一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。该标志物为rs1131897、rs1133833、rs115019901、rs117855259、rs118154190、rs141059768、rs141350740、rs142881943、rs145529151、rs145638335、rs145940981、rs150279473、rs150695913、rs151223396、rs185832840、rs188159138等35个遗传位点的组合。该标志物可用于制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒。
【专利说明】一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志 物及其应用 发明领域
[0001] 本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低 频高外显性遗传标志物及其应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前全球受累人数最多的恶性肿瘤。据国际癌症研究署（IARC)估计，2012 年肺癌新发病例182. 5万人，死亡159. 0万人，位居全球范围内肿瘤发病率和死亡率的首 位。由于持续增长的烟草消费、环境污染以及生活方式的改变，近二十年来，我国肺癌发病 和死亡一直呈上升趋势，仅2000年至2005年间，中国肺癌的发病人数和因肺癌死亡的人 数分别增加了 12万和10万，据估计，2012年我国男性肺癌发病率为52. 8/10万，女性为 20. 4/10万，超过发达的工业化国家水平。英国著名肿瘤学家R. Peto预言：如果中国不及时 控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌将超过100万，成为世界第一肺癌大国。由 此可见，肺癌是威胁全球及我国居民生命和健康的重要疾病之一，是亟待解决的重大公共 卫生问题。
[0003] 目前，对肺癌的一级预防（病因预防）尚无明确、有效的预防措施，但如果能加强 二级预防，做到早发现、早诊断和早治疗，则可以明显改善疾病预后，提高肺癌患者的5年 生存率。因此，争取早期诊断是肺癌防治的重点。目前肺癌早期诊断的方法主要有影像学 检查（胸部X线检查、胸部CT、核磁共振、正电子发射计算机体层扫描）、微创介入检查（支 气管镜检、荧光纤维支气管镜检、超声纤维支气管镜检等）、痰液脱落细胞学检查、肿瘤生物 标记等。但是现在临床常用的胸部X线、胸部CT和纤维支气管镜检存在一些弊端。胸部X 线检查难以发现，或难以鉴定局部粘膜上较小的肿瘤；胸部CT不能确定病变的性质，可能 存在假阳性或假阴性。纤维支气管镜检对肿瘤的浸润深度、有无转移了解不清。另外目前 临床所用肺癌标志物的特异性不强，血清癌胚抗原（CEA)在肺癌早期多不增高，对诊断意 义不大。病理活组织检查作为肺癌诊断的金标准，虽然在临床肺癌确诊中居于重要地位，但 由于需要有创取活检组织，不适宜作为临床健康筛查的手段。
[0004] 自20世纪60年代Dol 1和Hi 11通过病例-对照研究和队列研究首次发现吸烟与 肺癌的关系以来，烟草暴露已经被认为是肺癌发生的最主要环境危险因素。研究表明，吸烟 者发生肺癌的风险可比非吸烟者高出10倍。肺癌家庭聚集性的研究显示，遗传因素在肺癌 的发生中同样扮演重要角色。双生子研究表明，肺癌是遗传与环境共同作用的结果。流行 病学研究表明，80%以上的肺癌可以归咎为烟草暴露，但仅有不到20%的吸烟者发生肺癌， 说明在同等环境暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。低频高外显性遗 传标志物是指较小等位基因频率（MF)小于0.05的遗传变异。遗传变异的存在被认为赋 予了个体不同的表型性状，以及对环境暴露、药物治疗等因素的不同反应，因此可能是导致 个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。
[0005] 通过疾病易感的遗传标志物来诊断疾病的发生，灵敏、准确和快速，具有广阔的应 用前景。近年来，疾病遗传标志物已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血 管疾病等常见重大疾病的应用价值已初见端倪。
[0006] 然而，目前还没有将低频高外显性遗传标志物应用于肺癌诊断的报道，若能筛选 出肺癌易感的低频高外显性遗传变异作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国 肺癌诊断现状将会是个有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途 径。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频 高外显性遗传标志物及其应用。
[0008] 本发明的第二个目的是提供上述遗传标志物的特异性引物。
[0009] 本发明的第三个目的是提供上述遗传标志物及其特异性引物在制备原发性肺癌 辅助诊断试剂盒中的应用。
[0010] 本发明第四个目的是提供原发性肺癌辅助诊断试剂盒。
[0011] 发明人通过分离和研究原发性肺癌患者及健康对照外周血DNA中的遗传多态性， 寻找一组与原发性肺癌高度相关的高特异性和敏感性的低频高外显性遗传标志物，并研制 出可便于临床应用的原发性肺癌辅助诊断试剂盒，为原发性肺癌的筛查和诊断提供数据支 持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
