一对靶向绵羊SFN基因的sgRNA的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一对靶向绵羊SFN基因的sgRNA，由sgRNA-F和sgRNA-R组成；sgRNA-F和sgRNA-R分别由102个核苷酸组成，其中5’末端第2-21位的20nt的RNA片段能识别绵羊染色体上SFN基因，第22-102位的81nt的RNA片段为能与Cas9n核酸酶结合的骨架RNA片段；所述的sgRNA-F如序列表的序列2所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列4所示。本发明可通过Cas9系统在细胞或个体水平上对绵羊SFN基因进行敲除或修饰，以解析绵羊SFN基因的功能、构建绵羊SFN基因突变库,为绵羊育种服务。
【专利说明】-对靶向绵羊SFN基因的sgRNA
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体而言，涉及一对靶向识别绵羊SFN基因的 sgRNA及其应用。
【背景技术】
[0002] ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技 术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶。而CRISPR/Cas9系统对特 异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异 位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建 (CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展.江苏农业学报.李辉等，2013)。
[0003] (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫 防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong 等（Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 2013)及 Mali 等（RNA - guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013)证明 Cas9 系统 能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ)、同源重 组（HR)效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进 行革G向酶切。但是，随后的研究表明，Cas9存在较为明显的脱祀效应（High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology.Fu et al，2013 ;High_throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. Pattanayak et al，2013)。麻省理工学院Feng Zhang团队使用双切刻技术将Cas9的特异 性提高了 50倍以上（Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.Cell.Ran et al，2013)，维护了Cas9在基因打祀【技术领域】的地位。借 助于这一技术，动植物基因功能研究及育种等等都将得到迅猛的发展。
[0004] 毛羊是以产毛为主的经济动物，提高羊毛产量和质量一直是细毛羊育种者追求 的目标。分子育种技术的进步为我们掌握羊毛生长发育分子机理，了解控制羊毛生长发 育的基因，有效地开展分子标记辅助育种提供了技术支撑。近几年，围绕查找与羊毛生 长发育相关基因的研究已成为国内外细毛羊育种的热点。SFN基因也称作14-3-30，是 14-3-3基因家族的成员，它参与基本细胞功能，包括细胞周期进展、细胞凋亡、细胞增殖 和分化（Aitken A. 14-3-3 proteins:a historic overview. Semin Cancer Biol. 2006 ； 16:162 - 72 ；Morrison DK.The 14-3-3 proteins: integrators of diverse signaling cues that impact cell fate and cancer development. Trends Cell Biol. 2009 ；19:16 -23.)。SFN基因在毛囊发育中最早出现在内根鞘，伴随着毛囊发育成熟后分布于毛囊的皮 质与髓质(Nigel L. Hammond, Denis J. Headonj and Michael J. Dixon. The cell-cycle regulator protein 14-3-3 σ is essential for hair follicle integrity and epidermal homeostasis. Journal of Investigative Dermatology, 2012, 132, :1543 - 155 3) Jedina等人发现在细胞角化过程中，SFN发挥了重要作用（Medina A, Ghaffari A, Kilani RT, et al. The role of stratifin in fibroblast-keratinocyte interaction. Mol Cell Biochem, 2007, 305:255-264)。Nigel等人证明有SFN基因突变的杂合小鼠毛发有严重的毛 干缺陷，导致毛干在形态发生时期出现大的缺陷（Nigel L. Hammond, Denis J. Headon, and Michael J. Dixon. The cell-cycle regulator protein 14-3-3 σ is essential for hair follicle integrity and epidermal homeostasis. Journal of Investigative Dermato logy，2012, 132, ：1543 - 1553)。由此可见，SFN是毛用羊育种的重要候选基因。如果能在细 胞或个体水平上对绵羊SFN基因进行敲除或修饰，以解析绵羊SFN基因的功能，从而为毛用 羊育种服务，这显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一对靶向绵羊SFN基因的SgRNA。本发明利用编码这 对SgRNA部分序列的短片段DNA构建表达载体，该表达载体能够表达出这对SgRNA，这对 SgRNA能够特异性地识别绵羊SFN基因。本发明还利用这对SgRNA引导Cas9n核酸酶（即 Cas9切刻酶）对绵羊SFN基因进行准确、高效地靶向修饰。
