10h，湿度60%，温度26°C，培养出来的无菌苗在玻璃匀浆器中研磨使其破碎，然后将破碎组织用孔径100目的钢网过滤，除去大的组织块，筛选出来的破碎组织接入培养基配方为改良MS+NAA0.2mg/L+KT0.5mg/l+5mg/L硝普纳培养基中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，温度26°C，摇床震荡，搅拌通气式培养，每10ml三角瓶接种30mL液体，速率IlOr/min,振巾畐 2-4cm。
[0009]实施例3
取秋牡丹的种子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃和被毛，流水冲洗l-2h，超净工作台上氯化汞处理20min，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的秋牡丹种子接种到已经过灭菌处理的珍珠岩中，倾倒灭菌处理过的MS培养液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培养箱中培养15天，光强40001x，光期14h，暗期10h，湿度60%，温度26°C，培养出来的无菌苗在玻璃匀浆器中研磨使其破碎，然后将破碎组织用孔径100目的钢网过滤，除去大的组织块，筛选出来的破碎组织接入培养基配方为改良MS+NAA0.2mg/L+KT0.5mg/l+3mg/L硝普纳培养基中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，温度26°C，摇床震荡，搅拌通气式培养，每10ml三角瓶接种30mL液体，速率IlOr/min,振巾畐 2-4cm。
[0010]实施例4
取秋牡丹的种子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃和被毛，流水冲洗l-2h，超净工作台上氯化汞处理20min，无菌水冲洗5-7遍，取消毒处理过的秋牡丹种子接种到已经过灭菌处理的珍珠岩中，倾倒灭菌处理过的MS培养液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培养箱中培养15天，光强40001x，光期14h，暗期10h，湿度60%，温度26°C，培养出来的无菌苗在玻璃匀浆器中研磨使其破碎，然后将破碎组织用孔径100目的钢网过滤，除去大的组织块，筛选出来的破碎组织接入培养基配方为改良MS+NAA0.2mg/L+KT0.3mg/l+5mg/L硝普纳培养基中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照20001x，温度26°C，摇床震荡，搅拌通气式培养，每10ml三角瓶接种30mL液体，速率IlOr/min,振巾畐 2-4cm。
【权利要求】
1.一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌苗的获得、组织破碎、细胞悬浮液的获得、悬浮细胞的调控等，主要步骤如下: (1)取秋牡丹种子，按照常规的消毒方法对其进行消毒处理； (2)将步骤(I)消毒处理过的秋牡丹种子接种到培养皿中，放置光照培养箱培养无菌苗； (3)取步骤(2)培养出来的无菌苗在玻璃匀浆器中研磨使其破碎，然后将破碎组织用孔径100目的钢网过滤，除去大的组织块； (4)取步骤(3)筛选出来的破碎组织接入培养基配方为改良MS+NAA0.1-0.2mg/L+KT0.2-0.5mg/l+3-5mg/L硝普纳培养基中进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5-6，光照 2000lx，温度 26。。。
2.按照权利要求1所述的一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(O中所述秋牡丹无菌种子的获得为:取秋牡丹的种子，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃和被毛，流水冲洗l_2h，超净工作台上氯化汞处理20min，无菌水冲洗5_7遍。
3.按照权利要求1所述的一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(2)中所述秋牡丹无菌苗的获得为，取消毒处理过的秋牡丹种子接种到已经过灭菌处理的珍珠岩中，倾倒灭菌处理过的MS培养液，附加蔗糖30g/L，PH5.8-6.0，封上封口膜，放置光照培养箱中培养15天，光强40001x，光期14h，暗期10h，湿度60%，温度26°C。
4.按照权利要求1所述的一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)中悬浮细胞的培养，在培养基中附加硝普纳，可以促进悬浮细胞的生长和次生代谢物质的积累。
5.按照权利要求1所述的一种秋牡丹悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)中秋牡丹悬浮细胞培养采用摇床震荡，搅拌通气式培养，每10ml三角瓶接种30mL液体，速率 110r/min，振幅 2_4cm。
【文档编号】C12N5/04GK104263694SQ201410463235
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司