[0012] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0013] 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物，该标志物 为 rsll31897、 rsll33833、 rsll5019901、 rsll7855259、 rsll8154190、 rsl41059768、 rsl41350740、rsl42881943、rsl45529151、rsl45638335、rsl45940981、rsl50279473、 rsl50695913、rsl51223396、rsl85832840、rsl88159138、rsl88908188、rsl90614894、 rs200170353、 rs200660845、 rs200847762、 rs201210090、 rs201308754、 rs202173016、 rs34687332、 rs3733782、 rs3827760、 rs45442501、 rs6141383、 rs61737776、 rs62176112、 rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556 的组合。
[0014] 所述的遗传标志物的特异性扩增引物，该引物为：
[0015] rsll31897 的引物序列为 SEQ ID No :1、SEQ ID No :2 ;
[0016] rsll33833 的引物序列为 SEQ ID No :4、SEQ ID No :5 ;
[0017] rsll5019901 的引物序列为 SEQ ID No :7、SEQ ID No :8 ;
[0018] rsll7855259 的引物序列为 SEQ ID No :10、SEQ ID No :11 ;
[0019] rsll8154190 的引物序列为 SEQ ID No :13、SEQ ID No :14 ;
[0020] rsl41059768 的引物序列为 SEQ ID No :16、SEQ ID No :17 ;
[0021] rsl41350740 的引物序列为 SEQ ID No :19、SEQ ID No :20 ;
[0022] rsl42881943 的引物序列为 SEQ ID No :22、SEQ ID No :23 ;
[0023] rsl45529151 的引物序列为 SEQ ID No :25、SEQ ID No :26 ;
[0024] rsl45638335 的引物序列为 SEQ ID No :28、SEQ ID No :29 ;
[0025] rsl45940981 的引物序列为 SEQ ID No :31、SEQ ID No :32 ;
[0026] rsl50279473 的引物序列为 SEQ ID No :34、SEQ ID No :35 ;
[0027] rsl50695913 的引物序列为 SEQ ID No :37、SEQ ID No :38 ;
[0028] rsl51223396 的引物序列为 SEQ ID No :40、SEQ ID No :41 ;
[0029] rsl85832840 的引物序列为 SEQ ID No :43、SEQ ID No :44 ;
[0030] rsl88159138 的引物序列为 SEQ ID No :46、SEQ ID No :47 ;
[0031] rs 188908188 的引物序列为 SEQ ID No :49、SEQ ID No :50 ;
[0032] rsl90614894 的引物序列为 SEQ ID No :52、SEQ ID No :53 ;
[0033] rs200170353 的引物序列为 SEQ ID No :55、SEQ ID No :56 ;
[0034] rs200660845 的引物序列为 SEQ ID No :58、SEQ ID No :59 ;
[0035] rs200847762 的引物序列为 SEQ ID No :61、SEQ ID No :62 ;
[0036] rs201210090 的引物序列为 SEQ ID No :64、SEQ ID No :65 ;
[0037] rs201308754 的引物序列为 SEQ ID No :67、SEQ ID No :68 ;
[0038] rs202173016 的引物序列为 SEQ ID No :70、SEQ ID No :71 ;
[0039] rs34687332 的引物序列为 SEQ ID No :73、SEQ ID No :74 ;
[0040] rs3733782 的引物序列为 SEQ ID No :76、SEQ ID No :77 ;
[0041] rs3827760 的引物序列为 SEQ ID No :79、SEQ ID No :80 ;
[0042] rs45442501 的引物序列为 SEQ ID No :82、SEQ ID No :83 ;
[0043] rs6141383 的引物序列为 SEQ ID No :85、SEQ ID No :86 ;
[0044] rs61737776 的引物序列为 SEQ ID No :88、SEQ ID No :89 ;
[0045] rs62176112 的引物序列为 SEQ ID No :91、SEQ ID No :92 ;
[0046] rs6756629 的引物序列为 SEQ ID No :94、SEQ ID No :95 ;
[0047] rs73016227 的引物序列为 SEQ ID No :97、SEQ ID No :98 ;
[0048] rs7703522 的引物序列为 SEQ ID No :100、SEQ ID No :101 ;
[0049] rs79472556 的引物序列为 SEQ ID No :103、SEQ ID No :104。
[0050] 所述的遗传标志物的特异性延伸引物，该引物为：
[0051] rsl 131897 的引物序列为 SEQ ID NO :3 ;rsl 133833 的引物序列为 SEQ ID NO : 6 ;rsl 15019901 的引物序列为 SEQ ID NO :9;rsl 17855259 的引物序列为 SEQ ID NO: 12;rsll8154190 的引物序列为 SEQ ID N0:15;rsl41059768 的引物序列为 SEQ ID NO: 18;rsl41350740 的引物序列为 SEQ ID N0:21;rsl42881943 的引物序列为 SEQ ID NO: 24;rsl45529151 的引物序列为 SEQ ID N0:27;rsl45638335 的引物序列为 SEQ ID NO: 30;rsl45940981 的引物序列为 SEQ ID N0:33;rsl50279473 的引物序列为 SEQ ID NO: 36;rsl50695913 的引物序列为 SEQ ID N0:39;rsl51223396 的引物序列为 SEQ ID