[0006] 具体地，本发明的目的是这样实现的：
[0007] 一对靶向绵羊 SFN基因的 sgRNA，由 SgRNA-F和 SgRNA-R组成；SgRNA-F和 SgRNA-R 分别由102个核苷酸组成，其中5'末端第2-21位的20nt的RNA片段（分别命名为 sgRNA-F20和sgRNA-R20)可以识别绵羊染色体上SFN基因的特定序列，第1位的核苷酸是 转录起始信号位点，第22-102位的81nt称为骨架RNA片段。骨架RNA片段可形成发夹结构， 与Cas9n核酸酶结合，从而引导Cas9n核酸酶切割靶标DNA单链，两个单链切口导致双链断 裂（DSB)，细胞利用自身修复功能，使得靶标位点附近的序列发生变化；另外，这对SgRNA识 别的DNA靶序列呈"头对头"的排布方式（即二者的5'末端相互靠近），二者相距8bp。
[0008] 所述sgRNA-F具体可如序列表的序列2所示。
[0009] 所述SgRNA-R具体可如序列表的序列4所示。
[0010] 本发明另一个目的在于提供一对DNA分子（命名为特异DNA分子对），由编码所述 SgRNA-F的DNA分子甲和编码所述SgRNA-R的DNA分子乙组成。
[0011] 所述DNA分子甲具体如序列表的序列1所示。
[0012] 所述DNA分子乙具体如序列表的序列3所示。
[0013] 本发明第三个目的是提供上述sgRNA对在特异识别和靶向修饰绵羊SFN基因中的 应用。所述绵羊SFN基因，其基因组序列是NCBI GI为417531962的一段区域。
[0014] 本发明第四个目的是提供上述SgRNA对在构建绵羊SFN基因突变库中的应用。所 述绵羊SFN基因，其基因组序列是NCBI GI为417531962的一段区域。
[0015] 与现有技术相比，本发明提供了一对特异识别绵羊SFN基因的sgRNA，并提供了一 对该sgRNA的编码DNA片段，从而通过Cas9系统在细胞或个体水平上对绵羊SFN基因进行 敲除或修饰，以解析绵羊SFN基因的功能、构建绵羊SFN基因突变库，为绵羊育种服务。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为sgRNA靶点设计结果示意图，其中箭头处代表单链切刻位点（两个单链切 口产生一个双链断裂）。
[0017] 图2为质粒对pX335-sgRNA-F与pX335-sgRNA-R共转染绵羊SEF细胞48小时后 提取DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果（突变序列）。
【具体实施方式】
[0018] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培 养细胞。
[0019] pX335载体购自Addgene，货号42335。Bbs I内切酶购自NEB公司，货号R0539S。 DNA寡核苷酸均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0020] 实施例I、SgRNA表达质粒对的构建
[0021] UsgRNA靶点设计
[0022] 在NCBI GI:417531962的序列中提取绵羊SFN基因的编码区（如下所示），设计靶 标位点（http://crispr.mit. edu/) 〇
[0023] CTTGCACCTCCGGGCCCTTCTCTTCCGAGCTTTCTTCATTGCTCTTTTGCTCGATACTGGACAGGACCC TCCACGCCGCCCGCTGGCCACCCACCACGTTCTTGTAGGCCACTGAAAGCAGGTTGCGCTCTTCGCAGGATAGCTCC TCGCCCTTTTCCACAGCGCTCTTCATGAAAGCTGCCATGTCTTCATAGCGTTCGGCCTGCTCGGCTAACTTGGCCTT CTGGATCAGACTGGCTCTCTCCAT
[0024] 正向靶序列是ATTGCTCTTTTGCTCGATAC (38-57)、反相靶序列是 CTCGGAAGAGAAGGGCCCGG(10-29)。两个靶序列呈"头对头"的排布方式，二者相距8bp。分别 命名为正向靶标T1、反向靶标T2。靶标设计如图1所示。
[0025] 2、SgRNA表达质粒对的构建
[0026] 首先根据设计的靶序列送北京六合华大基因科技股份有限公司合成单链寡核苷 酸，具体序列如下：
[0027] Tl-F ：CACCGATTGCTCTTTTGCTCGATAC
[0028] Tl-R ：AAACGTATCGAGCAAAAGAGCAATC
[0029] T2-F ：CACCGCTCGGAAGAGAAGGGCCCGG
[0030] T2-R ：AAACCCGGGCCCTTCTCTTCCGAGC
[0031] 其中Tl-F与Tl-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经Bbs I酶切，连入pX335 载体中，获得pX335-sgRNA-F载体；T2-F与T2-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经 Bbs I酶切，连入pX335载体中，获得pX335-sgRNA-R载体。两个质粒均送上海生工生物工 程有限公司测序验证，测序引物bbsR的序列为：5'AAAGTCCCTATTGGCGTTAC 3'。
[0032] 实施例2、通过测序验证实施例1构建的SgRNA表达质粒对的生物活性
[0033] 绵羊胎儿成纤维细胞（SEF):分离培养方法参见文献：孟凡华，肖红梅，张东，周欢 敏.蒙古绵羊胎儿皮肤成纤维细胞分离培养与特性分析.《中国畜牧兽医》2012年第3期， 136-140.