NO: 42;rsl85832840 的引物序列为 SEQ ID N0:45;rsl88159138 的引物序列为 SEQ ID NO: 48;rsl88908188 的引物序列为 SEQ ID N0:51;rsl90614894 的引物序列为 SEQ ID NO: 54;rs200170353 的引物序列为 SEQ ID N0:57;rs200660845 的引物序列为 SEQ ID NO: 60;rs200847762 的引物序列为 SEQ ID N0:63;rs201210090 的引物序列为 SEQ ID NO: 66;rs201308754 的引物序列为 SEQ ID N0:69;rs202173016 的引物序列为 SEQ ID NO: 72;rs34687332 的引物序列为 SEQ ID N0:75;rs3733782 的引物序列为 SEQ ID N0:78; rs3827760 的引物序列为 SEQ ID NO :81 ;rs45442501 的引物序列为 SEQ ID NO :84 ; rs6141383 的引物序列为 SEQ ID NO :87 ;rs61737776 的引物序列为 SEQ ID NO :90 ; rs62176112 的引物序列为 SEQ ID NO :93 ;rs6756629 的引物序列为 SEQ ID NO :96 ; rs73016227 的引物序列为 SEQ ID N0:99;rs7703522 的引物序列为 SEQ ID N0:102; rs79472556 的引物序列为 SEQ ID NO :105。
[0052] 所述的遗传标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0053] 所述的遗传标志物的特异性扩增引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应 用。
[0054] 所述的遗传标志物的特异性延伸引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应 用。
[0055] -种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rsll31897、 rsll33833、 rsll5019901、 rsll7855259、 rsll8154190、 rsl41059768、 rsl41350740、 rsl42881943、 rsl45529151、 rsl45638335、 rsl45940981、 rsl50279473、 rsl50695913、 rsl51223396、rsl85832840、rsl88159138、rsl88908188、rsl90614894、rs200170353、 rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、rs34687332、 rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、 rs73016227、rs7703522 和 rs79472556。
[0056] 所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述的特异性扩增引物和/或特异性延伸引 物。
[0057] 所述诊断试剂盒，该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。如Taq酶、dNTP混合液、 Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0058] 具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：（1)建立统一标准的标本库和数据 库：以标准操作程序（SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床 资料。（2)基因型检测：选择原发性肺癌病例和健康对照，利用高密度低频高外显性遗传标 志物芯片，在全外显子组范围内找出与原发性肺癌相关的遗传标志物。（3)对筛选出的阳性 关联标志物，进一步在另外的样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。（4)原发性肺癌辅 助诊断试剂盒的研制：根据原发性肺癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗 传标志物开发辅助诊断试剂盒。
[0059] 本发明人以标准操作程序（SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人 口 学资料、临床资料等，并米用了 Illumina ΙηΠη?ιπ--ηξ_ Human Exome BeadChip(Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片进行全外显子组扫描，Sequenom MassARRAY基因分型进行单个 位点的检测等。
[0060] 具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
[0061] 1.研究样本的选择
[0062] (1)临床确诊为原发性肺癌；
[0063] (2)健康对照；
[0064] 本研究共采用4336例符合标准的样本进行研究。
[0065] 2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/y 1 DNA，纯度（紫外2600D与2800D比值）在1. 6-2. 0。
[0066] 3. Illumina In I inium κ RHuman Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego, CA) 芯片检测
[0067] (1)取受试者全基因组DNA样本；
[0068] (2)在 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片上进行全外显子组扫描；
[0069] (3)检测并比较各基因型在原发性肺癌病例与健康对照中的分别差异。
[0070] 4.单个遗传标志物的Sequenom MassARRAY基因分型
[0071] (1)取受试者DNA样本；
[0072] (2)设计单个遗传标志物的特异性引物；
[0073] (3)进行 PCR 反应；
[0074] (4)检测并比较原发性肺癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
[0075] 5.诊断试剂盒制备方法
[0076] Illumina Infinium8 Human Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego, CA)芯 片进行全外显子组扫描和单个遗传标志物检测后确定原发性肺癌病例与健康对照中基因 型分布频率有显著差异的遗传标志物，作为原发性肺癌诊断的指标。最后筛选出的与原发 性肺癌发病有关的遗传标志物组成辅助诊断试剂盒（rsll31897、rsll33833、rsl 15019901、 rsll7855259、 rsll8154190、 rsl41059768、 rsl41350740、 rsl42881943、 rsl45529151、 rsl45638335、 rsl45940981、 rsl50279473、 rsl50695913、 rsl51223396、 rsl85832840、 rsl88159138、rsl88908188、rsl90614894、rs200170353、rs200660845、rs200847762、 rs201210090、 rs201308754、 rs202173016、 rs34687332、 rs3733782、 rs3827760、 rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556)。诊断试剂可以包括这些遗传标志物的特异性引物对，以及Taq酶、dNTP等试 剂。
[0077] 6.统计分析方法
[0078] 运用卡方检验（用于分类变量）或者student t检验（用于连续性变量）比较人 口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关 联分析。
[0079] 为了进一步研究这35个低频高外显性遗传标志物构成的综合指征用于早期诊断 的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个遗传标志物与原发性肺癌发病的正、负关 联情况和联系强度。具体来说，我们对每个遗传标志物的三种基因型进行评分，野生纯合型 ="0"，杂合型="1"，变异纯合型="2"，以单个遗传标志物分析时的additive模型下的 回归系数为权重，综合考虑每个遗传标志物的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危 险分值的计算方法如下：危险分值=(〇. 65Xrsll31897的评分）+ (1. 97Xrsll33833的评 分）+ (0· 57Xrsll5019901 的评分）+ (0· 57Xrsll7855259 的评分）+ (1. 04Xrsll8154190 的 评分）+ (〇· 92Xrsl41059768 的评分）+ (0· 92Xrsl41350740 的评分）+ (0· 42Xrsl42881943 的评分）+ (〇.79Xrsl45529151 的评分）+ (0.96Xrsl45638335 的评 分）+ (1. 97Xrsl45940981 的评分）+ (2. 84Xrsl50279473 的评分）+ (-0· 67Xrsl50695913 的评分）+ (0.86Xrsl51223396 的评分）+ (1. 79Xrsl85832840 的评 分）+ (-0· 62Xrsl88159138 的评分）+ (L 77Xrsl88908188 的评分）+ (0· 82Xrsl90614894 的评分）+ (1. 40Xrs200170353 的评分）+ (0.73Xrs200660845 的评 分）+ (-1. 41Xrs200847762 的评分）+ (1. 31Xrs201210090 的评分）+ (1. 03Xrs201308754 的评分）+ (〇· 65Xrs202173016 的评分）+ (L 86Xrs34687332 的评分）+ (-0· 81Xrs3733782 的评分）+ (〇. 35Xrs3827760 的评分）+ (1. 86Xrs45442501 的评分）+ (0. 56Xrs6141383 的 评分）+ (-1. 22Xrs61737776 的评分）+ (1. 59Xrs62176112 的评分）+ (0· 73Xrs6756629 的 评分）+ (2. 15Xrs73016227 的评分）+ (2. 64Xrs7703522 的评分）+ (0· 85Xrs79472556 的 评分），获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全外显子组关联研究的4336例样本 中。（以rsll31897为例：0· 65为rsll31897的回归系数（见表I) ;rsll31897的评分，野 生纯合型=" 0 "，杂合型=" 1"，变异纯合型=" 2 "，某个SNV的基因型由仪器检测结果确定； 某个样本的总评分是这些个SNV分别评分的总和，单个SNV的基因型只是计算评分的一个 中间过程，不需要知道具体基因型。）
[0080] 统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成（PLINK1. 07)。统计学显著性水平 P值设为〇. 05,所有统计学检验均为双侧检验。
[0081] 以下是本发明进一步的说明：
[0082] 上述共有1386例符合条件的原发性肺癌病例及2950例健康对照。我们将这两组 人群经 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片 进行全外显子组扫描获得相关结果。