[0034] 1、将重组质粒pX335-sgRNA-F与pX335-sgRNA-R各4yg通过电转化的方式共 转染IXlO 6 SEF细胞，得到重组细胞。转染的具体步骤是：使用核转仪（Amaxa，型号： AAD-1001S)及配套的哺乳动物成纤维细胞转染试剂盒（Amaxa，货号：VPI-1002)进行转染。 首先使用〇. 05%胰蛋白酶（Gibco,货号：610-5300AG)消化贴壁细胞，用胎牛血清（Gibco， 货号：16000-044)终止消化，磷酸盐缓冲液（Gibco,货号：10010-023)洗涤细胞两次，添加 转染试剂，使用程序T-016转染细胞。
[0035] 2、将步骤1得到的重组细胞37°C培养48小时，然后收集细胞。具体步骤是：首先 使用0. 05%胰蛋白酶（Gibco,货号：610-5300AG)消化贴壁细胞，用胎牛血清（Gibco,货号： 16000-044)终止消化，磷酸盐缓冲液（Gibco,货号：10010-023)洗涤细胞两次，添加200微 升细胞裂解液GA(TIANGEN公司DNA提取试剂盒DP304中的组分）。
[0036] 3、提取步骤2收集的细胞的基因组DNA并作为模板，用PCRF与PCRR组成的引物 对进行 PCR 扩增（PCRF: 5' GCTTCTTGTCGTCGCCAGTG 3' ；PCRR: 5' GAGCAGGCCGAACGCTAT 3'）， 回收385bp的PCR扩增产物。DNA提取具体步骤是：使用TIANGEN公司DNA提取试剂盒（货 号：DP304)提取DNA。在上一步所得裂解产物中添加20微升蛋白酶K溶液，混匀。加入200 微升缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的 水珠。加入200微升无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将 上述溶液加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管 中。向吸附柱CB3中加入500微升缓冲液⑶，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放回收集管中。向吸附柱CB3中加入700微升缓冲液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液， 将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500微升缓冲液PW，12000rpm离心30 秒，倒掉废液。将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟。将吸附柱CB3置于室温 放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管 中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 - 200微升洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12000rpm 离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0037] 4、将步骤3得到的PCR扩增产物与pMD18-T载体（宝生物，货号：D101A)连接，得 到连接产物。具体的连接步骤是：在微量离心管中配置下列DNA溶液：pMD18-T载体1微升， PCR产物4微升。加入5微升Solution I。16°C反应30分钟。
[0038] 5、取5微升连接产物加入50微升DH5 α感受态细胞（宝生物，D9057S)中，冰上 放置30分钟。42°C加热90秒，再在冰上放置1分钟。加入500微升SOC培养基，37°C振荡 培养60分钟。涂布于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养，随机挑取30个克 隆并进行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而估算出该对sgRNA质粒的效率。 结果发现6个克隆在预期切割位点附近出现突变（详见图2)，即重组质粒pX335-sgRNA-F 与pX335-sgRNA-R组成的质粒对在SEF细胞基因组中的切割效率达20%。
【权利要求】
1. 一对靶向绵羊 SFN 基因的 sgRNA，由 sgRNA-F 和 sgRNA-R 组成；sgRNA-F 和 sgRNA-R 分别由102个核苷酸组成，其中5'末端第2-21位的20nt的RNA片段能识别绵羊染色体上 SFN基因，第22-102位的81nt的RNA片段为能与Cas9n核酸酶结合的骨架RNA片段；所述 的sgRNA-F如序列表的序列2所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列4所示。
2. -对DNA分子，由编码权利要求1中的所述sgRNA-F的DNA分子甲和编码权利要求 1中的所述sgRNA-R的DNA分子乙组成。
3. 如权利要求2所述的一对DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子甲如序列表的序 列1所示。
4. 如权利要求2所述的一对DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子乙如序列表的序 列3所示。
5. 权利要求1所述的sgRNA在特异识别和靶向修饰绵羊SFN基因中的应用。
6. 权利要求1所述的sgRNA在构建绵羊SFN基因突变库中的应用。
【文档编号】C12N15/113GK104293786SQ201410469262
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】柳楠, 李和刚, 赵金山, 刘积凤, 刘开东, 程明, 贺建宁 申请人:青岛农业大学