[0083] 根据 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego, CA) 芯片检测，本发明人检测到在"原发性肺癌病例"组和"健康对照"组中基因型分布频率存在 差异的遗传标志物包括：rsll31897、rsll33833、rsll5019901、rsll7855259、rsll8154190、 rsl41059768、 rsl41350740、 rsl42881943、 rsl45529151、 rsl45638335、 rsl45940981、 rsl50279473、 rsl50695913、 rsl51223396、 rsl85832840、 rsl88159138、 rsl88908188、 rsl90614894、 rs200170353、 rs200660845、 rs200847762、 rs201210090、 rs201308754、 rs202173016、rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、 rs62176112、rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556。
[0084] 根据上述检测结果，我们将这35个与原发性肺癌发病相关的遗传标志物在另外 1500例原发性肺癌病例和3000例健康对照中进行了单个遗传标志物的检测，结果与芯片 检测一致。
[0085] 单因素和多因素 Logistic回归分析结果均表明，这35个遗传标志物与原发性肺 癌的发病存在着显著关联。
[0086] 进一步分析这35个遗传标志物的组合用于原发性肺癌诊断的效果，发现其组合 能够很好的区分病例与对照。
[0087] 根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于原发性肺癌辅助诊断的试剂盒， 包含测定受试者血标本DNA中上述遗传标志物的特异性引物和其他检测试剂。
[0088] 具体而言，这35个遗传标志物的组合，或者这35个遗传标志物的特异性引物构成 的相关诊断试剂盒有助于原发性肺癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状 态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
[0089] 本发明有益效果：
[0090] 本发明提供的遗传标志物作为原发性肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：
[0091] (1)低频高外显性遗传标志物是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志 物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功 开发将为原发性肺癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借 鉴。
[0092] (2)遗传标志物试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于原发性肺癌的辅助 诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性 化的防治方案提供支持。
[0093] (3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全外显子组芯片扫描以获取 疾病相关的低频高外显性遗传标志物，并应用Sequenom MassARRAY基因分型方法在大样本 中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了低频高外显性遗传生物标志物和诊断 试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
[0094] 本发明通过病例对照研究，发掘低频高外显性遗传标志物在原发性肺癌辅助诊断 的应用前景，阐述遗传标志物对于原发性肺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明 获得了原发性肺癌发病相关遗传标志物；通过遗传生物标志物和诊断试剂盒的研制和应 用，可使得原发性肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治 疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0095] 图1 :显示全外显子组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
[0096] 显示原发性肺癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0097] 实施例1样品的收集和样品资料的整理
[0098] 发明人于2005月4月开始至2011年12月从南京医科大学第一附属医院和江 苏省肿瘤医院收集了大量的原发性肺癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从 中选择了 4336例符合下列标准的样本全外显子组芯片扫描和单个遗传标志物Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：
[0099] 1、病理组织学确诊的原发性肺癌患者；
[0100] 2、健康对照；
[0101] 并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
[0102] 实施例2外周血DNA中遗传标志物的全外显子组扫描
[0103] 上述共有1386例符合条件的原发性肺癌患者和2950例健康对照。将这两组人群 经 Illumina InHnium(K;i: Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片检测 获得相关结果。具体步骤为：
[0104] 1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂（即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化镁2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶 液定容至2000ml，下同），颠倒混勻后完全转入。
[0105] 2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混勻，4000rpm离心10分 钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混勻清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃 上清。
[0106] 3、抽提DNA :向沉淀中加 Iml抽提液（每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠， 14. 4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二烧基硫酸钠，148. Iml双蒸水，下同）和8μ 1蛋 白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37°C水浴过夜。
[0107] 4、去除蛋白质：加 Iml饱和酚充分混匀（手轻摇15分钟），4000rpm离心10分钟， 取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液（氯仿：异戊 醇=24 :1，v/v，下同），充分混勻后（手摇15分钟），4000rpm离心10分钟，取上清（分入 两个I. 5ml的离心管）。
[0108] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60 μ 1，再加入与上清液等体积的冰无水 乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心lOmin。
[0109] 6、DNA洗漆：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心IOmin,弃上清后真空抽 干或置于清洁干燥环境中蒸干。
[0110] 7、测量浓度：通常能得到20-50ng/ μ I DNA，纯度（紫外2600D与2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0111] 8、进行全外显子组扫描：在 Illumina InHniumB Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片上进行全外显子组扫描；
[0112] 9、数据分析与处理：在"原发性肺癌病例"组和"健康对照"组中发现的基因型分 布频率有显著差异的低频高外显性遗传标志物在上文中已经罗列出，结果见表1。
[0113] 表1病例组与对照组全外显子组关联分析结果
【权利要求】
1. 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物，其特征在于该标志 物为 rsll31897、rsll33833、rsll5019901、rsll7855259、rsll8154190、rsl41059768、 rsl41350740、rsl42881943、rsl45529151、rsl45638335、rsl45940981、rsl50279473、 rsl50695913、rsl51223396、rsl85832840、rsl88159138、rsl88908188、rsl90614894、 rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、 rs34687332、rs3733782、rs3827760、rs45442501、rs6141383、rs61737776、rs62176112、 rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556 的组合。
2. 权利要求1所述的遗传标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为： rsll31897 的引物序列为 SEQ ID No :1、SEQ ID No :2 ; rsll33833 的引物序列为 SEQ ID No :4、SEQ ID No :5 ; rsll5019901 的引物序列为 SEQ ID No :7、SEQ ID No :8 ; rsll7855259 的引物序列为 SEQ ID No :10、SEQ ID No :11 ; rsll8154190 的引物序列为 SEQ ID No :13、SEQ ID No :14 ; rsl41059768 的引物序列为 SEQ ID No :16、SEQ ID No :17 ; rsl41350740 的引物序列为 SEQ ID No :19、SEQ ID No :20 ; rsl42881943 的引物序列为 SEQ ID No :22、SEQ ID No :23 ; rsl45529151 的引物序列为 SEQ ID No :25、SEQ ID No :26 ; rsl45638335 的引物序列为 SEQ ID No :28、SEQ ID No :29 ; rsl45940981 的引物序列为 SEQ ID No :31、SEQ ID No :32 ; rsl50279473 的引物序列为 SEQ ID No :34、SEQ ID No :35 ; rsl50695913 的引物序列为 SEQ ID No :37、SEQ ID No :38 ; rsl51223396 的引物序列为 SEQ ID No :40、SEQ ID No :41 ; rsl85832840 的引物序列为 SEQ ID No :43、SEQ ID No :44 ; rsl88159138 的引物序列为 SEQ ID No :46、SEQ ID No :47 ; rsl88908188 的引物序列为 SEQ ID No :49、SEQ ID No :50 ; rsl90614894 的引物序列为 SEQ ID No :52、SEQ ID No :53 ; rs200170353 的引物序列为 SEQ ID No :55、SEQ ID No :56 ; rs200660845 的引物序列为 SEQ ID No :58、SEQ ID No :59 ; rs200847762 的引物序列为 SEQ ID No :61、SEQ ID No :62 ; rs201210090 的引物序列为 SEQ ID No :64、SEQ ID No :65 ; rs201308754 的引物序列为 SEQ ID No :67、SEQ ID No :68 ; rs202173016 的引物序列为 SEQ ID No :70、SEQ ID No :71 ; rs34687332 的引物序列为 SEQ ID No :73、SEQ ID No :74 ; rs3733782 的引物序列为 SEQ ID No :76、SEQ ID No :77 ; rs3827760 的引物序列为 SEQ ID No :79、SEQ ID No :80 ; rs45442501 的引物序列为 SEQ ID No :82、SEQ ID No :83 ; rs6141383 的引物序列为 SEQ ID No :85、SEQ ID No :86 ; rs61737776 的引物序列为 SEQ ID No :88、SEQ ID No :89 ; rs62176112 的引物序列为 SEQ ID No :91、SEQ ID No :92 ; rs6756629 的引物序列为 SEQ ID No :94、SEQ ID No :95 ; rs73016227 的引物序列为 SEQ ID No :97、SEQ ID No :98 ; rs7703522 的引物序列为 SEQ ID No :100、SEQ ID No :101 ; rs79472556 的引物序列为 SEQ ID No :103、SEQ ID No :104。
3. 权利要求1所述的遗传标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为： rsl 131897 的引物序列为 SEQ ID NO :3;rsl 133833 的引物序列为 SEQ ID NO :6; rsll5019901 的引物序列为SEQIDN0:9;rsll7855259 的引物序列为SEQIDN0:12; rsll8154190 的引物序列为SEQIDN0:15;rsl41059768 的引物序列为SEQIDN0:18; rsl41350740 的引物序列为SEQIDN0:21;rsl42881943 的引物序列为SEQIDN0:24; rsl45529151 的引物序列为SEQIDN0:27;rsl45638335 的引物序列为SEQIDN0:30; rsl45940981 的引物序列为 SEQ ID NO :33 ;rsl50279473 的引物序列为 SEQ ID NO :36 ; rsl50695913 的引物序列为SEQIDN0:39;rsl51223396 的引物序列为SEQIDN0:42; rsl85832840 的引物序列为 SEQ ID NO :45 ;rsl88159138 的引物序列为 SEQ ID NO :48 ; rsl88908188 的引物序列为SEQIDN0:51;rsl90614894 的引物序列为SEQIDN0:54; rs200170353 的引物序列为 SEQ ID NO :57 ;rs200660845 的引物序列为 SEQ ID NO :60 ; rs200847762 的引物序列为SEQIDN0:63;rs201210090 的引物序列为SEQIDN0:66; rs201308754 的引物序列为SEQIDN0:69;rs202173016 的引物序列为SEQIDN0:72; rs34687332 的引物序列为 SEQ ID NO :75 ;rs3733782 的引物序列为 SEQ ID NO :78 ; rs3827760 的引物序列为 SEQ ID NO :81 ;rs45442501 的引物序列为 SEQ ID NO :84 ; rs6141383 的引物序列为 SEQ ID NO :87 ;rs61737776 的引物序列为 SEQ ID NO :90 ; rs62176112 的引物序列为 SEQ ID NO :93 ;rs6756629 的引物序列为 SEQ ID NO :96 ; rs73016227 的引物序列为SEQIDN0:99;rs7703522 的引物序列为SEQIDN0:102; rs79472556 的引物序列为 SEQ ID NO :105。
4. 权利要求1所述的遗传标志物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5. 权利要求2所述的遗传标志物的特异性扩增引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂 盒中的应用。
6. 权利要求3所述的遗传标志物的特异性延伸引物在制备原发性肺癌辅助诊断试剂 盒中的应用。
7. -种原发性肺癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA 中 rsll31897、rsll33833、rsll5019901、rsll7855259、rsll8154190、rsl41059768、 rsl41350740、rsl42881943、rsl45529151、rsl45638335、rsl45940981、rsl50279473、 rsl50695913、 rsl51223396、 rsl85832840、 rsl88159138、 rsl88908188、 rsl90614894、 rs200170353、rs200660845、rs200847762、rs201210090、rs201308754、rs202173016、 rs34687332、 rs3733782、 rs3827760、 rs45442501、 rs6141383、 rs61737776、 rs62176112、 rs6756629、rs73016227、rs7703522 和 rs79472556。
8. 根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的特 异性扩增引物和/或权利要求3所述的特异性延伸引物。
9. 根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的 试剂。
【文档编号】C12N15/11GK104263723SQ201410469284
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】沈洪兵, 胡志斌, 靳光付, 马红霞, 戴俊程, 孙洁 申请人:南京医科大学